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RNA干扰技术基本原理与应用


RNA干扰技术基本原理与应用

什么是RNA干扰
RNA干扰(RNA interference,RNAi),又 称转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing,PTGS),是指将特异性同 源双链RNA(dsRNA)导入到细胞内,使目的

基因的不表达或表达水平下降. 2001、2002年连续被Science评为年度十大成就!

目前应用的基因干扰技术
?

DNA水平的基因干扰技术

?基因敲除技术 ?寡核苷酸与双链DNA 杂交 ?采用多胺等小分子识别并阻遏特定转录因子

目前应用的基因干扰技术
?

mRNA水平的基因干扰技术 mRNA

?用反义RNA 技术阻遏翻译过程, 破坏内源性
?设计寡核苷酸来破坏与mRNA 结合的蛋白质,
使mRNA 不稳定

?双链RNA 干扰技术(RNAi)

RNAi的发现和发展历程
?

1984 年,Jonathan 研究小鼠L 细胞时发现反义

mRNA 会干扰同源基因的表达,机制不清
?

1990年 Jorgensen等 矮牵牛颜色加深实验 “共抑制(co-suppresion)”

RNAi的发现和发展历程
?

1995年 Su Guo 和Ken Emphues 首次发现 RNA干扰现象

反义RNA阻断秀丽小杆线虫par-1基因的表达 实验
?

1998年 Andrew Fire和Craig Mello

发现单链RNA抑制作用较弱,而纯化的dsRNA可 高效、特异地抑制基因的表达
Nature1998; 391: 806-11

正式提出RNA干扰的概念

RNAi的发现和发展历程
?

1999年

Tuschl等

报道在哺乳动物中也存在RNAi
?

2001 年

Berstein 等

提出只有22 核苷酸dsRNA才有特异性的阻断效
应,并发现体内分解dsRNA 为siRNAs (short/small interfering RNA) 的DICER 酶

RNAi的发现和发展历程
?

2002 年

Novina 等

用RNAi 技术实现了对HIV-1 病毒的阻抑
?

2004年

Morris 等

用RNAi技术实现了对人细胞基因的抑制
Science 2004(August 27);305:1289-1292

RNAi的主要特点和优势
?

诱导转录后水平的基因沉默

?
? ?

具有高度的特异性
抑制基因表达的效率非常高 可在不同细胞之间传递甚至传到子代中去 “基因沉默系统化”

siRNA 与反义寡核苷酸、核酶、脱氧核酶

?

共同点

? 特异性
? 靶向性

siRNA 与反义寡核苷酸、核酶、脱氧核酶

?

不同点

?独特的双链结构 ?需要Dicer、RdRp 、解旋酶、激酶等协同因子 ?siRNA 本身无催化活性 ?在细胞内可能具有相对的稳定性 ?具有一定的可遗传性

RNAi的主要过程
?

启动阶段 dsRNA (500nt左右最佳)被Dicer 酶特异性识 别,以一种ATP依赖的方式逐步切割成siRNA 长度:21-25nt 结构:3ˊ端悬垂两个未配对的碱基UU

细胞中内源性dsRNA的形成
? ? ? ?

基因组中DNA 反向重复序列的转录产物

同时转录反义和正义RNA
病毒RNA 复制中间体

以单链RNA 为模板由细胞或病毒的RNA 依赖
RNA 聚合酶(RdRp) 催化合成dsRNA

Dicer酶
?

RNAase III超家族成员。结构中包括一个螺旋 酶结构域,两个RNA酶Ⅲ结构域,一个双链 RNA结合位点 对单链RNA没有活性

?

?

对200~500nt的dsRNA作用效果最好,能降 解成25nt左右的siRNA
广泛存在

?

RdRp(RNA dependent RNA polymerase)
?

使异常的RNA转变为dsRNA

?
?

参与细胞内dsRNA和siRNA的扩增
siRNA与靶mRNA 的结合可激活RdRp,形成

大量的dsRNA

RNAi的主要过程
?

