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蛋白质的纯化课件


蛋白质工程

蛋白质的分离纯化与鉴定
Isolation, Purification and Identification of Protein

杨学习

抗体工程研究所

世界生命科学的圣地与分子生物学的摇篮 -冷泉港实验室(The Cold Spring Harbor Laboratory)

分子生物学圣经—分子克隆实验指南

蛋白质工程中进行蛋白质分离纯化的必要性
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化学修饰法对蛋白质进行修饰改造时需要单一的 蛋白质作为原材料 为了研究蛋白质工程的效果,需要单一的蛋白质 作为实验材料研究其结构与功能 为了生产性能更优良的蛋白质,需要对设计改造 过的蛋白质进行大量纯化,从而开发出相关产品

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目录
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前言 蛋白质纯化方法 蛋白质纯化总原则及步骤
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总原则 蛋白质纯化的步骤
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材料的选择与预处理 蛋白质的提取 蛋白质的粗分级 蛋白质的细分级 蛋白质的鉴定

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蛋白质纯化的原则 蛋白质的鉴定

一、蛋白纯化方法
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能从成千上万种蛋白质混合物中纯化出一 种蛋白质的原因是不同蛋白质在许多理化 性质上有着极大的不同。
这些理化性质的不同是由于氨基酸的数目 和序列不同造成的。

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1.与蛋白质分离纯化相关的理化特性
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分子大小 分子形状 带电特性 溶解特性 与配体特异性结合不同 吸附性质 变性和复性

1.1分子大小
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大小
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蛋白质的分子大小主要取决于蛋白质肽链的数 目及每条肽链的氨基酸残基数目。
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几百—百万 Da

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常用方法
透析 ? 超滤 ? 凝胶过滤 ? 离心
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透析法

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超过滤

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凝胶过滤

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超速离心

1.2分子形状
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形状
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形状的不同会导致蛋白质在离心通过溶液时, 或通过膜、凝胶过滤填料颗粒或电泳凝胶中的 小孔运动时,都会受到它的形状的影响。

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方法
梯度离心的影响 ? 电泳的影响
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1.3电荷
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原理
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蛋白质的净电荷取决于氨基酸残基所带正、负 电荷总和。若天冬氨酸和谷氨酸占优势,在pH 7.0时带净负电荷,称为酸性蛋白质。若赖氨酸 和精氨酸占优势,在pH 7.0时带净正电荷,称 为碱性蛋白质。

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方法
电泳 ? 离子交换层析
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1.4溶解度
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原理
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由于蛋白质分子表面亲水性和疏水性带电基团不同, 因此在溶剂中的溶解度不同。 通过改变pH、离子强度或加入有机试剂,促进蛋白质 分子的凝聚进而形成沉淀。 盐析法 有机溶剂沉淀法 等电点沉淀法

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方法:
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沉淀法
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蛋白质在高浓度中性盐溶液中会沉淀析出, 称为盐析 盐析原理:
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高浓度盐离子与蛋白质分子争夺水化水,破坏 蛋白质分子表面的水膜,同时盐离子也会影响 蛋白质分子所带电荷,从而引起蛋白质沉淀, 但通常不会引起蛋白质的变性。

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硫酸铵分级沉淀

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有机溶剂分级沉淀

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等电点沉淀法

1.5配体特异性结合
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原理
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生物大分子的某些特定结构能够同其他分子相互识别并结合,这 种结合是特异的又是可逆的,生物分子间的这种结合能力称为亲 和力。 将具有亲和力的两个分子中的一个固定在不溶性基质上,利用分 子间亲和力的特异性和可逆性对另一个分子进行分离纯化。
免疫亲和层析 生物亲和层析 金属螯合亲和层析 拟生物亲和层析

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方法
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分类
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1.6吸附性质
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原理
方法
羟基磷灰石层析 ? 疏水层析
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1.7变性和复性
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原理
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蛋白质在一定的理化条件下会失去原有的空间 结构、生物学功能及部分理化特性等称为变性。 当变性条件去除后恢复原有的空间结构及生物 学功能即为复性。

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方法
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尿素变性复性从包涵体中纯化原核表达蛋白

2. 分离方法
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沉淀法 离心法 电泳法 超滤法 相分配法 层析法

