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RNA提取


全血 RNA 快速提取 操作步骤: 提示: (1) 第一次使用前请先在漂洗液 RW 瓶和 70%乙醇瓶中加入指定量无水乙醇! (2) 使用前将 10X 红细胞裂解液 RLB 用 DEPC 焦碳酸二乙酯处理水稀释到 1X。 (3) 操作前在裂解液 RLT 中加入 β-巯基乙醇至终浓度 1%,如 1 ml RLT 中加入 10μl β巯基乙醇。此裂解液最好现用现配。配好的 RLT 4℃可放置一个月。 1. 在适合大小的 RNase free 离心管中加入 1 体积 (<1.5 ml) 加入各种抗凝剂新鲜血液 (颠 倒混匀后)和 3 体积的红细胞裂解液 RLB,颠倒混匀,可轻弹管壁,确保混匀。 2. 室温放置 10 分钟(期间应该颠倒轻弹混匀数次帮助裂解红细胞) 。 如果 RNA 降解严重,可在冰上裂解,但是时间可长一些以充分裂解。 3. 12,000 rpm 离心 20 秒,倒弃红色上清,并小心的尽可能多的吸弃上清(注意不要吸到管 底的细胞团) ,留下完整的管底白细胞团。 离心后在管底应该见到白色的白细胞团, 也可能有一些红细胞残片和白细胞团在一起, 但是 如果看到的是大部分的红色细胞团, 说明红细胞裂解很不充分, 应该再加入红细胞裂解液重 悬细胞团后重复步骤 2,3。 上清尽可能的吸弃,残留过多会稀释裂解液,造成裂解结合异常,产量纯度降低。 4. 涡旋或者轻弹管壁将白细胞沉淀完全松散重悬,加入 350μl(<0.5 ml 全血)或者 600μl (0.5-1.5ml 全血)裂解液 RLT,吹打混匀后用手剧烈振荡 20 秒,充分裂解。病人血样中 白细胞数量可能大幅增加,应该适当减少处理量。或者按照 350μl(<2x106 白细胞)或者 600μl(2x106-1x107 白细胞)比例加 RTL。 5. 用带钝针头的一次性 1 ml(配 0.9mm 针头) 注射器抽打裂解物 5-10 次或直到得到满意 匀浆结果(或者电动匀浆 30 秒),可以剪切 DNA,降低粘稠度和提高产量。 6. 较精确估计裂解物体积,加入等体积的 70%乙醇(请先检查是否已加入无水乙醇!) ,此 时可能出现沉淀,但是不影响提取过程,立即吹打混匀,不要离心。 7. 立刻将混合物(每次小于 700μl,多可以分两次加入)加入一个吸附柱 RA 中, (吸附柱放入 收集管中)13,000 rpm 离心 60 秒,弃掉废液。 8. 加 700μl 去蛋白液 RW1,室温放置 30 秒,12,000rpm 离心 30 秒,弃掉废液。

如果 DNA 残留明显,可在加入 RW1 后室温放置 5 分钟再离心。 9. 加入 500μl 漂洗液 RW(请先检查是否已加入无水乙醇!) ,12,000 rpm 离心 30 秒,弃 掉废液。加入 500μl 漂洗液 RW,重复一遍。 10. 将吸附柱 RA 放回空收集管中,13,000 rpm 离心 2 分钟,尽量除去漂洗液, 以免漂洗 液中残留乙醇抑制下游反应。 11. 取出吸附柱 RA,放入一个 RNase free 离心管中,根据预期 RNA 产量在吸附膜的中间 部位加 30-50μl RNase free water(事先在 70-80℃水浴中加热效果更好) 室温放置 1 分 , 钟,12,000 rpm 离心 1 分钟。 12. 如果提取全血>0.5 ml 或者>2x106 白细胞,加 30-50μl RNase free water 重复步骤 11, 合并两次洗脱液, 或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要 RNA 浓度 高)。 洗脱两遍的 RNA 洗脱液浓度高,分两次洗脱合并洗脱液的 RNA 产量比前者高 15–30%, 但是浓度要低,用户根据需要选择。