效应阶段 silencing complex,RISC) 的形成 siRNA、核酸内切酶、外切酶和解旋酶

?RNA诱导沉默复合体(RNA-induced ?RISC的激活:ATP依赖的解双链过程 ?在siRNA反义链的指导下,RISC特异性切 割、
降解靶mRNA,导致基因表达失活

RNAi技术的实验方法
?

siRNA的设计原则

?序列大小 19-21nt ,最好以A或G开始 ?从mRNA的AUG开始,寻找AA二连序列,
作为潜在的RNAi靶位点

?不要针对5‘和3’端非编码区(untranslated
regions,UTRs)

RNAi技术的实验方法
?

siRNA的设计原则

?设计2~4个序列, BLAST 比对基因序列以确
保序列设计的特异性

?优先选择 GC 含量30-50%的序列 ?设计适当的阴性对照序列

阴性对照序列的设计
?

特异性siRNA中的碱基进行随机排列,且行 BLAST基因比对 AGCCTTAGCTTAAGTCCTAG ATTCGTGCTCAATGCAATCG

?

在特异性siRNA引入1~2个错配碱基 AGCCTTAGCTTAAGTCCTAG AGCCTTAGTTTAAATCCTAG

目标序列筛选的相关网站
http://www.ic.sunysb.edu/Stu/shilin/rnai.html

http://sfold.wadsworth.org/sirna.pl
http://biotools.idtdna.com/rnai/ http://RNAiDesigner.invitrogen.com http://bioinfo.clontech.com/rnaidesigner/ http://katahdin.cshl.org:9331/RNAi/html/rnai.html

查找已经证实的siRNA的网站
?

http://design.dharmacon.com/catalog/category.asp x?key=49

? ?

http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_502.html http://web.mit.edu/mmcmanus/www/siRNADB.html

?

http://python.penguindreams.net/Order_Entry/jsp/
BrowseCatalog.jsp?Category=Published

siRNA的制备方法
? 体外制备方法

?化学合成siRNA ?体外转录获取siRNA ?利用Dicer或 RNaseⅢ消化长的dsRNA成
siRNA

化学合成法制备siRNA
?

优点: 纯度高 合成量不受限 能被标记

?
?

缺点:价格昂贵、合成周期长
用途:已经找到最有效的siRNA的情况下, 需要大量siRNA进行研究

体外转录法制备siRNA
? ? ?

优点:简单 成本低 速度快 毒性小 稳定性好 缺点:反应规模和量始终有一定的限制 用途:筛选siRNAs,特别是需要制备多种 siRNAs

消化法( “ siRNAs 鸡尾酒 ”)
?

优点:无需检测或筛选多个siRNA序列 产生多种 siRNAs 混合体,保证有效的 目的基因沉默 缺点:有可能引发非特异的基因沉默

?

?

用途:快速而经济地研究某个基因功能缺失
的表型

siRNA的制备方法
? 细胞内制备方法

?依赖表达质粒或病毒载体在细胞内获取siRNA

?通过PCR介导的siRNA表达试剂盒获取siRNA

siRNA载体
?

依赖RNA聚合酶III 启动子(pol III) ,操纵一段 小的发夹siRNA在哺乳动物细胞中的表达。
人源U6启动子 鼠源的U6启动子 人H1启动子

?

pol III可在细胞中表达许多的小分子RNA,通 过添加一串(3~6个)U来终止转录的 需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单链 再克隆到载体中

?

表达载体法制备siRNA
?

优点:可以进行较长期研究。载体可以在细胞中

持续抑制靶基因达数星期或更久
?

缺点:需要进行克隆,周期长 质粒载体表达效率较低

?

用途:唯一可以用于长期基因沉寂研究的方法

基于PCR的siRNA表达框架(SECs)
?

组成:RNA pol III启动子

发夹结构siRNA
RNA pol III终止位点
?

制备:PCR ,无需克隆和测序

用SECs制备siRNA
?