不可能有一套统一的方法适用于分离 纯化所有的蛋白质, 但每一种蛋白质可能都有一套适合的 分离纯化程序, 而且所用的主要技术手段都基本相同。

二、蛋白质纯化的总原则和纯化步骤
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总原则
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以合理的效率、速度、收率和纯度,将目标蛋白从细 胞的全部其他成分特别是不想要的杂蛋白中分离出来, 同时仍保留其生物学活性和化学完整性。

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步骤
选择实验材料,实验材料预处理 ? 蛋白质的提取 ? 蛋白质的粗分级 ? 蛋白质的细分级 ? 蛋白质的鉴定
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蛋白质纯化的前期准备
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什么是最好的来源: 蛋白质需要有多纯: 纯化蛋白的量要多少: 蛋白质应该如何进行鉴定: 纯化时间应该多长: 什么是最终花费: 如何纯化蛋白质: 关于蛋白质我们已知什么:

1、选择实验材料及预处理
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选择实验材料
物种的选择 ? 组织的选择
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实验材料预处理
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液体材料
过滤 ? 离心
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固体材料
洗涤:自来水—蒸馏水—提取缓冲液 ? 材料破碎:
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材料破碎
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机械剪碎 研磨 反复冻融法 超声破碎法 高压匀浆法 酶解法

2、蛋白质的提取
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1.提取分离原则
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尽可能多地提取目的蛋白,同时避免因热、 pH 或有机试剂、金属离子、蛋白酶等因素造成活 性丢失。

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选择合适的pH、选择合适的离子强度 选择合适的比例

2、蛋白质的提取
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2.提取液成分的确定
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pH 缓冲液:Tris-Hcl, Tris-Gly, Gly-Hcl, 柠檬酸-柠檬酸钠 离子强度:动物 NaCl, 植物KCl 还原剂:DTT, 2-巯基乙醇 蛋白酶抑制剂:EDTA, PMSF, TPCK,TLCK 金属离子螯合剂: EDTA, EGTA
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去污剂:SDS, CHAPS, Triton X-100, Tween-20 甘油

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3.温度 0-4℃

3、蛋白质的粗分级
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使用蛋白质提取缓冲液提取实验材料后, 蛋白提取液中目标蛋白质的浓度往往较低, 采取一些简单的方法使目标蛋白质浓缩, 同时去除大量的杂质,这些纯化方法就属 于蛋白质的粗分级。 硫酸铵分级沉淀、有机溶剂分级沉淀、超 速离心、等电点沉淀、透析、超过滤、蛋 白质结晶等。

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4、蛋白质的细分级
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粗分级只是使蛋白质得到浓缩和初步分离 纯化,多数情况下还要根据蛋白质分子大 小、分子形状、分子表面特征或分子带电 状况进一步纯化,这就是蛋白质细分级。
常用的实验技术:层析和电泳

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4.1. 层析( chromatography )
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分子筛层析( Gel filtration )
离子交换层析( Ion exchange ) 疏水作用层析( Hydrophobic interaction )

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亲和层析( Affinity )
羟基磷灰石层析

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原理(Basic principle)

凝胶介质
Pharmacia Sephadex glucose (dextrose) Sepharose agarose Sephacryl glucose + acrylamide Sephacel cellulose

Bio-Rad
BioGelA BioGel P agarose acrylamide

装置(Chromatographic equipment)

蠕动泵 层析柱 检测器 记录仪

部分收集器

chromatography

Gel filtration Hydrophobic interaction Ion exchange

Affinity

4.1.1 分子筛层析 Gel filtration chromatography
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原理
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分子筛层析, 也称为凝胶过滤、分子排阻层析。是以多孔 性凝胶材料为支持物,当蛋白质溶液流经此支持物时,分 子大小不同的蛋白质所受到的阻滞作用不同而先后流出, 从而达到分离纯化的目的。

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凝胶介质
葡聚糖 (glucose) ? 琼脂糖 (agarose) ? 聚丙烯酰胺(acrylamide) ? 纤维素(cellulose)
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分子筛层析

Gel filtration chromatography

Hydrophilic No spontaneous binding to proteins. Chemically and physically stable

分子筛层析

Gel filtration chromatography

分子筛层析 Gel filtration chromatography

4.1.2 离子交换层析( Ion exchange )
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原理
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蛋白质是两性分子,在一定的pH条件下带有电荷,不 同的蛋白质带有的电荷的种类和数量不同,因此它们 与带电的凝胶颗粒间的电荷相互作用不同。利用蛋白 质和带电凝胶的作用力的差别从而把蛋白质分开的层 析方法。 阳离子交换柱:凝胶带负电荷,蛋白质带正电荷 阴离子交换柱:凝胶带正电荷,蛋白质带负电荷 惰性支持物:琼脂糖,葡聚糖 带电基团:羧甲基—带负电 二乙基氨基—带正电 平衡离子:负电基团的平衡离子氢或钠离子 正电基团的平衡离子氢氧根离子或氯离子

