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DGGE技术在环境微生物多样性研究中的应用_张珍妮

DO I : 10 . 13560 / j. cnki . bio tech . bul l . 1985 . 2009 . 12 . 008

生物技术通报
·技术与方法·

B I O T E C H N O L O G Y  B U L L E T I N

200 9年第 12 期

D G G E 技术在环境微生物多样性研究中的应用
张珍妮
1, 2

  吴晓芙   陈永华

1

1, 2

  石卉

1

1 2 ( 中南林业科技大学环境科学与工程研究所 , 长沙 410004; 中南林业科技大学生物环境科学与技术研究所 , 长沙 410004)

  摘  要 :  微生物是污水净化的主要作用者之一 。 采用变性梯度凝胶电泳 ( d e n a t u r i n gg r a d i e n t g e l e l e c t r o p h r e s i s ,D G G E ) 方 法培育和鉴定土壤微 生物具有可靠性强 、重复性好 、方便 快捷等 优点 , 已被 广泛应用 于环境 科学和 污染防 治研究 领域 。 综述 了基于 P C R D G G E技术的基本原理 、关键环节及其在微生物多样性研究中的应用 , 同时就其自身存在的 不足进行了 评价并提 出了解决方案 。 关键词 :  P C R D G G E  微生物  多样性

A p p l i c a t i o ni nR e s e a r c ho nMi c r o b i a l D i v e r s i t y o f E n v i r o n m e n t b yD G G ET e c h n i q u e
Z h a n gZ h e n n i  WuX i a o f u C h e nY o n g h u a  S h i H u i
1 1
1 2 ( I n s t i t u t e o f E n v i r o n m e n t S c i e n c e a n dE n g i n e e r i n g ,C e n t r a l S o u t hU n i v e r s i t y o f F o r e s t r ya n dT e c h n o l o g y ,C h a n g s h a410004; I n s t i t u t e o f

1, 2

1, 2

B i o l o g y E n v i r o n m e n t S c i e n c ea n dT e c h n o l o g y ,C e n t r a l S o u t hU n i v e r s i t yo f F o r e s t r y a n dT e c h n o l o g y ,C h a n g s h a410004)

 Mi c r o o r g a n i s mp l a y sa ni m p o r t a n t r o l ei nw a s t e w a t e r t r e a t me n t . A c c o u n t e df o r b yi t sh i g hl e v e l s o f r e l i a b i l i t ya n dr e p r o   A b s t r a c t : d u c i b i l i t ya sw e l l a si t sc o n v e n i e n c ei no p e r a t i o n , t h ed e n a t u r i n gg r a d i e n t g e l e l e c t r o p h o r e s i s ( D G G E ) h a sb e e nw i d e l yu s e df o rc u l t i v a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no f m i c r o b i a l c o m mu n i t i e s i nt h ef i e l d s o f e n v i r o n me n t a l s c i e n c e s w i t hf o c u s o np o l l u t i o nc o n t r o l . T h ep r i n c i p l eo f t h eD G G Et e c h n i q u ea n dt h ec o n c e r n e dk e yf a c t o r si ni t sa p p l i c a t i o nf o ra n a l y s i so f m i c r o b i a l c o mm u n i t i e sw e r ed e s c r i b e di nt h i sp a p e r . I nc o m p a r i s o n ,t h ep o t e n t i a l a p p l i c a t i o na r e a s o f t h eD G G Et e c h n i q u ea n di t sl i m i t a t i o n sw e r ea l s od i s c u s s e d .  P C R D G G E  Mi c r o o r g a n i s m D i v e r s i t y K e yw o r d s :

环境中微生物的种类和数量是及其丰富的 , 微生 物能把有机质作为营养源转化为组成物质和能量 , 它 [ 1, 2] 们在污染物的吸附和降解起着核心作用 。 所以在 分析环境样品时 , 了解微生物的群落结构 , 对鉴定和 分离处理系统中的优势菌很重要 。 自 1985 年 P a c e [ 3] 等 利用核酸测序方法来研究微生物的进化问题以 来 , 分子生物学技术逐渐被引入到微生物多样性研究 中 。 1993 年 M u y z e r 等
[ 4]

