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遗传学实验


遗传学实验

实验室安全守则
? 一般规定 ? 1、上课第一天请先熟悉环境,察看紧急冲洗站、洗眼站、 灭火器、急救箱及安全梯等的位置,牢记“安全”是进行 任何实验最重要的准则。 ? 2、在实验室內请穿着实验服,避免穿凉鞋、拖鞋。留有 长发者,戴帽套将头发捲入套內,或以橡皮筋束于后,以 防止引火危险或污染实验。 ? 3、在实验室内禁止吸烟、饮食、化妆、嚼口香糖、嬉戏 奔跑,食物饮料勿存放于实验室的冰箱中,实验桌上勿堆 放书包、书籍、衣服及杂物等。 ? 4、所有实验仪器、耗材、药品等均属实验室所有,不得 带出实验室。每组分配的仪器、耗材请确定清点与保管, 课程结束后如数清点缴回。公用仪器请善加爱惜使用,实 验前后,请把工作区域清理擦拭,并随时保持环境卫生。

? 5、实验前详阅实验内容,了解实验细节的 原理及操作规程,注意上课所告知的注意 事项。实验进行中有任何状况或疑问,随 时发问,切勿私自变更实验程序。打翻任 何药品试剂及器皿时,请随即清理。实验 后,确切记下自己的结果,严禁抄袭,确 定关闭不用的电源、水、酒精灯及等。 ? 6、实验完毕,请清理实验室、倒垃圾、灭 菌、关闭灯光及电源,离开实验室前记得 洗手。 ? 7、任何意外事件应立即报告师长,并应熟 知相关的应急措施。

实验目录
1、减数分裂 2、植物染色体压片法定性鉴定细胞核内脱氧核糖核酸的存在 植物染色体压片法定性鉴定细胞核内脱氧核糖核酸的存在 3、永久片的制作 4、核型分析 5、质量性状的遗传分析 6、植物数量性状遗传分析 7、蚕豆根尖细胞微核检测技术 8、植物同源多倍体的人工诱发与鉴定

实验一 、减数分裂

一 实验目的
1、了解动植物生殖细胞的形成过程; 2、熟悉减数分裂各期特点; 3、学习生殖细胞的取材和染色体制片

二 实验原理
减数分裂是一种特殊方式的细胞分裂,只发生在生殖 细胞形成的过程中。减数分裂的特点是连续进行2次核分 裂,而染色体只复制一次,从而形成4个只含单倍体数染 色体的生殖细胞,经过受精后,合子中的染色体数目又恢 复到2倍体水平,因此它是维持大多数动植物染色体数目 世代稳定传递的根本机制。另一方面,基因的分离、自由 组合以及交换也是通过减数分裂发生的,所以深入认识减 数分裂对学习遗传学规律是非常重要的。 ? 植物在花粉形成过程中,花药内的一些细胞分化成小 孢子母细胞,即花粉母细胞(2n),每个花粉母细胞进行 连续的2次细胞分裂,产生4个细胞,即具单倍体染色体数 (n)小孢子或花粉。减数分裂中染包体的行为变化与生 物的遗传变异密切相关。既然染色体是遗传物质的载体, 因此染色体在减数分裂中的行为对遗传物质的分配和重组 产生了重大影响。高等植物的性母细胞(2n)在形成雌雄 配子(n)过程中必须通过减数分裂。 ? 由于植物花药取材容易,操作和鉴定比较方便。故一 般都取用花粉母细胞作为制片材料,在光学显微镜下观察 其减数分裂过程中染色体的行为变化。
?

三、实验材料
蚕豆花蕾 在早春(每年3-4月)蚕豆现蕾后, 于上午8-10时,摘取长约lmm左右的 花蕾,投入卡诺固定液(3V95% 乙 醇:1V冰乙酸),然后转入70%乙醇 中,可保存2-3年) 注:2n=12,n=6

四、实验用具药品
? ? 1仪器用具 显微镜、酒精灯、培养皿、载玻片,盖 玻片、镊子、刀片、木夹、吸水纸、标 签纸、火柴。 2药品试剂 醋酸洋红染色液(或丙酸一水合氯醛一 铁矾一苏木精染色液)、卡诺氏固定液、 95%酒精、80%酒精、70%酒精。

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? 3 染色液的配制: ? 1%醋酸洋红染色液的配制: 将100ml 45%醋酸加热煮沸后,移去火苗, 徐徐加入1-2g洋红,待全部溶解后再煮沸1-2min, 冷却后加入2%的铁矾水溶液5-10滴,或在煮沸醋 酸洋红染色液中悬置数枚锈铁钉(防止溶液溢 出),以增强染色性能。配制的染色液过滤后贮 存于棕色试剂瓶中备用。 ? 丙酸一水合氯醛一铁矾-苏木精染色液的配制: A液:称2g苏木精溶于l00ml 50%丙酸中。 B液:称0.5—1g铁矾溶于l00ml 50%丙酸中。 将A液和B液按1:1比例混合,每50ml混合液中 加2g水合氯醛,存放一天后使用。

1、取1-3枚花药放在洁净的载玻片上,用清洁刀片压在花 药上向一端抹去,涂成薄层,然后滴1滴1%醋酸洋红染色 液(或苏木精染色液),也可在花药上滴上染色液。然后 用镊子把花药镊碎,去掉肉眼见得到的残渣,数分钟后盖 上盖玻片,包被吸水纸,用大姆指匀力压片,或用铅笔的 橡皮头垂直轻敲(加压时勿使盖片与载片滑动) 。为了 加深染色,可把载玻片平放在酒精灯火焰上来回摆动几次, 使之略作加热。 2、先在低倍镜下寻找花粉母细胞,一般花粉母细胞较大、 圆形或扁圆形,细胞核大、着色较浅。而一些形状较小, 整齐一致着色较深的细胞是药壁体细胞,一些形状处于中 间略呈扇形的细胞是从四分体脱开后的小孢子或幼小花粉 粒。如形状较大,内部较透明并具有明显外壳的细胞则是 成熟的花粉粒。观察到有一定分裂相的花粉母细胞后,用 高倍镜观察减数分裂各时期染色体的行为和特征。

减数分裂是形成性细胞时 所进行的一种细胞分裂, 染色体经过一次复制,细 胞连续两次分裂,结果形 成的子细胞的染色体数为 母细胞的一半,由2n变为 n。通过配子结合,染色 体又恢复到2n。这样保证 了有性生殖时染色体的恒 定性,从而保证了生物上 下代之间遗传物质的稳定 性和连续性,也保证了物 种的稳定性和连续性。另 一方面,由于同源染色体 分开,移向两极是随机的, 加上同源染色体的交换, 大大增加了配子的种类, 从而增加了生物的变异性, 提高了生物的适应性,为 生物的发展进化提供了物 质基础。

