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蛋白质纯化技术(上)


A Brief View of Protein Purification>>>

A Brief View of

Protein Purification

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概 述
蛋白质的分离纯化是研究蛋白质结构、化学组成 和生物功能的基础。蛋白质在自然界中存在于复杂 的混合体系中,而且许多重要的蛋白质在细胞中的 含量极低。 要把蛋白质从复杂的体系中分离出来, 同时又要防止其组成、结构的改变和生物活性的丧 失,显然是有相当难度的。

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概 述
原材料的获取

预处理

细胞破碎 研磨 超声 渗透压 酶 ……

蛋白溶解 酸、碱 醇 去垢剂 尿素 ……

粗提 沉淀 相分离 分子筛 ……

精提 各种色谱 电泳分离 差速离心 ……

保存 浓缩 保存状态 保存条件 保存期限 ……

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原材料的获取

动物 培养物

植物

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预处理

材料的收集
过滤 离心

颗粒化处理
剪切 研磨

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预处理
离心
离心是利用离心力,分离液 体与固体颗粒或液体与液体 的混合物中各组分的方法。

A 19th century hand cranked laboratory centrifuge.

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预处理
粒子在离心场中的运动速度:

d 2 u= ( ρ s ρ )ω r 18
2
Fr≤3500 常速离心

2

离心加速度:

a = rω

离心分离因数:

rω Fr = g

2
Fr=3500~50000 高速离心

Fr>50000 超速离心

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预处理
rpm与g的换算

RCF =

rω = g
2

r(

2πN 2 ) 60 = 1.118 ×10 5 r N g

(r,旋转半径,cm; N,转速,rpm)

沉降系数

每单位离心场的速度

S =

u rω
2

v t= a

1S=10-13s

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细胞破碎
机械方法 搅拌、振动 研磨 压滤 超声 匀浆 非机械方法 干燥 渗透压 冻融 酶

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细胞破碎
超声破碎 频率高于20000HZ的声波称为“超声波”。 超声破碎的原理——空化作用 —— 当超声波在液体中传播时,由于液体微粒的剧烈振动,会在 液体内部产生小空洞。这些小空洞迅速胀大和闭合,会使液体微 粒之间发生猛烈的撞击作用,从而产生几千到上万个大气压的压 强。微粒间这种剧烈的相互作用,会使液体的温度骤然升高,起 到了很好的搅拌作用,从而使两种不相溶的液体(如水和油)发 生乳化,并且加速溶质的溶解,加速化学反应。这种由超声波作 用在液体中所引起的各种效应称为超声波的空化作用。

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细胞破碎
超声破碎 影响超声破碎的因素
-超声波强度 对于一般液体超声波强度增加时,空化强度增大,但达到一定值后,空化 超声波强度: 超声波强度
趋于饱和。

-超声波振幅 振幅越大,效率越高。 超声波振幅: 超声波振幅 -超声波频率:频率越低,在液体中产生空化越容易 。 超声波频率: 超声波频率 -液体的表面张力与黏滞系数:液体的表面张力越大,越不易于产生空化 ,黏滞系数 液体的表面张力与黏滞系数: 液体的表面张力与黏滞系数
大的液体难以产生空化泡 。

-液体的温度:液体温度越高,对空化的产生越有利,但是温度过高时,气泡中蒸汽压增 液体的温度: 液体的温度
大,因此气泡闭合时增强了缓冲作用而使空化减弱。 -探头的材料与形状 功率恒定时,探头的振幅与面积成反比。钛是最好的探头材料。 探头的材料与形状

-处理量 大体积的处理对象需要更大的功率。 处理量

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细胞破碎
超声破碎

利用超声波进行细胞破碎时,体系中会产生自由基,它 可能破坏蛋白的结构,因此进行超声破碎之前,需可以 添加自由基清除剂,如还原型的GSH,也可以用氢气预 吹细胞悬浮液来缓和。