微生物多样性丢失 , 种群构成发生变化等弊病 , 能够 更直 接 、可 靠 地反 映 出 微 生物 的 原 始 组 成情 况 。 M u y z e r 研究表明占整个群落细菌数量约 1% 或以上 的类群就能够通过 D G G E 监测到 , 而传统方法只能分 离出占环境微生物总数 0. 1% ~ 10% 的微生物 。 因此 , 综述了 D G G E 的 基本原理 与关键环 节 、 及其在微生物多样性研究中的应用 , 同时就其自身 存在的缺点进行了评价并提出了解决方案 。
[ 4]

最初将变性梯度凝 胶电泳

D G G E 技术引入微生物生态研究 , D G G E 技术是一种 D N A 指纹技术 , 是多态性分析技术的一种 , 可分辨出 相同长度但序列不同的 D N A 片段 。 这种方法可以有 效地避免在传统富集 、 培养 、 分离 、 研究过程中造成的

1 D G GE 技术的原理
D G G E 技术是使用具有化学变性剂梯度的聚丙 烯酰胺凝胶对 D N A 进行电泳 , 该凝胶电泳时能够有 区别地解链 P C R 扩增产物 。 在进行变性梯度凝胶

收稿日期 : 2009-0720 基金项目 : 国家 水体污 染控 制与 治理 科技重 大专 项 ( 2008Z X 07212-001) , 国家 科技 部国 际合 作项目 ( 2007D F A 91420) , 湖 南省 博士 后基 金 ( 2008R S 4027) , 中南林业科技大学校青年基金重点项目 ( 2008001A ) , 中南林业科技大学生物环境科学与技术研究所开放基金 , 湖南省 环境科学学科建设项目 ( 2006180) 作者简介 : 张珍妮 ( 1985) , 女 , 在读硕士 , 研究方向 : 环境生物学 ; E m a i l : z h a n g z h e n n i2003@ 163. c o m 通讯作者 : 吴晓芙 ( 1953) , 男 , 教授 , 研究方向 : 水土污染控制 ; E m a i l : w u x i a o f u 530911@v i p . 163. c o m

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张珍妮等 : D G G E 技术在环境微生物多样性研究中的应用

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电泳时 , 长度相同而在碱基序列上存在差异的 D N A 双链的解链需要不同 的变性剂浓度 。 序列不同的 D N A 片段就会在各自想用的变性剂浓度下变性 , 发 生空间构型的变化 。 起初双链 D N A 以现状向正极 移动 , 随着变性剂浓度的增加 , D N A 中具有低 G+ C 含量的序列的部分被打开 , 而高 G+C 含量的部分 仍保持双链 。 D N A 双链一旦解链 , D N A 分子形成端 部的叉状或中间的环节 ( 即 D N A部分熔化 ) 。 其在 聚丙烯酰胺凝胶中的电泳速度将会急剧下降 , 以至 停留在其相应的不同变性剂梯度位置 , 染色后可以 在凝胶上呈现为分开的条带 。 如此使能将具有相同 长度而序列有差异的 D N A 分子分离开 ( 图 1) 。