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种类
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介质
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选 择 离 子 交 换 介 质

阴离子交换 阳离子交换

离子交换层析( Ion exchange )

4.1.3 亲和层析
(Affinity chromatography)
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原理
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亲合层析是利用蛋白质与配体专一性识别并结 合的特性而分离蛋白质的一种层析方法。 将与目标蛋白质专一性结合的配体固定于支持 物上,当混合样品流过此支持物时,只有目标 蛋白能与配体专一性结合,而其他杂蛋白不能 结合。先用结合缓冲液洗脱杂蛋白,然后改变 洗脱条件,将目标蛋白洗脱下来。

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Affinity chromatography

His-亲合示意图

固相载体

4.1.4疏水作用层析
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原理
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蛋白质表面的疏水基团与介质 的疏水配体的可逆相互作用, 高浓度的盐会增强相互作用, 低浓度的盐会减弱相互作用。

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方法
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高离子强度下待分离的样品吸 附在疏水介质上,然后降低离 子强度选择性将样品解吸,疏 水弱的物质先洗脱,疏水强的 物质后洗脱。

4.1.5羟基磷灰石层析
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羟基磷灰石是一种特殊的离子交换剂,主要成分是磷酸钙。 分子中含有带正电荷的钙离子和负电荷的磷酸根离子。

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磷酸根离子可以和带正电的蛋白质以离子键结合,可由氯
化钠或磷酸钠浓度梯度洗脱。

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钙离子与带负电蛋白质的自由羧基以金属螯合方式结合, 对氯化钠不敏感,可由磷酸钠梯度洗脱。
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单梯度洗脱:磷酸钠单梯度洗脱

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双梯度洗脱:氯化钠梯度洗脱后,低浓度磷酸钠平衡,再以磷酸
钠梯度洗脱。

4.2.电泳( Electrophoresis )
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电泳就是带电颗粒在电场作用下,向着与其电性相反的电极 移动。

蛋白质常用电泳技术
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聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)
SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS--PAGE) 等电聚焦电泳( Isoelectric focusing- IEF) 双向电泳( Two Dimensional Electrophoresis )

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4.2.1 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳
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导致:
1、由于SDS是阴离子,使多肽表面覆盖的 负电荷远远超过蛋白质分子原有的电荷量, 消除了原来的电荷差异。

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2、改变了蛋白质单体分子的构象,不同蛋 白质的SDS复合物的短轴长度都相同,长轴 长度随其分子量的大小成正比变化

电泳法测定未知蛋白的分子量

4.2.2不连续PAGE分离蛋白质的原理
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在不连续电泳系统中,所带电荷、分子大小和 形状不同的蛋白质在凝胶中能够被分离。 原理
电荷效应 ? 浓缩效应
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快慢离子效应 ? 凝胶浓度差效应
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分子筛效应

4.2.3 等电聚焦电泳(Isoelectric

focusing—IEF)

Isoelectric focusing

4.2.4 双向电泳
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第一向通常根据蛋白质的等电点不同进行 等电聚焦电泳,然后再根据分子质量的不 同进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳作为第二 向。
双向电泳技术是蛋白质组学研究中蛋白质 多肽链分离纯化和鉴定的主要实验技术之 一。

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Isoelectric focusing

SDS gel electrophoresis

Two Dimensional Electrophoresis of E. coli Proteins
- more than 2,000 proteins were visualized

三、蛋白纯化原则 Guidelines for Protein Purification
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确定目标
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purity, activity and quantity

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充分了解目的蛋白及主要杂质的理化特性
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to simplify technique selection and optimisation
fast detection of protein activity/recovery and critical contaminants

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确定活性测定方法
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尽量减少纯化步骤
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extra steps reduce yield and increase time, combine steps logically

纯化目的确定纯化目标

三、蛋白纯化原则 Guidelines for Protein Purification
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确定目标
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purity, activity and quantity

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充分了解目的蛋白及主要杂质的理化特性
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to simplify technique selection and optimisation
fast detection of protein activity/recovery and critical contaminants