图 1 - 2 减 数 分 裂 模 式 图

六、实验作业
1.制作减数分裂前期I图象清晰的片子1—2张。 2.对所观察到的减数分裂各时期的图象进行绘 图,并简要描述染色体的行为和特征。

附:减数分裂各时期染色体的行为和特征
? 第一次分裂(2n → n): ? 前期Ⅰ:可分为以下五个亚时期 : ? 细线期:核内染色体呈细长线状,互相缠绕,难以辨别成双 的染色体. ? 偶线期;同源染色体相互纵向靠拢配对,称为联会。这样联 会的一对同源染色体,称为二价体。偶线期所表现的这一特 征时间很短,一般较难观察到。 ? 粗线期:配对后的染色体逐渐缩短变粗,含有两条姐妹染色 单体,这样一个二价体中就包含了四条染色单体,故又称为 四合体。在此期间各同源染色体的非姐妹染色单体间可能发 生片段交换。 ? 双线期:各对同源染色体开始分开,由于在粗线期非姐妹染 色单体之间发生了交换,因而同源染色体在一定区段间出现 交叉结。此期可清楚地观察到交叉现象。

? 终变期(浓缩期):染色体更为浓缩粗短,交叉结向二价 体的两端移动,核仁和核膜开始消失,此时各二价体分散 在核内,适于计数染色体的数目。 ? 中期Ⅰ:核仁和核膜消失,所有二价体排列在赤道板两侧, 细胞质里出现纺锤体,每个二价体的两条染色体的着丝点 分别趋向纺锤体的两极,此时最适于计数染色体的数目和 观察各染色体的形态特征。 ? 后期Ⅰ:二价体中的一对同源染色体开始分开,在纺锤体 的作用下分别向两极移动,完成染色体数目的减半过程。 此期,同源染色体的两个成员必然分离,非同源染色体间 的各个成员以同等机会随机结合,分别移向两极。注意此 时染色体的着丝点尚未分裂,每条分裂,在赤道板处形成 细胞板,成为二分体。 ? 末期Ⅰ:染色体到达细胞两极后逐渐解旋。核仁、核膜重 新出现、在赤道面形成新的细胞板,1个性母细胞分裂为2 个子细胞。每个子细胞中含有单倍的染色体(n)

? 第二次分裂(n → n) : ? 前期Ⅱ:染色体又开始明显缩短,而其包含的两条染色单 体分得很开,只是着丝点仍然没有分裂。 ? 中期Ⅱ:染色体整齐地排列在分裂细胞的赤道板上,出现 纺锤丝。 ? 后期Ⅱ:染色体的着丝点分裂为二,两条姐妹染色单体在 纺锤丝的牵引下分别移向两极。 ? 末期Ⅱ:染色体分到两极后,又重新出现核仁和核膜,同 时细胞质分隔为二,从而使一个母细胞分裂成为四个子细 胞,称为四分体或四分孢子。每个子细胞内只含有原来母 细胞的半数的染色体(n)。

实验二 、植物染色体压片法定性鉴 植物染色体压片法定 定细胞核内脱氧核糖核酸的存在
? 一、实验目的 ? 学习应用孚尔根染色法,定性鉴定细胞核 内脱氧核糖核酸(DNA)的存在. ? 掌握染色体制片方法,观察染色体动态变 化。

实验说明
? 具有自我复制能力是生命的一个基本特征。单细胞生物可 以通过细胞分裂直接复制自身,而多细胞生物从受精卵开 始,经过有丝分裂使细胞不断增殖并经过一系列复杂的分 化过程形成新一代个体。 ? 一般来说,只要能够进行细胞分裂的植物组织或是单个细 胞都可以作为观察染色体的材料。如植物的顶端分生组织 (根尖或茎尖)、居间分生组织(禾本科植物的幼茎及叶 壳)、愈伤组织和胚乳、萌发的花粉管等,在这些组织内 不断进行着细胞分裂。只要适时取材,并加以固定、离析、 染色等处理后制成染色体玻片标本,即可利用显微镜对有 丝分裂和染色体进行观察。 ? 这是细胞遗传学最基本和常用的方法,在物种亲缘关系鉴 定、染色体变异、杂种分析等工作中有着广泛的用途。

二、实验原理
? 孚尔根(Feulgen)染色法是鉴别细胞核中DNA的组 织化学方法,其原理与希夫试剂的化学性质有关。希夫试 剂是由碱性品红与亚硫酸氢钠和盐酸作用而生成的,为无 色透明的溶液,它遇醛类物质即呈紫红色,故可用于鉴定 醛基的存在。DNA分子结构中本身无醛基,但在60?C1M 盐酸的水解作用下,部分地打断DNA分子中脱氧核糖与嘌 呤间的糖苷键,使嘌呤碱基脱落,并在脱氧核糖的第一个 碳原子上释放出活性醛基,该基团遇希夫试剂即呈紫红色。 在细胞内只有DNA才具有这种反应,故可定性地鉴定细胞 核内DNA的存在。这一染色方法是Feulgen和Rossenbeck 于1924年首先发现和确定的,故称孚尔根染色法。

三、实验材料
? 洋葱(Allium cepa,2=16)的根尖

四、实验用具药品
? (一) 一 仪器用具 显微镜、恒温水浴锅、试管、载玻片、 盖玻片,镊子、刀片、吸水纸。 ? (二)药品试剂 碱性品红、亚硫酸氢钠、活性炭、1M 盐酸,45%醋酸,1%秋水仙素。

希夫试剂的配制方法:
? 将0.5g碱性品红徐徐加入煮沸的100ml 蒸馏水中,用玻璃棒搅拌,使之充分溶解, 待溶液冷却至58°C左右,过滤于棕色瓶中。 当滤液冷却至26°C时,再加入10ml的1M盐 酸和0.5g亚硫酸氢钠,摇动,溶解后密封于 棕色瓶中,置于黑暗低温处。次日检查溶 液颜色,须呈无色透明或淡茶色才可使用。 若稍呈红色可加入0.5g活性炭连续摇动,在 4°C下静置过夜,然后过滤脱色。

漂洗液的配制方法
? 将5ml1M盐酸和5ml10%亚硫酸氢钠溶液分 别倒入容量瓶中,再用蒸馏水定容至100ml。

五、实验步骤
? 1. 材料培养: 洋葱根尖:将通过休眠的洋葱鳞茎搁置在盛满 材料培养: 洋葱根尖: 清水的烧杯上,在室温下(25° 左右)发根,待根长至1 清水的烧杯上,在室温下(25°C左右)发根,待根长至1-1.5cm 进行前处理。 时,进行前处理。 ? 2. 前处理 :剪下根,用0.05%秋水仙碱浸泡2-3小时。 剪下根, 0.05%秋水仙碱浸泡 秋水仙碱浸泡2 小时。 ? 3. 固定 :将根尖用乙醇-冰乙酸(3:1)固定液固定4-24小时, 将根尖用乙醇-冰乙酸( 固定液固定4 24小时 小时, 以后转入70%乙醇中冰箱保存。 70%乙醇中冰箱保存 以后转入70%乙醇中冰箱保存。 ? 4. 酸解:( 注意酸的浓度、温度、时间与水温有反相关 系)。 酸解: 注意酸的浓度、温度、 试管1 取洋葱根尖数条水洗2 投入试管,加入数滴1M 1M盐酸 试管1:取洋葱根尖数条水洗2次,投入试管,加入数滴1M盐酸 浸没根尖, 60° 下水解10min 待幼根软化( 10min, 浸没根尖,在60°C下水解10min,待幼根软化(同时变为半透 ),取出用蒸馏水换洗2 取出用蒸馏水换洗 试管2 对照): ):另取洋葱根尖 明),取出用蒸馏水换洗2次。试管2(对照):另取洋葱根尖 数条水洗2 投入试管,加蒸馏水数滴浸没根尖, 60° 数条水洗2次,投入试管,加蒸馏水数滴浸没根尖,在60°C下处 10min,然后把蒸馏水倒去。以下各步骤两试管相同。 理10min,然后把蒸馏水倒去。以下各步骤两试管相同。 ? 5. 染色:两试管中均滴加希夫试剂,浸没根尖,立即置于暗处 染色:两试管中均滴加希夫试剂,浸没根尖, 处理0.5 1h,然后用漂洗液换洗3 0.5每次2min 2min; 处理0.5-1h,然后用漂洗液换洗3次,每次2min;再用蒸馏水换 每次2min 2min。 洗2次,每次2min。