2 D G GE 技术的关键环节和优化
2. 1 提取 D N A 的方法的比较 样品群 落总 D N A的 提取 是 D G G E 研 究微 生 物群落的基础 。 人工湿地样品中 细菌种类复杂 且 混杂有大量有毒物质 、腐殖质
[ 5]

, 如何使所有 细胞

裂解 、充分释放 D N A 、 有效去除杂质 , 建立高效 、可 靠的 D N A 提取方法成为研究者关注的热点 。 从土 [ 6] 壤中提取 D N A 的方法可以 分为两类 , 一类是 直 接提取 法 , 在 土壤 中 直接 裂 解 微生 物 体 , 再 提 取 D N A 。 另一类是间 接提 取法 , 先 将微 生 物菌 体 [ 8] 与土壤 颗粒 分 开 , 再提 取 D N A , 其 优 缺点 见 表 1。 采用直接提 取法的 较多 , 包括 3 种 方法 , 且 样 品总 D N A 提取质量的高 低多以获得量 大 、能用 于 后续分子操作和尽可能地 包含样品中所有微生 物 类群的遗传信息为指标 。 D N A提取过程中一 般用 乙醇 、异丙醇 和聚 乙二醇 ( P E G ) 等 有机溶 剂沉 淀 D N A 分子 , 这些有机溶剂对样 品的 D N A 均有 一定 的优先选择性 。 P o r t e o u s 等 认为 异丙 醇沉淀 核 [ 13] 酸量较高 , 且腐殖酸污 染较少 。 M i l l e r 认为 S D S
[ 12] [ 7]

图 1 D GGE研究微生物多 样性的一般步骤

结合 氯 仿 或 苯 酚 进 行 玻 璃 研 磨 可 以 优 化 D N A 提取量 。

表 1 土壤微生物 D NA提取方法的比 较
类型 原理 方法 S D S 高盐 将 样 品 直接 悬 浮在 直接 提取法 裂解缓冲 液中处理 , 使其释 放 D N A ,继 而抽提纯化 C T A B S D S 法 先 将 微 生物 菌 体与 土壤颗粒 分开 , 再提 取 D N A B l e n d i n g 法 [ 16 ] N y c o d e n z 法 [ 15 ] S D S 酚氯仿抽提法 提取法 [ 11 ] 优缺点 S D S 高盐提取 D N A得率较高 ; S D S 酚氯仿抽提 D N A 得率较低 , 且会造成 D N A 的 剪切 [ 9] S D S 法 提取 的 D N A 中 含 有 较 多 腐 殖 酸等 杂 质 , 要经 过 纯 化 才 能 用 于 后 续 研究 [ 10 ] D N A 纯度较高 , 片段完整 , 可以直接用于后续一般的操作 [ 10] 间接提取法的 D N A 得率明显低于 直接提取法 , N y c o d e n z 介质密度梯度离心可得 到相对干净的菌泥 , 且细胞分离效率较 高 , 可达 20% ~ 50% [ 14 ] , 但其价 格昂贵 , 操作复杂 ; 而 B l e n d i n g 法操作简单快速 , 成本低 , 但分 离出的 菌泥中 含有非 细胞 物质和土壤污染物

间接 提取法

2. 2 P C R 的扩增及其偏差和优化 P C R 扩增是 P C R D G G E 技术中至关重要的步 骤之一 。 通常采用 16Sr D N A 中的保守区作为引物 进行 P C R 反应 。 这是由于 16Sr D N A 具有以下几个 特点 : ( 1) 16Sr D N A 约为 1 540个核苷酸长 , 序列长 [ 17] 短适中 , 适合用作分类学 上的研究 ; ( 2) 原核生 物体都具有 16Sr D N A ; ( 3) 16Sr D N A 非常保守 , 不

会在不同的个体间进行基因交换 , 各物种具自己的 独特序列 ; ( 4) 目前已有相当完备的 16Sr D N A 基因 资料 库 , 经 过 G e n B a n k 和 R i b o s o m a l D a t a b a s e P r o j e c t ( R D P ) 基因资料库作对比分析 , 并可进行亲 源关系分析 、 鉴定等 。 目前被广泛被广泛使用的细 菌 16Sr D N A通用引物 是 338f /518r ( V 3区) 、 341f / 926r ( V 3~ V 5区 ) 和 968f /1401r ( V 6 ~V 8区 ) 。Y u
[ 18, 19]

50
[ 20]

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2009年第 12 期

等 认为扩增 V 3 区及 V 3~V 5 区的引物为最佳引 物选择 , V 3区的 P C R D G G E 条带数最多 、 分离效果最 好 。 如果需要较长的扩增产物 , 则选择 V 3~ V 5区 。 P C R 技术主要由高温变性 、 低温退火和适温延 伸 3 个步骤反复的循环构成 , 是在一种特异耐热酶 T a q D N A 聚合酶的催化下完成的由 D N A 聚合酶催 化反应 。 总结不同的 P C R 扩增反应体系
[ 21, 22]