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确定活性测定方法
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尽量减少纯化步骤
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extra steps reduce yield and increase time, combine steps logically

确定活性检测方法
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ASSAY: A method that measures the amount of a specific protein, in a mixture of others. If possible, the assay should give an estimate of the absolute concentration (e.g. mg/ml). Relative concentration is the next best. The method chosen will ultimately depend on the properties of the target protein. Most common are:
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enzymatic assays. ligand-binding assays immunological assays

活性测定方法的特点:快速、简便、特异和定量

三、蛋白纯化原则 Guidelines for Protein Purification
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确定目标
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purity, activity and quantity

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充分了解目的蛋白及主要杂质的理化特性
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to simplify technique selection and optimisation
fast detection of protein activity/recovery and critical contaminants

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确定活性测定方法
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尽量减少纯化步骤
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extra steps reduce yield and increase time, combine steps logically

尽量减少纯化步骤

Guidelines for Protein Purification
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减少每步操作时间
to avoid lengthy procedures which risk losing activity/reducing recovery 减少添加物 ? additives may need to be removed in an extra purification step or may interfere with activity assays 早期除去降解物 ? for example, proteases 每步使用不同的纯化方法 ? to take advantage of sample characteristics which can be used for separation (size, charge, hydrophobicity, ligand specificity)
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KEEP IT SIMPLE!

四、蛋白质的鉴定
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测定蛋白质的浓度
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凯氏定氮法 紫外吸收法 分光光度法

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测定蛋白质的纯度 鉴定目标蛋白质
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蛋白质分子质量与等电点的测定 氨基酸组成及顺序分析 蛋白质结晶与结构分析 蛋白质活性及功能测定

1 蛋白质含量的测定
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凯氏定氮法:
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蛋白质平均含氮量为16﹪,首先测定氮的含量,进而估算蛋白质的 含量。

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紫外吸收法
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芳香族氨基酸在280nm附近有最大光吸收,核酸在260nm 附近有最大光吸收. 经验公式 蛋白质含量(mg/mL)=1.45× 0.74A 260nm

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A 280nm —

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分光光度法
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蛋白质样品与特定的显色剂反应,反应产物在特定的波长的光吸收 与蛋白质含量成正比,利用标准曲线即可查得样品的蛋白质含量 考马斯亮兰法等

2. 纯度鉴定
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鉴定方法
色谱纯:在层析图谱中只有一个洗脱峰 ? 电泳纯:在电泳图谱中只有一条电泳条带 ? 结晶纯:能够获得蛋白质晶体
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相互验证:在某一种鉴定方法下表现为均一的 蛋白质在另一种方法可能表现为不均一,因此 需要互相验证。

电泳纯

结晶纯 色谱纯

3.蛋白质鉴定
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分子质量及等电点测定
氨基酸组成及顺序分析 结晶及结构分析 免疫印迹(western-blotting)鉴定

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3.1蛋白质分子质量及等电点的测定
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分子质量
SDS-PAGE ? PAGE
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等电点
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等电聚焦(IEF)

3.2氨基酸组成及顺序分析
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氨基酸组成
水解蛋白质为氨基酸 ? 全自动氨基酸分析仪或高效液相色谱进行测定
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顺序分析
质谱法 ? 推定法:从已知基因序列推断蛋白质氨基酸序列
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化学法(手工、自动)
? 水解法 ? Sanger法、Edman降解法、氨肽酶法 ? 肼解法、羧肽酶法

各类氨基酸自动测序仪

3.3 空间结构分析
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二级结构的比例
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圆二色谱法

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三维结构
X射线晶体衍射法—蛋白质晶体 ? 核磁共振—溶液中蛋白质的三维结构 ? 电子显微镜
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3.4 免疫印迹鉴定
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免疫印迹包括三个步骤
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凝胶电泳

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转膜
抗原抗体显色反应

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思考题
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蛋白质分离纯化的总原则是什么? 蛋白质分离纯化的一般步骤如何? 蛋白质细分级和蛋白质粗分级主要技术? SDS—PAGE测定蛋白质分子量的主要原理 如何? Western blotting原理和主要步骤。

参考资料
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蛋白质纯化与鉴定实验指南,朱厚础等译, 2000,科学出版社 The Recombinant Protein Handbook, Protein Amplification and Simple Purification, 18-1142-75 Protein Purification, Handbook, 18-1132-29


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