? 6. 压片镜检:分别取上述两试管中的根尖,置于载 压片镜检:分别取上述两试管中的根尖, 玻片上, 45%醋酸,然后压片镜检。 玻片上,滴1滴45%醋酸,然后压片镜检。 ? 将根尖放在载片中央,切取根尖部分,滴上一滴滴 将根尖放在载片中央,切取根尖部分,滴上一滴滴 45%醋酸,并盖上盖玻片。酸解良好的材料, 1滴45%醋酸,并盖上盖玻片。酸解良好的材料, 只要用镊子尖轻轻地敲打盖片, 只要用镊子尖轻轻地敲打盖片,分生组织细胞就可 铺展成薄薄的一层,再用吸水纸把多余的酸液吸掉, 铺展成薄薄的一层,再用吸水纸把多余的酸液吸掉, 经显微镜镜检后,选择理想的分裂细胞, 经显微镜镜检后,选择理想的分裂细胞,再在这个 细胞附近轻轻敲打,使重叠的染色体渐渐分散, 细胞附近轻轻敲打,使重叠的染色体渐渐分散,就 能得到理想的分裂相,必须掌握以下2 能得到理想的分裂相,必须掌握以下2点: ? 1)压片材料要少,避免细胞紧贴在一起,致使细 压片材料要少,避免细胞紧贴在一起, 胞和染色体没有伸展的余地; 胞和染色体没有伸展的余地; ? 2)用镊子敲打盖片时,用力要均匀,若在压片时 用镊子敲打盖片时,用力要均匀, 不注意,使个别染色体丢失, 不注意,使个别染色体丢失,而被迫放弃一个良好 的分裂相的细胞。 的分裂相的细胞。

六、实验作业
1、分别制作经孚尔根染色和对照处理的临时片2张, 并根据镜检结果绘图。 ? 2、 比较根尖经盐酸水解处理与否所获得的结果, 并作出解释。 ? 3、将分裂中期效果好的玻片用石蜡进行临时封 片,贴上标签,低温保存。

思考题
? 1、前处理目的? ? 2、解离的目的,解离的方法有哪些?

附注: 1、根尖由于取材方便是观察植物染色体最常用的材 料。有些植物种子难以发芽,或仅有植抹而无种子, 也可以用茎尖作为材料。 植物细胞分裂周期的长短不尽相同,通常在十到几 十小时之间,温度明显地影响分裂周期,对于一个不 太熟悉的实验材料最好在特定温度下长根,掌握有丝 分裂高潮期,便得到更多的有丝分裂的细胞。 2、预处理的目的是降低细胞质的粘度,使染色体缩 短分散,防止纺锤体形成.让更多的细胞处于分裂中 期,一般在分裂高峰前,把根尖放到药剂中处理3—4 小时。可处理的药剂很多,如秋水仙素、对二氯苯、 8-羟基喹啉等。

如果实验目的仅仅是观察有丝分裂过程则无须进行预 处理,因为我们需要对有丝分裂的各个时期进行观察;但 是在进行核型分析时,则需要对染色体进行记数,同时还 要对染色体的形态作出较为详细的描述,这样就必须进行 预处理。 因为只有处在细胞分裂中期的染色体最易观察,但细 胞分裂中期持续的时间很短,一般只有10--30分钟。在正 常情况下固定的材料中,中期分裂相较少,而且即便是处 在分裂中期的细胞,由于染色体紧密排列在赤道板上,因 此在制片过程中很难将染色体分散开来,这样就不能准确 地进行染色体的记数和形态观察。 为克服这一困难,一般采用化学和物理的方法对材料 进预处理。经过预处理可以阻碍细胞分裂中纺垂体的形成, 但并不影响分裂前期细胞的正常分裂,因此使得细胞分裂 停止于中期。这样就可以得到较多的中期分裂相,同时预

? (1)预处理药物: )预处理药物: ? 秋水仙素: 易溶于冷水,乙醇,氯仿,和甲醛,但在热水中溶解度较低,不 秋水仙素: 易溶于苯与乙醚。毒性很强,在使用中注意安全。一般认为秋水仙素对纺锤 丝有麻痹和毒害作用,也认为秋水仙素通过抑制ATP的机制从而破坏纺锤丝的 形成和活动,秋水仙素水溶液的作用效果与其浓度成正比,浓度越高,作用 效果越强。预处理秋水仙素浓度范围从0.1-10.0g/L,常用浓度为0.5—2.0g/L.

对二氯苯: 对二氯苯: 无色结晶,常温下可以升华。易溶于乙醇、乙醚、苯等有机溶剂,
难溶于水,易燃而且有毒。由于其难溶于水,所以一般用它的饱和水溶液,处理 植物时只考虑处理时间的长短。作用效果与秋水仙素相似,但价格却低的多。

8-羟基喹啉: 白色结晶和粉末,溶于酒精而难溶与水。其作用机制一般认为 羟基喹啉
它首先引起细胞质粘度的改变,结果导致纺锤体的活动受阻,其主要适用于较大 染色体的植物,所用浓度范围为0.002-0.004M之间,优点是经它处理后,染色体 的缢痕区比较清晰。

α- 溴萘: 是一种无色或淡黄色的液体。易溶于乙醇和苯,微溶于水,新鲜配 溴萘:
制,适用于禾本科和水生植物的预处理。

(2) 处理方法
a 离体处理 b 非离体处理

(3)处理时间
a 根据植物染色体的大小 b 根据植物材料的大小 c 根据处理方法的不同 d 根据植物的耐药性不同 e 根据处理液浓度的高低 f 根据处理温度的高低

4)低温预处理法
低温处理也能引起染色体的缩短并可以获得较多的中期分 裂相,而且不需要任何药物,安全性高。但不同的植物所需 要的预处理温度是有差异的,例如小麦的处理温度为1-5°C, 水稻和玉米则需6-8 °C,处理时间一般在20-40h,这种处理 方法简单,但需要较长的处理时间,因此没有用化学药品处 理法得到广泛应用。

