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RT-PCR原理与实验操作步骤


RT-PCR 原理与实验操作步骤

一、知识背景: 1、基因表达:DNA RNA Protein 单拷贝基因表达存在逐步放大机制,如一个蚕丝心蛋白基因 104 个丝心蛋白 mRNA(每个 mRNA 存活 4d,可以合成 105 个丝 心蛋白) 共合成 109 个丝心蛋白。因此单拷贝基因的 mRNA 表达水平对于其功能水平的调控是非常重要的。 2、PCR 技术(olymerase chain reaction):即聚合酶链式反应。 在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于 DNA 聚合酶的酶促反应,其特异性由两个人工合成的引物序列决定。反应 分三步: A、变性:通过加热使 DNA 双螺旋的氢键断裂,形成单链 DNA; B、退火:将反应混合液冷却至某一温度,使引物与模板结合。 C、延伸:在 DNA 聚合酶和 dNTPs 及 Mg2+存在下,退火引物沿 5' 3'方向延伸。 以上三步为一个循环,如此反复。 3、逆转录酶和 RT-PCR 逆转录酶(reverse transcriptase)是存在于 RNA 病毒体内的依赖 RNA 的 DNA 聚合酶,至少具有以下三种活性: 1、依赖 RNA 的 DNA 聚合酶活性:以 RNA 为模板合成 cDNA 第一条链; 2、Rnase 水解活性:水解 RNANA 杂合体中的 RNA; 3、依赖 DNA 的 DNA 聚合酶活性:以第一条 DNA 链为模板合成互补的双链 cDNA. 二、RT-PCR 的准备: 1、引物的设计及其原则: 1)引物的特异性决定 PCR 反应特异性。因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重要的影响。在引物设计时要充分考虑到 可能存在的同源序列,同种蛋白的不同亚型,不同的 mRNA 剪切方式以及可能存在的 hnRNA 对引物的特异性的影响。尽量选择 覆盖相连两个内含子的引物,或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。 2)引物设计原则的把握:引物设计原则包括 a、引物长度:一般为 15~30bp ,引物太短会影响 PCR 的特异性,引物太长 PCR 的最适延伸温度会超过 Taq 酶的最适温度,也 影响反应的特异性。 b、 碱基分布: 四种碱基最好应随机分布, 避免嘌呤或嘧啶的聚集存在, 特别是连续出现 3 个以上的单一碱基。 GC 含量 (Tm 值) : 40%~60%,PCR 扩增的复性温度一般是较低 Tm 值减去 5~10 度。 c、 3'端要求:3'端必须与模板严格互补,不能进行任何修饰,也不能有形成任何二级结构的可能。末位碱基是 A 时错配的引发 效率最低,G、C 居中间,因此引物的 3'端最好选用 A、G、C 而尽可能避免连续出现两个以上的 T。 d、引物自身二级结构:引物自身不应存在互补序列,否则会自身折叠成发夹状结构或引物自身复性。 e、引物之间的二级结构:两引物之间不应有多于 4 个连续碱基互补,3'端不应超过 2 个。 f、同源序列:引物与非特异扩增序列的同源性应小于连续 8 个的互补碱基存在。 g、5'端无严格限制:5'末端碱基可以游离,但最好是 G 或 C,使 PCR 产物的末端结合稳定。还可以进行特异修饰(标记、酶切 位点等)等等。 根据实验目的选择适当的引物。常用引物设计软件如 Primer5.0,Oligo6.0 等对于这些条件都可以自行设置。 2、耗材:实验所用的接触样品的耗材如冻存管、枪头、EP 管之类事先都需经过 0.1%DEPC 水浸泡处理,除去 RNA 酶,防止操 作过程中 RNA 降解。然后经高压灭活(灭菌和灭活 DEPC) 。 3、试剂准备:变性液、水饱和酚、乙酸钠、氯仿、异丙醇、75%酒精、经 DEPC 处理并高压的水。 三、RNA 的提取方法: RT-PCR 中从细胞分离的 RNA 的质量至关重要, 包括 RNA 的纯度和完整性。 RNA 分离的最关键因素是尽量减少 RNA 酶的污染。 但 RNA 酶活 性非常稳定,分布广泛,除细胞内源性 RNA 酶外,环境中也存在大量 RNA 酶。因此在提取 RNA 时,应尽量创造 一个无 RNA 酶的环境,包括去除外源性 RNA 酶污染和抑制内源性 RNA 酶活性,主要是采用焦碳酸二乙酯(DEPC)去除外源性