要低于样品解链区域的 T m值 。 土壤样品相对而言 比较复杂多样 , 其解链温度通常选择在 60 ℃ 左右进 行优化
[ 25]

。 电泳时间取决于样品的片段大小 、 凝胶

浓度 、 变性剂梯度和电泳时的电压等因素 , 一个条件 的改变都可能引起电泳时间的不同 , 可以用时间进 程法优化出最佳电泳时间 。 M u y e r 和 S m a l l a 建议利用时间进程试验确定 最佳的电泳时间 。 具体方法是将待测样品以恒定的 时间间隔在同一块凝胶上电泳 , 以获得样品最大分 [ 23] 辨率的时间为最佳电泳时间 。 在 S i g l e r 的研究中 发现 , 较长时间的电泳会改变 D G G E 胶中变性剂梯 度 , 导致电泳图谱的变化 , 3 个不同的样品 , 同样在 电压 1 000 V 的体系下进行电泳分离 , 随着电泳时 间的减少 , 分离的效果变好 。 为了更好的显示 D G G E 条带 , 可以选择不同的 染色方式 ( E B 、S Y B RG r e e nI 和银染 ) 。 其中 , S Y B R G r e e nⅠ 染色的优点是背景色低 , 可以观察到尽可 能多的条带 ; 银染的灵敏度最高 , 但银染过后的条带 [ 27] 不能用于杂交分析 。
[ 26]

, 然后

根据土壤微生物总 D N A的特性 , 依据常规的 P C R 反应体系 , 试验不同的反 应程序 , 得 出效果较好的 P C R 条带 。 其反应程序如下 : 94℃ 1 m i n ; 50℃ 1m i n 和 72℃ 1 m i n , 共 33 个循环 , 然后 72℃ 5 m i n 为最后 的延伸阶段 。 对基本组成以外的其它变化再进行描 述: 在 90 ~ 96℃内每间隔 2℃设系列变形温度 , 结果 表明 , 90℃ 无区带 , 最适变性温度为 94℃。 在 40 ~ 60 ℃ 内 , 每隔 5 ℃ 设系列退火温度 。 结果表明 , 最适 温度为 45℃ 和 50 ℃。 当其它扩增条件确定后 , 设扩 增的循环次数分别 为 25、 30、 35 和 40 个 。 结果表 明 , 以 35 个循环的产物较为理想 。 从研究的结果可 看出 , 任何试验条件偏离最佳试验条件将导致扩增 无产物 或 非 特 异 性 产 物 , 将 影 响 P C R试 验的 可 靠性 。 2. 3  最佳电泳条件的选择 电泳条件的选择在整个分析过程中具有至关重 要的作用 , 电泳条件的优劣直接关系到条带分离的 好坏 , 影响后续分析工作 。 D G G E 电泳条件不同 , 即 使是相同的样品所得的图谱也会有差异 。 D G G E 电泳条件选择包括变性剂梯度 、 电泳温度和时间 、 显 影的效果的确定 。 理论认为 , 只要选择的电泳条件 足够精 细 , 有 1 个碱 基差异的 D N A片段都可被分 开。D G G E 电泳条件一般通过经验数据或反复试验 来确定 。 通常根据基因片段的大小来确定聚丙烯酰胺凝 胶浓度 , 当片段大小在 200 b p 左右时 , 一般采用 8% 的凝胶 。 变性剂 的梯度范围要根 据垂直 D G G E 试 验来确定 , 垂直试验曲线斜率较大的部分代表解链 区域的 T m ( 解链温度 ) 值 , 此时低温解链区的不同 分子达到最佳分离状态 。 通常选择水平胶的的 变性剂梯度范围为 30%( 相当于 T m范 围 10℃左 右) , 对于不同的样品还需要进行调 整 。 对大多数 D N A 片段 50 ~ 65℃是比较适合的 , 通常电泳的温度
[ 24] [ 23]