3.解离的目的是使分生组织细胞间的果胶质分解细 胞壁软化或部分分解,使细胞和染色体容易分散压平, 解离方法有酸解法和酶解法。 1)、酸解法是用盐酸水解根尖,步骤简便、容易掌握, 广泛应用于染色体计数、核型分析和染色体畸变的观 察。根尖分生组织经过酸解和压片后,都呈单细胞, 但是大部分分裂细胞的染色体还包在细胞壁中间。 2)、酶解法常用于染色体显带技术或姊妹染色单体交 换等项研究,通过解离和压片,使分生细胞的原生质 体能够从细胞壁里压出,再经过精心的压片,使染色 体周围不带有细胞质或仅有小量细胞质,致使多项制 片措施直接作用于染色体。

实验三 永久片的制作 一、实验目的
? 学习并掌握将压片法制成的效果满意的临 时片制作为永久片的操作方法。

二、实验原理
? 实验二用压片法成的染色体片,若材料染色清晰、物 象符合要求,一般可用石蜡、甘油胶冻或指甲油将盖玻片 的四周封固制成临时片,储于冰箱中可保存一周左右。但 时间过长,物象收缩,颜色变浅,难以观察鉴别。因此, 对一些效果很好的片子希望能长期保存,就必须改制为永 久片,以便进一步观察研究或用作试教片。 ? 永久片的制作程序包括脱去临时片的盖玻片、材料脱 水、透明和封片。其中材料脱水干净和透明良好是制好永 久片的关键。为此,需要用适当的脱水剂和透明剂。目前 较理想的脱水剂有正丁醇和叔丁醇,它们都能与最常用的 脱水剂乙醇混合使用,并具有良好的透明效果,且能与封 藏剂树胶混合,有利于封片,材料也不会发生收缩和硬化 等问题。

三、实验材料
? 用压片法制作的、经镜检符合要求的临时 片。

四、实验器具、药品 实验器具、
? 显微镜,冰箱;培养皿(直径12cm),刀 片,解剖针,镊子, 玻璃棒,纱布,毛笔, 吸水纸,标签。 ? 正丁醇,叔丁醇,95%乙醇,冰乙酸,二 甲苯,中性树胶。

五、方法步骤
? 1、脱盖玻片 : ? 用刀片把临时片上盖玻片周围的石蜡刮尽,用毛笔刷掉石蜡屑 后,再用镜头纸蘸二甲苯少许擦去残留的石蜡,或用乙酸除去水 溶的封藏剂。如刚制作的临时片,最好过几小时后再进行脱片。 ? 常用的脱片方法有两种:一是使用脱片液,二种是采用冰冻法。 两种方法在脱片前都需对盖玻片进行定位,以便封片时还原。 ? (1)脱片液法 把临时片翻转,盖玻片朝下,放入盛有脱盖玻片 液(1份45%乙酸+1份95%乙醇)的培养皿(编号①)中,将载 玻片的一端搁在短粗玻片上,成倾斜状,让盖玻片自然脱落。盖 玻片脱落后2~3min,分别取出盖玻片和载玻片,用吸水纸将玻 片上的溶液吸干,注意不要触动载玻片上的材料。 ? 有些染液如苏木精、Giemsa等染色的标本在脱片液中极易脱色, 可用冰冻法揭片。 ? (2)冰冻法 将镜检合格的染色体临时片放入冰箱冰冻层,冰冻 24小时,或放入-20℃的冰箱冰冻处理30min,或放入液氮处理 45~60s,用镊子或解剖刀直接揭开盖片,将有材料面朝上,晾 干(一般需时1~3d)。

? 2.脱水与透明 ? (1)乙醇脱水透明法 将晾干的载片及对应的盖片,用由 低浓度到高浓度(70%-80%-90%-100%)的梯度酒精冲 洗1~2min,或在染缸中脱水2~5min,晾干。 ? (2)正丁醇或叔丁醇脱水透明法 取三只培养皿分别编号 ②、③、④,并分别盛上脱水剂②( 2份95%乙醇+1份正 丁醇或叔丁醇)、③( 1份95%乙醇+2份正丁醇或叔丁 醇)、④( 正丁醇或叔丁醇),在其中各放一根粗短玻 棒。用镊子把①号培养皿中已脱落的盖玻片和载玻片取出, 稍干后迅速放入②号培养皿中,脱水、透明5min后取出, 再依次放入③、④号培养皿中脱水、透明,各5min左右。 晾干。 ? 注意:整个脱水透明过程中,必须保持载玻片和盖玻片原 来相对的方向和位置,同时注意操作轻巧,以免造成玻片 上材料漂失。

? 3.封片 ? 在中性树胶中加入1/5~1/4的二甲苯进行稀释, 滴一小滴稀释胶在脱水透明后的载玻片中央,将 盖玻片盖回原来位置封片。 ? 注意:覆盖盖玻片时,按定位位置水平盖下,使 之随着树胶的扩展自然下沉,切不可施加压力或 移动盖玻片。如发现封片中树胶有气泡,应让其 自然逸出或用针尖烧热后烫一下,使气泡逸出。 如树胶滴得过多而逸出盖玻片四周,待树胶凝固 后,用脱脂棉蘸二甲苯轻轻擦净逸出的树胶。 ? 封片后平放晾干,镜检,物象清晰符合要求的保 存,并贴上标签,注明标本名称、作者姓名和制 片日期。

六、实验作业
? 1.制作清洁完整的永久片1~2张。 ? 2.分析永久片制作成败的经验、教训及关 键所在。

实验四、 核型分析 一、实验目的
? 1.学习和掌握核型分析基本原理和方法。 ? 2.进一步了解染色体形态特征、在细胞分 裂中的联会形象以及染色体组、核型及染 色体数目、结构变异与生物进化的关系。

二、实验原理
? 染色体组型又称核型(karyotype),是指将动物、植物、 真菌等的某一个体或某一分类群(亚种、种、属等)的体 细胞内的整套染色体按它们相对恒定的特征排列起来的图 象。核型的模式表达称为模式组成或模式图( idiogram), 它是将一个染色体组的全部染色体按其特征画下来,再按 长短、形态等特征排列起来的图形,这是一种通过许多细 胞染色体的测量,取其平均值绘制的,理想的,模式化的 染色体组成。 ? 核型分析能明确识别各个染色体的特征,通过核型分 析可以了解不同物种、同一物种不同亚种、不同品种甚至 同一品种不同个体之间染色体结构的差异,有助于基因定 位及其它遗传分析。

三 、实验材料
? 蚕豆细胞(2n=12)或大葱细胞(2n=16 )有丝分裂中 期相染色体放大照片(1600*)

四、 步骤
1、 测量放大照片中染色体如下数据: 1)臂比=长臂(q)/短臂(p) 2) 着丝粒指数=短臂/该染色体长度*100 3)总染色体长度=该细胞单倍体染色体组全部染色体 (包 括性染色体)长度之和 ? 4) 相对长度=每一染色体长度/总染色体长度*100 ? 5)绝对长度=单一染色体测量长度(um)/放大倍数 ? ? ? ?