RNA 酶,通过 RNA 酶的阻抑蛋白 Rnasin 和强力的蛋白质变性剂如异 硫氰酸胍抑制内源性 RNA 酶。

实验操作步骤 一、实验器具与材料: 1、移液枪:1ml、200μl、20μl、10μl、2μl 2、吸头:1ml、200μl、20μl 3、匀浆管:5ml 4、吸头台:放置 1ml 吸头的一个,放置 20μl 吸头的一个 5、EP 管:1.5ml、0.2ml、100μl 6、试剂瓶:2 个 60ml 的棕色试剂瓶(广口,带盖) 1 个 125ml 的白色试剂瓶(放无水乙醇) 7、量筒:50ml、250ml、500ml 8、容量瓶:250ml、500ml、1000ml 9、试管架:5ml、1.5ml、20μl 10、盐水瓶:250ml、500ml 各 2 个备用,一个装无水乙醇,另一个装 DEPC 水 11、铝制饭盒:4 个 12、塑料小饭盒:1 个 13、大瓷缸:2 个 RT-PCR 原理与实验操作步骤 14、锡泊纸:一卷 15、卷纸:2 卷 16、三角烧瓶:带盖,稍大 二、实验器具的处理与准备 1、塑料制品: (包括枪头、EP 管、匀浆管等) 先将 DEPC 水从容量瓶中倒入瓷缸中,将塑料制品逐个浸泡其中,其中小枪头需要吸管打入 DEPC 水,过夜,然后高压,再烤干 备用,实验前将枪头等放入吸头台,再高压一次(EP 管) 2、玻璃制品:泡酸过夜,冲洗干净,蒙锡纸烤干备用(DEPC 水泡) (洗净后先泡 1‰DEPC 过夜,再烤干) 3、匀浆器: (包括剪刀、镊子)先洗净后,再高压(不需要泡 DEPC) 三、试剂配制: 1、DEPC 水:吸出 1ml 放在 1000ml 双蒸水中配成 1‰DEPC 水,放在 1000ml 容量瓶中静置 4 小时备用。 2、75%乙醇:用无水乙醇 DEPC 水配,然后放-20℃保存(其中 DEPC 水需先高压) 3、异丙醇:放入棕色瓶中 4、氯仿:放入棕色瓶中 5、琼脂糖 四、几种缓冲液的配制: 1、电泳缓冲液: Tris 54g 硼酸 27.5g 0.5M EDTA 20ml? pH8.0 蒸溜水 1000ml 5× TBE (贮存液) 再将 5× TBE 稀释 10 倍成 0.5TBE 就可以在电泳时使用(即工作液浓度) ,如取 50ml 贮存液 450ml 水--→500ml 工作缓冲液 2、上样缓冲液: 0.25%溴酚蓝

0.25%二甲苯青 FF RT-PCR 原理与实验操作步骤 30%甘油 6× 缓冲液,4℃保存 五、琼脂糖凝胶的配制: 1、1.0%: 1.0g 琼脂糖 100ml 电泳缓冲液,微波炉中火 30 秒至沸腾,熔化的琼脂物冷却至 60℃时加入 10mg/ml 溴化乙锭 2.5μl,充分混 匀,将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中,在室温下放置 30-45min 后现进行电泳。 2、1.5%: 同上,将琼脂糖的量改为 1.5g


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