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RT-PCR实验方案


Place and Time: 资环楼 303 室 实验目的 在 RNA 水平上检测拟南芥野生型 Col-0 和突变体 nip5;1 中 NIP5;1 基因的表达, 了解并掌 握 RNA 抽提、逆转录 PCR 的实验原理与方法。 实验原理 逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR) 的原理 是:提取组织或细胞中的总 RNA,以其中的 mRNA 作为模板,采用 Oligo(dT)或随机引物 利用逆转录酶反转录成 cDNA。再以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增,而获得目的基因或检测基 因表达。RT-PCR 使 RNA 检测的灵敏性提高了几个数量级,使一些极为微量 RNA 样品分析 成为可能。该技术主要用于:分析基因的转录产物、获取目的基因、合成 cDNA 探针等。

实验步骤 1)RNA 提取 TRIZOL 法提取植物组织的 RNA。所有的耗材,包括离心管、枪头要用 0.1% DEPC 水 处理并灭菌烘干。整个实验过程中需戴一次性手套进行操作。 1.匀浆化作用 每50—100 mg组织加1 mL的Tizol,匀浆化时组织样品容积不能超过Tizol容积的10%。 2. 分离阶段 将匀浆样品在15—30℃条件下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解。每1 mL Tizol加0.2 mL 氯仿。盖紧样品管盖,用手用力摇晃试管15秒并将其在30° C下孵育2—3分钟。在2—8° C下以 不超过12,000× g的离心力高速冷冻离心15分钟。离心后混合物分成三层:下层红色的苯酚-氯
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仿层,中间层,上层无色的水样层。RNA无一例外地存在于水样层当中。水样层的容量大约 为所加TRIZOL容量的60%。 3. RNA的沉淀 将水样层转移到一干净的试管中(宁缺毋滥),如果希望分离DNA和蛋白,有机层同样 要予以保留。通过将水样层和异丙醇混合来沉淀RNA。最初均化时的每1 mL TRIZOL对应0.5 mL异丙醇。将混合的样品在15—30° C条件下孵育10分钟并在2—8° C下以不超过12,000× g的离 心力高速冷冻离心10分钟。RNA沉淀在离心前通常不可见,形成一胶状片状沉淀附着于试管 壁和管底。 4 .RNA的洗脱 移去上层悬液。用75%的乙醇洗涤RNA沉淀一次,每1 mL的 TRIZOL至少加1 mL的75% 乙醇。旋涡振荡混合样品并在2—8° C下以不超过7,500× g的离心力高速冷冻离心5分钟。 5. RNA的再溶解 在操作的最后,简单干燥RNA沉淀(空气干燥或真空干燥5—10分钟)不要在真空管里离 心干燥RNA。尤为重要的是,不能让RNA沉淀完全干燥那样会极大地降低它的可溶性。部分 溶解的RNA样品其A260/280比值< 1.6。 用移液管尖分几次移取无RNA酶的水或0.5% SDS溶液 来溶解RNA,并在55—60° C下孵育10分钟(当RNA以后要用于酶切反应时,避免使用SDS。) RNA还能被100%甲酰胺(除去离子)再溶解并保存在–70℃。 2)RNA 质量检测及浓度测定 (1)甲醛变性胶检测 RNA 完整性: 配制 40 mL 琼脂糖溶液(Agarose, 0.4 g;10× MOPS, 4 mL;DEPC 水, 36 mL) ,将其加 热溶化,冷却到 70℃ 时加入 6 ?L EB 和去离子甲醛(终浓度为 2%) ,倒入制胶板,插入 梳子。待冷却后,取 RNA 样品 2?L 于 0.2 mL PCR 管,并加入 Loading buffer2.0 ?L,于 65℃ 水浴处理 10 min ,立即放置到冰水中直至点样。点样后,在电压 100 V 下电泳 1 h,直至 第一道溴芬兰电泳至整个胶的 3/4 处, 在紫外灯下观察 RNA 样品是否完整。 如果 28S 和 18S 条带明亮、清晰、条带锐利(指条带的边缘清晰) ,并且 28S 条带的亮度大于 18S,认为 RNA 样品完好可用于后续实验(见下图) 。

28s 18s

5s

2

(2) 紫外分光光度法测定 RNA 样品浓度: 测定的 Ratio 值( OD260/OD280)在 1.8-2.2 时,认为 RNA 纯度较高可用于后续实验。 当 Ratio 值<1.8 时,溶液中蛋白或者时其他有机物的污染比较明显,可能对后续实验产生影 响。当 Ratio 值>2.2 时,说明 RNA 已经水解成单核酸,则需重新取样抽提 RNA。 最后将测定样品的 RNA 浓度统一稀释至 1000 ng/?L 或 500 ng/?L 用于后续的逆转录反 应。 3)逆转录(Reverse Transcription) 将 RNA 逆转录得到 CDNA 第一链。按照如下体系配制 Mixture I 和 Mixture II。将 Mixture I 在 65 ℃ 下变性 5 min,迅速放置到冰水混合物中置 5 min,然后将 Mixture I 和 Mixture II 混合并离心,42 ℃ 延伸 1 h。 Mixture I: ddH2O(DEPC 处理) Oligo(dT) (50 ng/μL) RNA( 1 μg/μL) Mixture II: ddH2O(DEPC 处理) Buffer(5× ) M-MLV RTase dNTP (10 mM) 4.0 μL 4.0 μL 1.0 μL 1.0 μL 6.0 μL 2.0 μL 2.0 μL

将第一链产物稀释 5 倍用作第二链的扩增的模板。 4)聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ) (1) 取 0.2 mL PCR 管,依次加入下列试剂: 第一链 cDNA 上游引物(10 pM) 下游引物(10 pM) dNTP(10 mM) Buffer Mg2+ Taq 酶(2 u/μL) 2 μL 1 μL 1 μL 1 μL 2 μL 1.2 μL 0.4 μL

(2) 加入适量的 ddH2O,使总体积达 20μL。轻轻混匀,离心。
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(3) 加入 20μL 矿物油封闭反应体系,避免反应液在 PCR 过程蒸发。 (4) 设定 PCR 程序。 在适当的温度参数下扩增 30 个循环。为了保证实验结果的可靠与准 确,可同时对一对已知的组成型表达基因(如 ACTIN)的特异性引物进行扩增作为对照。 PCR 程序 95℃预变性 95℃变性 58℃退火 72℃延伸 72℃延伸 4℃保温 电泳条带进行扫描并保存。 实验结果与分析 对琼脂糖凝胶电泳扫描得到的图片进行分析: 1) 内参 Actin 引物应在两个材料的 cDNA 中均能扩增出 DNA 片段带; 2) NIP5;1 基因引物在野生型 Col-0 中可以扩出基因特异片段, 但在突变体 nip5;1 中扩增 不出 DNA 片段带。 4 min 30 s 20 s 20 s 10 min 10 min
× cycles 30

(5) 电泳鉴定:琼脂糖凝胶电泳,在紫外灯下观察结果,同时采用凝胶图像分析系统对

注意事项 1. 避免 RNA 酶污染: 操作过程中应始终戴一次性橡胶手套,并经常更换,以防止手、臂上的细菌和真菌以及 人体自身分泌的 RNA 酶带到试管或污染用具,避免在操作中说话聊天。 2. 注意实验安全: TRIzol、DEPC、EB、甲醛均为有毒物质,不要与皮肤有直接接触,注意防护。

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