? 2、用剪刀沿染色体边缘剪下全部染色体,根据形 态及上述测得数据,进行同源染色体配对排列, 要求:染色体从大到小,短臂向上,长臂向下, 各染色体着丝粒排在同一直线上。有特殊标记的 染色体(如含有随体的)及性染色体可单独排列。 ? 3、 翻拍或绘图

五、作业
? ? 1、将蚕豆细胞染色体配对排列成核型图片 2、列表注明各对染色体如下数据及类型。

单位: ?m
编号 1 2 3 4 5 6 绝对长度 相对长 短臂 度 (?m) (?m) 长臂 (?m) 臂比 着丝粒 随体有 染色 指数 无 体类 型

染色体类型由臂比值确定

4-1

图4-2 染色体模式图

图4-3 染色体形态结构

图4-4 染色体的四种形态

图 4-5

正常男人的染色体核型分析

4-6

4-6

核型表示法 核型K 核型 染色体长度可分为长(L)、 和短(S)三类 染色体长度可分为长 、中(M)和短 三类。 和短 三类。 若不能明显分为三类, 若不能明显分为三类,可以按长短顺序依次为 A,B,C,D….来表示。 来表示。 来表示 着丝点( 的位置以M,m,sm,t表示。 表示。 着丝点( kinetochore)的位置以 的位置以 表示 随体(satellite)以Sat表示。 表示。 随体 以 表示 异染色质(heteochromatin)以H表示。 表示。 异染色质 以 表示 次缢痕( 次缢痕(secondary constriction)以Sc 表示 以

实验五、 质量性状的遗传分析 实验五、
? 一、实验目的 ? 通过一对与两对相对质量性状的遗传杂交 实验,分析杂种后代的性状表现,验证分 离和独立分配规律。观察分析玉米杂种后 代的胚乳性状,糊粉层及果皮颜色的表现, 了解基因互作现象。

二、实验原理
? 在减数分裂产生配子时,同源染色体上的等位基因,随着 所在染色体的分离而分离。一对相对性状受一对基因控制, 且这对基因具有显性和隐性的关系。具有相对性状的亲本 杂交,其F1产生的雌雄配子各有两种,其比例为1:1,F2 的表现型有两种,其比例为3:1。 ? 位于非同源染色体上的两对等位基因在形成配子时,每对 等位基因,既随同源染色体的分离而分离,又随非同源染 色体的重组而自由组合,形成四种基因型的配子,其比例 相等。因此,两对基因的杂合体在完全显性的条件下,其 自交子代的表现型分离比例为9:3:3:1,测交子代的表现型 分离比例为1:1:1:1。如果基因间发生互作,则随着互作方 式的不同而产生的表现型分离比例有所不同。玉米籽粒是 由果皮、胚乳和胚三部分组成,其中胚乳包括糊粉层和淀 粉层(图示)。已知控制玉米籽粒各种性状的基因,具有 下列的遗传表现。

? 果皮颜色性状有红色、棕色和无色。在基本色素基因Al存 在时,果皮颜色的表现一般是由P和Bp两对基因互作的结 果。 ? 胚乳性状有非甜粒和甜粒,非甜籽粒外形饱满,甜籽粒外 形皱缩。已知皱缩性状是受位于第6染色体上的隐性基因 su所控制。 ? 糊粉层颜色性状有紫色、红色和无色。它主要由7对基因 (花青素基因A1a1、A2a2、A3a3,糊扮粒色基因Cc、 Rr和Prpr;色素抑制基因Ii)所控制。只有当显性基因A1、 A2、A3、C、R同时存在,而抑制基因又呈隐性纯合ii时, 色素才能形成。而色素形成的类别是由Prpr决定的,当显 性基因Pr存在时,呈现为紫色,当隐性基因纯合prPr存在 时则表现为红色。当显性基因A1、A2、A3、C、R中缺少 任何一个或所有这些色素基因均为显性,但当显性抑制基 因I存在时,均表现为无色。 ? 由于控制玉米籽粒、果皮和糊粉层颜色,以及胚乳性状的 基因分别位于非同源染色体上,故这些性状的遗传表现为 独立分配和基因互作现象。

三、实验材料
? 玉米果穗: ? (有色、饱满×无色、皱缩)F1植株的自交果穗 (F2); ? [(有色、饱满×无色,皱缩)F1×无色、皱缩] 的测交果穗, ? 用于观察基因互作的不同杂交组合的果穗材料

四、实验用具
? 计算器、计数器。

五、实验步骤
(一)验证独立分配规律 ? 1.配制玉米籽粒有色,饱满×无色、皱缩的杂交 组合,并产生F1植株的自交果穗,然后观察果穗 上籽粒性状的分离现象。每一果穗的籽粒按有色、 饱满,无色、饱满,有色、皱缩,无色、皱缩四 种表现型记数。 ? 2.将上述有色、饱满×无色、皱缩的F1植株与 无色、皱缩的亲本进行测交。取F1植株上测交的 果穗,观察籽粒性状的分离现象,每一果穗的籽 粒同样按上述四种分离类型分组记数。

? (二)观察基因互作现象 基因互作现象有多种类型,现以玉米的互补 作用为例。由于A,C、R中缺少任何一个色素显 性基因,籽粒均为无色。因而将籽粒无色,基因 型分别为aaCCRR、AAccRR或AACCrr亲本间杂 交,例如aaCCRR×AAccRR产生F1为AaCcRR, 由于显性基因A和C的互补作用,其F1籽粒表现有 色。让F1植株自交产生果穗,观察果穗上F2籽粒 的分离现象,按有色和无色两种表现型记数,其 F2籽粒色的分离比例为9有色(9A_C_RR):7 无色(3aaCcRR+3AaccRR+laaccRR)。

六、实验作业
? 观察上述杂交实验的性状分离,实验观察结果按 观察上述杂交实验的性状分离, 下表填写和分析。 下表填写和分析。
项目 表现型 观察值( ) 观察值(O) 理论值( ) 理论值(E) 偏差d=( - 偏差 (O- E) ) 差方d ( 差方 2=(O -E)2 ) df=N-1 - P 玉米F 玉米 2 甜 非 甜 黄非 糯 玉米F 玉米 2籽粒 白非 糯 黄 糯 白 糯 玉米F 玉米 2籽粒 有 色 无色

图5-1 植物有性杂交

图5-2 植物有性杂交

stigma(柱头) Pistil style (花柱) ovary (子房)

实验六、植物数量性状遗传分析 实验六、 一、实验目的
1. 学习数量性状遗传试验资料整理与基本 统计参数计算方法。 统计参数计算方法。 掌握植物性状遗传率估算的原理、 方法。 2. 掌握植物性状遗传率估算的原理 、 方法 。 了解遗传率在育种实践上的应用。 3. 了解遗传率在育种实践上的应用