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细胞破碎
渗透压

溶液渗透压,简单的说,是指溶液中 溶质微粒对水的吸引力。溶液渗透压的大小 取决于单位体积溶液中溶质微粒的数目:溶 质微粒越多,即溶液浓度越高,对水的吸引 力越大,溶液渗透压越高;反过来,溶质微 粒越少,渗透压就低。渗透压与无机盐、蛋 白质的含量有关。在组成细胞外液的各种无 机盐离子中,含量上占有明显优势的是Na+ 和Cl-,细胞外液渗透压的90%以上来源于 Na+和Cl-。

Na+ Cl-

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细胞破碎
渗透压

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细胞破碎
渗透压

直接低渗溶液处理 有机溶剂 (Benzene 、Methylbenzene ) 抗生素(Penicillin ) 化学渗透 表面活性剂 (Triton) 金属螯合剂 (EDTA) 变性剂(Urea) 改变细胞壁或者 细胞膜通透性

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细胞破碎
酶破碎法

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蛋白的溶解

为了方便提取与分离目的蛋白,通常需 要把所有的蛋白(目的蛋白和杂蛋白)都 溶解在同一体系中,然后再根据它们在液 相中的不同性质而将它们进行分离与纯化。

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蛋白的溶解
清蛋白
可溶于稀盐、稀酸、稀碱。 可被饱和硫酸铵沉淀。 eg:白蛋白,卵清蛋白

组蛋白
溶于水和稀酸,但可被稀氨水 沉淀,分子中含His、Lys多。 eg:小牛胸腺组蛋白

球蛋白
不溶于水但溶于稀盐,可以被 半饱和的硫酸铵沉淀。 eg: IgG,肌球蛋白

鱼精蛋白
溶于水及稀酸,不溶于氨水, 分子呈碱性。 eg:鲑精蛋白

谷蛋白
不溶于水、醇和中性盐溶液, 但溶于稀酸或稀碱。 eg:米谷蛋白

硬蛋白
不溶于水、稀酸、稀碱、盐。 有较强机械强度。 eg:角蛋白,胶原

谷醇溶蛋白
不溶于水及无水乙醇,但溶于 70-80%乙醇中。非极性侧链多 eg:小麦醇溶蛋白

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蛋白的溶解
面对的问题

杂质的去除 蛋白的稳定 溶解体系与条件

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蛋白的溶解
杂质的去除

脂类:离心:吸去浮在表面的脂类;
SiO2:待蛋白全部溶解完后吸附,再离心除去。 石油醚:比较适合固态蛋白中脂杂质的去除。

核酸:核酸酶:将核酸直接分解为核苷酸。
链霉素:与DNA结合形成沉淀。 硫酸鱼精蛋白:带正电,可与DNA结合,主要用于生产疫苗中除去 NDA,也用于蛋白纯化中除去DNA,尤其是纯化DNA结合蛋白。 MnCl2:可与核酸一起形成核酸锰,但可以加强DNA与组蛋白结合。

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蛋白的溶解
金属离子螯合剂 EDTA,EGTA, 塔罗肽(马组链霉菌)

蛋白的稳定

天冬氨酸蛋白酶抑制剂 碘乙酸,PMSF, Pepstatin,云芝发酵物

苏氨酸蛋白酶抑制剂

Unknown

蛋白酶

巯基蛋白酶抑制剂 PMSF,TLCK, N-乙基顺丁烯二酰亚胺 TPCK,Antipain-HCL

丝氨酸蛋白酶抑制剂 PMSF,AEBSF-HCl Aprotinin,Chymostatin Leupeptin

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蛋白的溶解
溶解体系与条件 >>>离子条件

不同蛋白溶解所需要的离子条件是不相同的,一般根据需 要选择合适的离子种类及浓度。大部分水溶性蛋白均可溶在 0.02~0.05M 磷酸盐缓冲液或碳酸盐缓冲液,也可溶 于0.15M NaCl溶液中。但是少数蛋白溶解对离子浓度依赖性比较强,这 些性质也可以用来作为粗提的理论依据。如肌球蛋白在0.6M KCl中溶解度最大,偏离这一浓度则溶解度下降,利用这一性质 可将其与其它蛋白分开。胶原蛋白多在1M NaCl溶液中有较大 溶解度,NaCl浓度大于2.4M时,立即形成沉淀。