3 D G GE 在环境治理中的应用
3. 1 D G G E 技术在废水生物处理研究中的应用 刘新 春等
[ 28]

应用 P C R D G G E 方法 , 对在 相同

的操作条件下分别用低温菌和常温菌接种的两套活 性污泥系统中的微生物群落结构的动态变化进行了 追踪 。 由于工艺相同 , 使得接种的低温菌和常温菌 群在相同的操作条件下 , 产生了相似的微生物群落 结构 。 随着运行时间的增加 , 其菌群结构相似程度 也越来越高 , 说明环境的变化是决定微生物群落结 构的关键因子 。 赵兴青等 采用 P C R D G G E 分子 指纹图谱技术比较南京玄武湖 、莫愁湖和太湖不同 位置的表层沉积物微生物群落结构 , 研究结果表明 , 三湖泊沉积物微生物的 16 S r D N A 的 P C R 扩增结果 约为 626 b p , 为 16Sr D N AV 3~ V 5 区特异性片 段 。 三湖泊除具有特征性的微生物种属外 , 还分布约 5 个相同的细菌种群 。 赵继红等 用 P C R D G G E 技 术分析啤酒废水处理系统的微生物区系 , 对 S B R 池 活性污泥细菌多样性进行比较 , 得出 S B R 池不同深 度和不同曝气量的微生物种群结构完全一致 , 不同 处理时段和不同时间的微生物种群结构一致 , 但优 势菌群不同 。 说明水解酸化池的活性污泥微生物多
[ 30] [ 29]

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张珍妮等 : D G G E 技术在环境微生物多样性研究中的应用

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样性受深度的影响变化较大 , 在结构组成和种群数 [ 31] 量上均有较大的差异 。 吴卿等 应用 P C R D G G E 研究饮用水中微生物的多样性 , 得出不同取样点饮 用水样品中虽然存在特异菌 , 但各取样点水样中的 优势菌相同 。 从这些研究中可以看出菌群结构主要 是由环境条件决定 , 一般在相同的废水中采用不同 的处 理 , 微 生物 种 群结 构 一般 一 致 , 但优 势 菌群 不同 。 3. 2 D G G E 技术在土壤微生物研究中的应用 罗海峰等 采用 P C R D G G E 技术分析农田土 壤微生物多样性 , 得出了 D G G E 能够对土壤样品中 的不同微生物的 16 Sr R N A 基因的 V 3 区的 D N A 扩 增片段进行分离 , 为这些 D N A 片段的定性和鉴定提 [ 33] 供了条件 。 林曦等 进行了南极中山站排污口土 壤中微生物群落的 D G G E 分析 , 针对 16Sr D N A 基 因中 V 3 保守区域进行比较 分析 , 结果发现中山站 排污口样品中的微生物组成表现出与周围环境不同 的特征 。 滕应等
[ 34] [ 32]

微生物膜的逐渐成熟和微生物群落的稳定 , 生物膜 上微生物多样性呈高于水体微生物多样性的态势 。 肖勇等
[ 39]

利用 P C R D G G E 研究处理垃圾渗滤液序

批式生物膜反应器 ( S B B R ) 中的细菌多样性 。 结果 表明该驯化后的 S B B R 生物膜和渗滤液原水中都有 比较丰富的细菌多样性 , 渗滤液中存在着丰富的厌 氧细菌 , 为生物膜驯化提供了丰富的脱氮功能菌种 , 驯化的生物膜中同时存在好氧反硝化细菌 、厌氧氨 氧化细菌 、 大量的硝化细菌和反硝化细菌 。

4 D G GE 技术的展望
D G G E 其自身也存在一些缺点 : ( 1) 只能分离较 小的片段 (< 500 b p ) , 对于大片段的分离效率下降 。 因此 , 给引物 设计和系统发育 分析带来一定困 难 。 ( 2) D G G E 图谱中单一的条带并不总是代表单一的 菌株 , 或是在不同的泳道中移动到同一位置的条带 [ 40] 可能由不同的细菌组成 。 S e h i g u c h i 等 在试验中 发现 D G G E 图谱中的单一条带不能被测序 , 对带中 D N A 进行克隆和基因文库研究发现 , 此条带中包含 多条不同的 D N A 序列 。 ( 3) D G G E 通常显示群落中 优势种类的 r D N A片段 , 只有占整个群落细菌数量 约 l %或以上的类群能够通过 D G G E 检测到 。 V a l l a e y s 发现 D G G E 并不能分离样品中所有的 D N A 片段 。 ( 4) 由于某些种类的 16Sr D N A不同拷贝之 间的多态性问题 , 可能导致自然群落中细菌数量的 过多估计
[ 42] [ 41]