二、实验原理
遗传率是性状遗传方差占总方差的比率, 遗传率是性状遗传方差占总方差的比率 , 用以 度量遗传因素与环境因素对性状形成的影响程度, 度量遗传因素与环境因素对性状形成的影响程度, 是对杂种后代性状进行选择的重要指标。 是对杂种后代性状进行选择的重要指标。 植物数量遗传研究时, 植物数量遗传研究时 , 常用杂交亲本及杂种后 代各世代群体方差估算性状的遗传率, 代各世代群体方差估算性状的遗传率,并将遗传 率分为广义遗传率和狭义遗传率。 率分为广义遗传率和狭义遗传率 。 广义遗传率 指基因型方差占表现型方差的比值; (hB2)指基因型方差占表现型方差的比值;狭义遗 传率(h 指加性方差占表现型方差的比值。 传率(hN2)指加性方差占表现型方差的比值。

1. 广义遗传率(hB2) 广义遗传率(h
广义遗传率(h 的定义公式及其估算为: 广义遗传率(hB2)的定义公式及其估算为:

VG V ?V × 100% = × 100% h = ' VP VP
2 B ' P ' E

如供试材料为无性繁殖作物, 如供试材料为无性繁殖作物,由于个体 的异质杂合性的特点 , 常用营养系方差 估计环境方差, (VS0) 估计环境方差 , 以自交一代的方差 估计总方差, 其基因型方差V (VS1) 估计总方差 , 其基因型方差 VG = VS1遗传率可用下式估算: VS0,遗传率可用下式估算:

h

2 B

VS1 ? VS 0 = × 100 % VS1

2.

2) 狭义遗传率(h 狭义遗传率(hN

? F2代性状狭义遗传率(hB2)的定义公式及其估算为: 代性状狭义遗传率(h 的定义公式及其估算为:
1 ' VA × 100 % = 2 ' × 100 % VP

h

2 N

VA = VP =

2V F 2 ? V B1 + V B 2 V F2

(

)

× 100 %

三、实验材料及用具
材料: 植物( 玉米、水稻、棉花等) 1. 材料 : 植物 ( 玉米 、 水稻 、 棉花等 ) 杂交组 合六个世代同年种植的田间群体、植株( 合六个世代同年种植的田间群体、植株(器 标本或其遗传试验资料,如下表。 官)标本或其遗传试验资料,如下表。 ? 2.用具:米尺或钢卷尺等;计算器。 用具:米尺或钢卷尺等;计算器。

四、实验方法
? 1. 性状考察与数据整理 分组考察各世代田间试验群体、植株(器官)标本试 验性状,如:玉米果穗长度、株高,水稻生育期, 小麦株高,棉花纤维长度等。综合全班获得试验 资料,并可整理成次数分布资料。 ? 2. 基本参数估算 分别估算各世代各性状的基本统计参数—平均值、 方差与标准差。 ? 3. 遗传参数估算 分别估算各性状的广义遗传率、狭义遗传率。

小麦Funllo×鉴15-1六世代株高频数分布资料统计表

组限(cm) 组限

79 | 83

83 | 87

87 | 91

91 | 95

95 | 99

99 | 103

103 | 107

107 | 111

111 | 115

115 | 119

119 | 123

123 | 127

127 | 131

131 | 135

135 | 139

株 数 N

方 差 V

组中值x 组中值

81 2

85 13

89 8

93 1

97

101

105

109

113

117

121

125

129

133

137

P1(Fun110) P2(鉴15-1) 鉴 F1 F2 B1 B2

2 2 3 2 1 10 1 8 2 2 31 7 2 23 14 5 2 15 13 11 13 17 5 8 5 8 4 8

0 1 3 0 3

3 1

12

7

1 1

表26-2 水稻(矮脚南特×莲塘早)抽穗期(以6月1日为起点 26- 水稻(矮脚南特×莲塘早)抽穗期(

x

世代

株 数 (N)

平均数 (

)()d)

方 差 (V)

标准差 (S)

P1(矮) 矮 P2(莲) 莲 F1 F2 B1 B2

138 135 15 471 102 56

38.36 28.13 32.13 32.49 35.88 30.96

4.8652 5.6836 4.8380 8.9652 9.1740 5.3804

2.1645 2.3843 2.1995 2.9942 3.0289 2.3196

五、作业
1. 估算所试材料或相应遗传试验资料的性状 遗传率。 ? 2. 比较分析三个环境方差公式估算的结果 及适用范围。 ? 3. 分析亲本(自交系)、F1 、F2 以及回交世 代群体内个体间差异的来源。

实验六、植物根尖细胞微核检测技术 实验六、

一、目的
? 学习根尖细胞微核制片与检测技术,了 解该技术在诱变作用检测上的应用。

二、实验原理
? 微核(Micronucleus,MCN),也叫卫星核,是真核生物细胞 中的一种异常结构,是染色体畸变在间期细胞中的一种表 现形式。微核是各种理化因子,如辐射,化学药剂对分裂 细胞作用产生的。在细胞间期,微核呈圆形或椭圆形,游 离于主核之外,大小应在主核1/3以下。其折光率及细胞 化学反应性质与主核一样,也具有合成DNA的能力。 ? 一般认为微核是有丝分裂后期丧失着丝粒的染色体断片 产生的。这些断片或染色体在分裂过程中行动滞后,在分 裂末期不能进入主核,便形成了主核之外的核块。当子细 胞进入下一次分裂间期时,它们便浓缩成主核之外的小核, 即形成了微核。微核率的多少与和作用因子的剂量或辐射 累积效应有正相关。 ? 微核测试用于辐射损伤、辐射保护、化学诱变剂、新药 试验、食品添加剂的安全评价,以及染色体遗传疾病和癌 症前期诊

三、实验材料
大蒜根尖(新鲜的固定材料)

四、实验步骤
1 浸种催根 2 待测液对根尖的处理 3 根尖细胞的恢复培养 4 根尖的固定

5 根尖的酸水解:将固定的幼根放入青霉素瓶中,用蒸馏水浸洗2 次,除去水后加入5M HCL 将幼根泡住,放入30OC水浴中水解28 min 左右(水解时间与水温有反相关关系),待幼根软化(同时变为半 透明)即可取出,用蒸馏水 浸洗幼根2次,5min/次。 6 制片:将幼根放在擦净的载片上,用解剖针截下4mm左右的根尖 部分,捣碎,加入1-2滴改良苯酚品红染色液,染色10分钟左右, 然后加盖片,压片。 7 镜检:先在低倍镜下找出具微核的细胞,再转入高倍镜进行仔细 观察。

五、作业
绘出一个具微核的蚕豆根尖细胞图。

附微核识别标准: 附微核识别标准
1、凡是主核大小的1/3以下,并与主核分离的小核; 2、小核着色与主核相当或稍浅; 3、小核形态可为圆形,椭圆形,不规则形等。 凡符合以上3条的小核就是微核(micronucleus,MN)

7-1

微核形成机制: 微核形成机制:

7-2





↗↗



附:实验数据的处理和污染程度的划分
将微核观察记录于表上
片号 各次观察的 细胞数与微 核数 微核数/细胞 数 总计 微核千分率 (MN%o)平 均值 镜检日期 镜检者

1)各测试样品(包括对照组)微核千分率(MN‰) 的计 算为: MN‰=某测试样点(或对照)观察到的微核数/某测试样 点(或对照)观察的细胞数) MN‰ 在10‰以下的为基本污染 10‰ - 18 ‰ 区间为轻度污染 18 ‰ - 30 ‰区间为中度污染 30 ‰以上为严重污染 注:每个处理观察3个根尖,每个根尖记数1000个细胞, 统计其中含微核的细胞数然后平均,即为该处理的微核千 分率。