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蛋白的溶解
溶解体系与条件 >>>体系的兼容

在选择溶解体系时,要充分地考虑到所采用的离子之间是否兼容,离子的种类以及离子浓 度是否和体系后来要加入的物质兼容。常见不兼容体系可考虑以下因素: 1、二价及以上阳离子在碱性体系中不能稳定存在,尤其是Fe2+、Mn2+、Ni2+等过渡金属离子。 2、如果体系中严格不能有二价离子影响,则调pH时不能选用KOH、NaOH。可用Tris。 3、磷酸盐、碳酸盐可以与二价及以上金属离子形成沉淀。 4、Tris、EDTA可以与二价金属离子形成络合物。柠檬酸盐可以与蛋白质形成金属复合物。 5、有的酶需要金属离子存在才能有活性,有些酶则在特定金属离子存在下完全失活。 6、有些特殊的离子需要用特殊的螯合剂才能络合,如邻二氮杂菲可以用来螯合Zn2+。 7、一些离子存在与去垢剂不兼容的情况,长链脂肪酸与二价阳离子可形成沉淀,如脱氧胆酸钠 在Ca2+、Mg2+溶液中就不能溶解,但其牛磺酸衍生物不会与二价阳离子形成沉淀。 8、当pH>8时,钠离子的存在会使脱氧胆酸钠CMC值变小。 9、Hepes等具有哌嗪基的试剂在溶液中会形成自由基,会干扰氧化还原缓冲体系。 10、有些离子或去垢剂会对蛋白质定量实验产生较大干扰,如Triton X-100在280nm处有吸收峰, Hepes会干扰Lowry法定量,大部分去垢剂都会干扰Bradford测定。

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蛋白的溶解
溶解体系与条件 >>>pH条件

选择一个合适的pH条件对溶解蛋白是十分重要的,选 择pH时需要考虑的因素有:体系的兼容性、蛋白的溶解性、 蛋白的稳定性。 原则上讲,对于酸性蛋白,应该选择pH较高的体系去 溶解;反之,对于碱性蛋白,应该选择pH较低的体系去溶 解。 但是过酸或过碱都会造成蛋白质的水解或都活性的丧 失。

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蛋白的溶解
溶解体系与条件 >>>温度条件

蛋白质在水中的溶解很大程度上取决于其本身的疏水性, 一般来说,温度越高,蛋白质的疏水性就升高。因此,大多 情况下优先考虑低温环境去溶解蛋白。另外,为了减小体系 中蛋白酶对目的蛋白的降解作用,最好也用低温。 但是有些 特殊的蛋白,对热稳定性非常好,此时如果采用高温溶解不 仅可以使非目标蛋白变性沉淀,还可以去掉蛋白酶的干扰。 另外,如果蛋白的浓度比较高,则体系很容易析出晶体; 反复冻融蛋白质,也会使蛋白在体系中形成聚集沉淀。

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蛋白的溶解
溶解体系与条件 >>>难溶蛋白的溶解方案

对于难溶解的蛋白质,可以采用强的离液剂进行溶解。 对于难溶解的蛋白质,可以采用强的离液剂进行溶解。常用 的离液剂包括: 的离液剂包括:

盐酸胍 DMF

尿 素 硫 脲

表面活性剂

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溶解体系与条件 >>>难溶蛋白的溶解方案

盐酸胍的使用浓度一般为6M至7M,如果体系中含有较 高浓度的盐酸胍,则不能用来制备电泳样品。 尿素一般使用浓度为8M,但是尿素在配制过程以及存放 8M 过程中,会形成氰酸盐,氰酸盐会与氨基进行反应,在进 行严格的实验时,可以利用离子交换柱除去氰酸盐。 硫脲在水中溶解度比较大,一般使用浓度为2M~10M, 通常与尿素配合使用。但硫脲毒性比较大,可通过吸入、 皮肤而被人体吸收。 DMF(N,N二甲基酰胺)主要用来溶解小分子肽,与之 类似的还有DMSO、二氧杂环己烷。


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