优点:

?可直接由PCR得到,方法简便,时间短 ?在PCR片段两端添加酶切位点,筛选出 最有效
的siRNA可用于构建表达载体

?可以用来筛选特定研究体系中启动子和siRNA
的最适搭配

用表达框架制备siRNA
?

缺点:

?PCR产物很难转染到细胞中 ?不能进行序列测定,PCR和DNA合成时可能
产生的误读不能被发现导致结果不理想
?

用途:

?筛选siRNA序列 ?在将siRNA克隆到载体前筛选最佳启动子

shRNA(short hairpin RNA) 文库
?

Nature 2004 ;428: 427 - 431 (25 March) 针对:9,610 human genes 5,563 mouse genes 构建成:28,000个shRNA表达盒(cassettes)

?

商品化试剂盒:Expression Arrest?

(美国冷泉港实验室 Open Biosystems公司) 网上数据库中选择特定的shRNA克隆,无需再耗时 耗力进行siRNA的设计、合成和验证过程

CAM:氯霉素抗性基因

hr:同源重组位点

Barcode:每个shRNA独特的识别序列 MSCV:病毒载体骨架
PKG-Puro:哺乳动物细胞中载体稳定性的选择 Kan、oriT、RK6:逆转录病毒信号序列

siRNA

shRNA

使用代价
持久性 宿主类型 设计


最多2周 细胞系 复杂的设计方法

相对较低
可选择获得稳定整合的细胞 原代细胞,胚胎干细胞、细 胞系 完成

获取
应用 检测方法 研究领域

需要合成
瞬时转染

完成
瞬时转染、稳定转染、病毒 侵染

Western杂交、表型分 Western杂交、表型分析、 析RT-PCR、芯片检测 RT-PCR、芯片检测 细胞培养 细胞培养&体内研究

siRNA转染细胞
? ? ? ? ?

.磷酸钙共沉淀

电穿孔法
DEAE-葡聚糖和polybrene

机械法 :显微注射和基因枪
阳离子脂质体试剂

提高转染效率的方法
? ? ? ?

纯化的siRNA 避免使用抗生素 避免RNA酶污染 较低传代数的细胞

?
? ?

合适的转染试剂
合适的阳性对照 荧光标记的siRNA

RNAi技术的应用
?

基因组功能研究的新方法

?
? ?

研究信号传导通路的新途径
开展基因治疗的新策略 (抗病毒、抗肿瘤等) 筛选药物靶点的新工具

RNAi技术抗病毒
?

作用

?阻止病毒入侵、抑制病毒的复制和转录 ?自然界中普遍存在
?

在医学上的应用

?RNA病毒:如HIV、HCV、脊髓灰质炎病毒 ?DNA病毒:如HBV

RNAi技术阻止HIV的入侵
?

Novina将针对CD4的dsRNA导入 能表达CD4、

CCR 5、CXCR4的M agi2CCR 5 细胞系),能
使细胞表面CD4 表达减少75%;转染后60 小时 后, 再用H IV 感染, 结果发现CD4-siRNA 转染的 细胞很少有包涵体出现
?

其它试验的受体: CCR 5、CXCR4

RNAi技术抑制HIV的复制
?

将HIV-1编码rev的基因和同源的dsRNA共转染

到293细胞中,rev基因的表达被显著抑制
?

siRNA抑制HIV rev-EGFP的表达,其抑制率可 达到90%;而反义RNA,核酶组与对照组无显 著差异

RNAi技术抑制HCV的复制
NS5B-6133 siRNA + NS3-1948 siRNA + GAPDH siRNA +

HCV表达质粒
共转染

Huh-7 细胞

HCV RNA ↓
21倍

HCV RNA ↓ 23倍

HCV RNA
无变化

RNAi技术抑制HBV的复制
?

HBV是DNA病毒,但是其复制过程需经过逆转录

的过程。
?

针对HBV的S,C,X,P基因序列及DR1,DR2等 调控元件序列,设计的siRNA可显著抑制HBV的 复制和蛋白表达


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