2)污染指数(pollution index)
污染指数(PI)=样品实测MN‰ 平均值/标准水MN‰ 平均值 PI在 0- 1.5 区间为基本无污染 1.5-2.0区间为轻度污染 2.0-3.5区间为中度污染 3.5以上为严重污染 注:1)对严重污染的水环境,监查处理时造成根尖死亡,应稀释 后再做测试; 2)如RT> 35℃,MN本底会增高,但可经污染指数数据处理,

不会影响监测结果。

实验八、 植物同源多倍体的人工诱发与鉴定 一、实验目的 ? 1. 了解人工诱发同源多倍体植物的原理,初 步掌握秋水仙碱诱发多倍体的方法。 ? 2. 观察同源多倍体植物植株(器官)形态特征 与细胞学特点,了解同源多倍体鉴定方法。 ? 3. 了解同源多倍体在生物进化与植物育种上 的意义。

二、实验原理
? 植物同源多倍性变异可能通过减数分裂与有丝分裂产生。 前者可能是自然界中多倍体形成的主要途径,而人工诱发 植物多倍体主要通过有丝分裂过程加倍获得,秋水仙碱是 最为常用而有效的处理药剂。秋水仙碱是从百合科秋水仙 属的一个种——秋水仙(Colchicum autumnala L.)的器官 和种子中提练出来的一种植物碱,化学分子式为 C22H25O6N。纺锤丝主要化学成分为蛋白质,而蛋白质分 子之间由硫氢基形成二硫键聚合。秋水仙碱能抑制硫氢基, 同时保持细胞活性,因此它能阻止蛋白质分子聚合,或使 已构成纺锤丝的蛋白质分子间发生解聚,从而阻止分裂细 胞形成纺锤丝或破坏纺锤丝。常用的有效浓度为0.011.0% ,木本植物采用的浓度相对较高,可达1.5% ,而蔬 菜或处理幼嫩材料等适用的浓度则较低,一般不超过 0.5% 。处理方法可用水溶液浸渍、涂抹或点滴植物的分 生组织,使每个复制为二的染色体不能向两极分开,同时 细胞也不能分裂成两个子细胞,每个细胞内染色体增加一 倍,形成多倍体细胞。

经加倍的细胞,如无药剂作用,仍然能进行正常的有 丝分裂,由此而产生的子细胞,一般说都是多倍性细胞。 从这种细胞分化出来的植株就是多倍体。由于同一组织的 不同细胞有丝分裂并不同步,如果已加倍的细胞在下一次 细胞分裂时再次加倍可产生更高倍数的细胞,而出现混倍 性现象。由多倍体的组织分化产生的性母细胞,经减数分 裂和受精结合仍产生多倍性后代。 ? 人工诱发的同源多倍体植物主要特征为:①器官和细 胞的增大,如气孔、花器、花粉粒、种子、果实等部分明 显增大;气孔数目减少而密度变稀;气孔内叶绿体数目增 加。②减数分裂过程中染色体联会分离不正常、分配不平 衡,配子育性降低。 ? 鉴定多倍体植株的方法有形态学鉴定和细胞学鉴定两 种。形态学鉴定是观测叶片气孔保卫细胞、花、果实、种 子的形态、花粉粒大小及育性等性状的变异进行间接鉴定。 细胞学鉴定观测根尖、茎尖分生组织或花粉母细胞的染色 体数目,直接鉴定。 ?

? 在显微镜下观测细胞或其内含物的大小时,通常需 借助于目镜测微尺和镜台测微尺。一般目镜测微尺 的刻度全长为5mm,分成50格或100格。镜台测微尺 的刻度全长1mm,分为100格,每小格长度为0.01mm。 由于使用的显微镜放大倍数不同,目镜测微尺所代 表的实际长度也不同,故使用前必须先求出目镜测 微尺和镜台测微尺两者刻度间的换算值。具体方法 是:在显微镜下把目镜中的目镜测微尺与放在载物 台上的镜台测微尺两者的刻度线对准并重合,计数 二者重合刻度线间的格数,然后按下式计算目镜测 微尺每格的实际长度(μm)。
镜台测微尺格数 × 10 目镜测微尺每格 ( ?m) = 目镜测微尺格数

? 在使用显微镜观测标本时,即移去镜台测 微尺,根据目镜测微尺量出被测物体的格 数,乘以换算值,即得实际长度(?m)。当 变换显微镜的目镜或物镜放大倍数时,须 重新计算换算值。注意不同的显微镜即使 放大倍数相同,或同一显微镜非同一次使 用,也必须分别测算其换算值。

三、实验材料
? 1. 玉米(Zea mays, 2n=20)、大麦(Hordeum vulgare,2n=14)、黑麦(Secale cereale, 2n=14)、 西瓜(Citrullus vulgaris,2n=22)、蚕豆(Vicia faba, 2n=12)、亚洲棉(Gossypium arboreum,2n=26) 等植物种子。 ? 2. 水稻(Oryza sativa, 2n=24)、大麦(H. vulgare)、 西瓜(C. vulgaris)等植物幼苗(或种子),葡萄等植 物植株或插条。 ? 3. 水稻(O. sativa)、大麦(H. vulgare)、黑麦(S. cereale)等植物二倍体和同源多倍体的种子、叶片 等植株、器官新鲜材料、标本或照片。

四、实验器具、药品 实验器具、
普通显微镜,目镜测微尺,镜台测微尺; 剪刀,镊子,刀片,解剖针,载玻片,盖 玻片;烧杯,广口瓶,培养皿,吸水纸, 恒温箱,纱布,吸水纸等。 ? 0.05%~0.1% 秋水仙碱溶液,无水乙醇, 冰乙酸,1% I-KI溶液,1mol/L盐酸;改良 苯酚品红染色液,苏木精-醋酸龙胆紫(或结 晶紫);0.1%~0.2% AgNO3等。

五、实验方法
? (一)植物根尖多倍体的诱发 ? 1.将玉米、大麦、蚕豆、黑麦、西瓜等种子洗净后用水浸 泡1~2d,然后摆放在铺有湿润滤纸(或纱布)的培养皿中 置于25℃~28℃条件下发芽,芽越壮越好。当根长到1cm 以上时取出洗净,将水吸干。 ? 2.移至0.01%~0.2% 的秋水仙素溶液中,使根部浸在药液 中,根尖朝下,25℃条件下处理直到明显膨大为止(24h左 右以至36h);另设一清水处理对照。处理过程中注意勿使 药液干涸。 ? 注:在处理洋葱、大蒜时,必须先剪去老根,然后置于盛 满水的瓶口上,待长出新的不定根后,再行处理。 ? 3.取出材料洗净,用卡诺氏液固定1h,以备镜检。 ? (二)多倍体植物的诱发(参见表8-1)