用 P C R D G G E 技术分析了重金

属污染农田土壤细菌群落的多样性 , 反映了重金属 复合污染影响到农田土壤生态系统的细菌丰富度 , 改变土壤环境的优势菌群 , 使农田土壤微生物群落 结构多 样性发 生变化 。 M u l l e r 等 用 P C R D G G E 方法研究了 H g 污染对土壤 微生物群落 , 特别是细 菌群落结构的影响 。 结果反映了 H g 污染改变了细 菌群落结构以及降低了其多样性 , 同时耐 H g 速生 细菌明显变多 , 证明了多样性的减少会降低生态系 统稳定性 , 甚至导致生态系统机能的衰退 。 3. 3 D G G E 技术在膜生物处理研究中的应用 孙宝盛等 应用 P C R D G G E 技术解析膜生物 反应器中微生物群落多样性 , 指出不同的膜生物反 应器在长期稳定运行后形成了各自特定的生态群落 结构 , 既有共同的优势种群也有各自特有的种群 , 相 同的微生物种群在不同反应器中的优势地位不同 , 各自特有的微生物群落则是由于水质的不同经过长 期演替而来 。 苏俊峰等 利用 P C R D G G E 技术初 步分析了生物陶粒反应器细菌的种群演替情况 , 结 果表明群落结构和优势种群的数量 具有时序动态 性 , 微生物多样性与废水的处理效果出现协同变化 的特征 。 蒋建文等
[ 38] [ 37] [ 36] [ 35]

。( 5) D G G E 技术对微生物的分类鉴定

依赖于基因数据库 , 若数据库中基因序列信息不够 丰富 , 将会限制 D G G E 的使用 。 D G G E 技术作为一项新兴的研究手段 和工具 , 还需要加强和改进以下几个方面 : ( 1) 需要摸索适 合具体样品的 D N A 提取方法和最佳 P C R 条件 ; ( 2) 优化 D G G E 条 件和仔细 分析具体 结果 。 ( 3) 加强 [ 37] D G G E 技术与其它技术的联用 。 有研究中发现 , 同一种样品采用不同的方法分析 , 传统方法能够检 测到的细菌 , 在分子方法中却不能被发现 , 这可能是 在 P C R 过程中 该菌未被扩增 的缘故 。 D G G E 方法 可以采用双梯度 D G G E /T G G E , 如联合使用一个丙 烯酰胺梯度或温度梯度以达到更好的分辨率 ; 利用 末端标记的荧光 P C R 产物 、附加荧光内泳道标准化 检测稀少群落组成和精确的样品对样品比较 。 使用 功能型基因作为分子标记也能区别关系相近但生态

采用 P C R D G G E 技术比较了

生物膜和水体微生物多样性的差异 。 结果表明随着

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生物技术通报 B i o t e c h n o l o g y  B u l l e t i n
2003, 44( 2) : 153 ~ 163.

2009年第 12 期

差异的种群 ; D G G E 与克隆文库等技术结合 , 可克服 局限性 , 充分发挥分离的优势 。 目前的发展趋势是 P C R D G G E /T G G E 与其他分子技术以及微生物学 、 地球化学方法联合使用 , 这样可以减少不同技术的 弊端与局限性 , 综合各种技术的优势 , 从而更真实地 揭示环境微生物群落结构和功能的本质 。 ( 4) 进一 步丰富基因数据库 , 建立更加完善的基因序列信息 , 为 D G G E 技术 对微生物的分类鉴定 提供更好的信 息平台 。
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