一、实验目的 学习 RNA 琼脂糖凝胶电泳的使用技术。 二、实验原理 RNA 可以使用非变性或变性凝胶电泳进行检测。在非变性电泳中,可以分离混 合物中不同分子量的 RNA 分子,凡是无法确定分子量。只有在变性情况下,R NA 分子完全伸展,其泳动率才与分子量成正比。 判断 RNA 提取物的完整性是进行电泳的主要目的之一。完整的未降解的 RNA 制品的电泳图谱应可清晰看到 18s rRNA、28s rRNA、5s rRNA 的三条带,且 28s rRNA 的亮度应为 18s rRNA 的两倍。 三、材料、试剂及器具 1、 材料 总 RNA 提取物。 2、 试剂 (1)0.1%DEPC 水:200ml 双蒸去离子水加 0.2mlDEPC 焦炭酸、二乙酯混匀, 室温放置过夜,高压灭菌。

(2)10x 电泳缓冲液。 吗啉代丙烷磺酸(MOPS) 0.4mol/L(pH 7.0) NaAc 0.1mol/L 乙二胺四乙酸(EDTA) 10mmol/L (3)50mL 变性琼脂糖凝胶(1%) (4)10x 电泳缓冲液 5 mL 琼脂糖 0.5 g 0.1%DEPC 水 36.5 mL 加热溶解,稍冷却,加入 8.5 mL 37%甲醛。 (5)上样缓冲液:50%甘油,1mmmol/LEDTA,0.4% 溴酚兰,0.4%二甲苯蓝。 (6)甲酰胺(去离子)。 3、器具 (1)电泳系统 (2)紫外透视仪 四、操作步骤 1、 将制胶用具用 70%乙醇冲洗一遍,晾干备用。 2、 制胶: 称取 0.5g 琼脂糖粉末,加入放有 36.5mL 的 DEPC 水的锥形瓶中,加热使琼脂 糖完全溶解。稍冷却后加入 5mL 的 10x 电泳缓冲液、8.5mL 的甲醛。然后在胶 槽中灌制凝胶,插好梳子,水平放置待凝固后使用。 3、 加样: 在一个洁净的小离心管中混合以下试剂:电泳缓冲液(10x)2μl、甲醛 3.5mL、 甲酰胺 10mL、RNA 样品 3.5μl。混匀,置 60℃保温 10min,冰上速冷。加入 3 μl 的上样缓冲液混匀,取适量加样于凝胶点样孔内。同时点 RNA 标准样品。 4、 电泳:

打开电泳仪,稳压 7.5V/cm 电泳。 5、 电泳结束后通过紫外透视仪观察。 五、注意事项 本实验中必须保持 RNase 污染以免 RNA 降解。所有试剂用 DEPC 水配制,用 具也用 DEPC 水冲洗,并灭菌。

1. Ammonium Chloride x10 Lysing Concentrate Solution a) NH4Cl (1.5 M) b) KHCO3 (100 nM) c) Na4EDTA (10 nM) d) Distilled H2O 80 g 10 g 3.7 g 1000 mL

2. 1N HCl or 1N NaOH(调节 pH 值用) 配制步骤: 1. 将以上 a、b、c 试剂溶于 900ml 去离子水中; 2.调节溶液 pH 值到 7.2-7.4,加去离子水定容到 1000ml; 3.在制备工作液时,将此储存液稀释 10 倍后使用。

保存: 1.10x 储存液储存于 2-8°C 不能超过半年(六个月); 2.在使用前,工作液每天都应该新鲜配制放置于室温,当日用不完的弃掉。 以上配方可以在自己的实验室配制后先做预备实验以了解其裂解情况, 如裂解不 充分或不好,建议购买 BD 公司、BioLegend 公司、Caltag 公司、Jingmei 公司 等商品化溶血素,可以得到更好的裂解效果


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