表8-1用秋水仙碱处理部分植物诱发多倍体的技术
材 料 黑 麦 小麦×黑 麦 籼稻×粳 稻 油 菜 处理部位 萌芽种子 幼 株 幼 株 幼 苗 种 苗 棉 花 幼 株 西 瓜 马铃薯 幼 苗 种 子 0.5 0.2~0.6 0.5 6h 2~7d 23~26 药剂浓度 (%) 0.1 0.05 0.05 0.5~1.0 0.5 处理时间 3~5h 4~5d 10~11d 10d 6h 23~26 温度(℃) 27 处 理 方 法 用刚张口的麦芽种子浸种。 分蘖期中掘起幼苗,洗净根部浸于药剂 中。 5~6片叶时洗净细根,在茎基用刀割一 切口,不要损伤生长点。 子叶初张时滴药液于顶芽,每天2~3次。 将种子水浸24h之后,去掉种皮催芽4d, 把种芽倒转幼根向上而嫩茎浸入药液。 将种子播于纸制营养钵中,2~3片真叶 时,将钵倒转使茎尖侵入药液。 将药液滴在幼苗生长点上。 将种子放在灭过菌的盛有秋水仙碱溶液 与2% 琼脂等量混合物的培养皿中发 芽,种子萌发后洗净并移植。 盆栽幼枝约高25cm时,去掉小叶暴露顶 芽,将秋水仙碱和入0.65% 琼脂内, 涂到芽上,保持湿润,下部副芽要去 掉。 72~96h

苹 果

幼 枝 顶 芽 萌芽种子

1.0

甜 橙

0.05~0.1

? 1.种子处理 ? (1) 取蚕豆、亚洲棉等植物种子置0.05%~0.1% 秋水仙素溶液中(20℃~25℃)浸种24h,取出种子 用自来水冲洗2~3次。 ? (2) 将种子移至放有被0.025% 秋水仙素溶液润湿 下的吸水纸的培养皿中加盖,放入20℃培养箱内 发芽,一般处理两天就可长出幼苗。对干燥种子 比浸过种的种子要多处理1天,种皮厚发芽慢的种 子应先催芽后进行处理。由于秋水仙素能阻碍根 系发育,所以对已发芽的种子应用较低的秋水仙 素溶液处理较短的时间。 ? (3) 处理后取出幼苗,用自来水缓慢冲洗以免损伤, 然后将幼苗移栽到大田或盆钵内,同时播种未经 处理的种子幼苗作为对照。

? 2.幼苗处理 ? (1) 水稻、大麦 取已有5~6片叶的水稻或大麦幼苗,洗 净根部,用刀片在分蘖处割一浅伤口,然后浸入0.05% 秋 水仙碱溶液中,在20℃~25℃条件下处理4~5d,并保持 足够的光线。处理后用水洗净幼苗进行盆栽,以便与对照 观察比较。 ? (2) 西瓜 先将二倍体西瓜种子浸种催芽,当胚根长到 1cm~1.5cm时,将胚根倒置于0.2%~0.4% 秋水仙素溶 液的培养皿中置25℃温度下浸渍20~24h,注意处理时需 要用湿滤纸将根盖好,避免失水。处理后的幼苗,经水洗 进行栽种或砂培。另外也可以采用田间处理幼苗的方法, 即当幼苗子叶展平时,每天早晚用0.25% 或0.4% 秋水仙 素溶液滴浸生长点各一次,每次1~2滴,连续处理4d,遮 阴保持湿度。以上两种方法获得四倍体西瓜,用四倍体作 母本与二倍体西瓜杂交,在四倍体植株上就结出三倍体种 子(3n=33)。为了保证所结的种子是三倍体,常用具有黑 条纹瓜皮色显性基因作为标记性状的2n品种作为父本,这 样在4n×2n的后代中,凡是长出黑条纹瓜的都是3n植株, 以区别4n株间偶然授粉产生4n西瓜。

? 3.芽处理 ? 选用葡萄植株或插条等果树的顶芽或腋芽生长点进行处理。 将芽部固定一个蘸有0.5%~0.7% 的秋水仙素棉球(最好外 罩一塑料袋防止蒸发)连续处理2~3d(也可将蘸有秋水仙 素的棉球涂抹生长点),处理后反复用清水冲洗生长点。 待进一步生长后,再进行观察和鉴定。 ? (三)多倍体鉴定 ? 1.植株形态特征的观察与鉴定 ? 观察比较水稻、大麦、黑麦等植物二倍体和同源多倍体植 株、穗、种子等标本或照片;比较鉴定二倍体和多倍体在 形态上的主要区别。

? 2.叶片气孔保卫细胞的测定 ? (1) 保卫细胞测量 仔细撕取二倍体和同源多倍体植株的 叶片下表皮,置于载玻片上,并加1~2滴1% I-KI,盖上 盖玻片。在高倍镜下用测微尺测量气孔保卫细胞的大小, 分别测量10个保卫细胞的长度和宽度,求其平均值。保卫 细胞的形态因物种而异,双子叶植物的保卫细胞多呈肾形, 单子叶植物的保卫细胞多呈哑铃形。 ? (2) 气孔密度测定 将叶片表皮制片于显微镜下检查,计 算每个视野气孔数,转换视野重复10次,求出平均值。视 野面积的计算,用目镜测微尺量出视野直径,按公式 S=πr2求视野面积,得每平方毫米叶面积的气孔数。 ? (3) 保卫细胞内叶绿体数目测定 取叶片下表皮于载玻片 上,滴加AgNO3溶液,数秒后加盖玻片,在显微镜下观 测保卫细胞内的叶绿体数目。

? 3.花粉粒鉴定 取新鲜或已固定的二倍体和同源多倍体植株花蕾或颖 花,以花粉涂抹于载玻片上,加1~2滴1% I-KI,盖上盖 玻片。镜检观察花粉粒的形态和大小是否整齐,有无畸形。 测量10~20个花粉粒直径的数值,求其平均值。 ? 4.细胞学观察与鉴定 将秋水仙碱处理和对照材料的根尖固定,按根尖压片 法(参见根尖压片法实验)进行解离、染色、制片。镜检进 行染色体数目鉴定。 ? 取二倍体和同源多倍体植株的花蕾或幼穗分别固定(或 取已固定材料),采用压片或涂抹制片(参见花粉母细胞涂 抹片制作)。镜检进行染色体计数及染色体联会配对行为 的观察。 ? 注意事项 ? 秋水仙碱属剧毒药品,具麻醉作用,操作时切勿使药 液接触皮肤和溅入眼内。

六、作业
? 1. 观察比较二倍体与多倍体在植株(器官)形态特征上 的主要区别。 ? 2. 观察比较多倍体和正常二倍体保卫细胞大小、气孔 密度、保卫细胞内叶绿体数目以及花粉粒大小等特征。 ? 3. 观察蚕豆根尖中期分裂细胞(15~20个/人),记载其 中染色体加倍及未加倍的细胞数目,综合全班(组)结 果,测算秋水仙碱诱发多倍体细胞的频率。 ? 4.绘制你所观察到的能够计数染色体数目的多倍性细 胞图象。 ? 5.秋水仙碱处理为什么会产生组织中细胞的混倍性(或 细胞嵌合)现象?由此,秋水仙碱处理应注意些什么?


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