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硕士学位论文
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本课题针对常规的食用菌栽培方式一固体菌种栽培具有周期长、效率低,造
成市场上供不应求的现状,进行了食用菌液体菌种的工艺及应用的研究。食用菌 液体菌种的研究,由于其具有技术性强,环境条件严格以及检测要及时等特点, 虽然目前研究的单位和个人较多,但真正有效的进行应用的却很少。本课题即是 针对此种状况,进行了如下的研究。本课题的主要研究结果如下: 主要研究结果如下: 1.以金针菇、鸡腿菇为研究对象,采用发酵罐通气式培养方法,通过单因子 试验、双因子试验以及正交试验,对液体菌种的最佳培养基配方进行了研究。结 果表明:培养基的最佳配方为:玉米粉3%,葡萄糖2%,麸皮2%,蛋白胨0.3%, 硫酸镁0.05%,磷酸二氢钾0.05%,维生素B 0.05%,豆油0.03%; 2.进行液体菌种栽培、品种筛选及菌种贮存试验。结果表明:金针菇的栽培

料的pH值为6.5—7.0,培养料的含水率为57%~60%较好:杂交19和玉雪分别
是黄金针菇和白金针菇适合做液体培养的金针菇菌株:金针菇液体菌种的贮存在 常温条件(22。C左右)仅能保存lO天左右,但在低温条件下(4℃左右),保存 210天的液体菌种的活力仍很强。从而解决了目前制约食用菌液体菌种生产的瓶 颈问题。 3.进行了液体菌种与固体菌种的对比应用试验,并进行了效益分析。结果表 明,与采用固体菌种的栽培相比,采用液体菌种栽培具有周期短、出菇齐、生产

效率高的优势,可使经济效益提高15%一20%,充分说明了液体菌种的良好的应
用前景。

4.对生长素一木醋液应用到鸡腿菇的液体菌种生产的作用进行了研究。结果 表明:当木醋液浓度为O.01%一O.1%时,鸡腿菇的生物量可提高30%一40%,而浓
度大于0.1%时,对鸡腿菇液体培养却有抑制作用。 在课题的研究过程中,充分运用了生物学、化学和工程学、微生物学、生物 化学、细胞生物学、分子生物学等综合知识,采用了单因子、双因子、多因子试 验设计,利用Excel、SPSS等统计工具对数据进行处理,建立了~套完整的液体 菌种的工艺方案并成功的进行了应用研究,为食用菌高效工厂化生产提供了一条 有效途径。 关键词:食用菌;液体菌种;工艺:应用;金针菇:鸡腿菇

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ABSTRACT
The traditional planting method of edible,that is solid strain of long cycle,low Researches condition
are

planting

method,is

efficiency,and

then edible fungi supplay falls short of demand.

on

edible fungi liquid strain need complex technology,rigid cenvironment timely examination.So,although there
are

and

many researchers,yet there

few who

carl

employ liquid strain effectively.Aming at this fact,the

technics

and

application of edible fungi liquid strain is researched in this output is following:

subject.The

main research

1.Flammulina
objects.The

velutipes and Coprinus comatus

are applied

as

the research

best substrates of liquid strain,the best culture environmental conditions,

culture process and control,the pollution liquid culture

and

the control to it are

studied through single—factor,double tWO?factor and vertical experiments.The results show:the best prescription is corn flour 3%,glucose 2%,bran 2%,peptone 0.3%, bitter salt 0.05%,KH2P04

0.05%vitamine

B 0.05%,bean oil 0.03%. breeds and stocking

2.The experiments of cultivating liquid strains,filtering

strains are carried out.The results show:he pH of the Flammulina velutipes planting material should be 6.5 to 7.0,and the water-containing rate should be 57%to 60%: Fv一1 9

and

Yuxue

are

found the suitable Flammulina velutipes fungi

tO

be carried liquid
so

cultrure;the

liquid
or

Can
they

be

kept

for

only

10

dates

or

in

normal
or

temperature(22*C so),and.still

so),yet

Can be

kept for 210 dates in low temperature(4。C

activated,then the hard preserving problem is solved.

3.the experiments to compare liquid

and

solid fungi and the benefit


analysis

are

taxied.The results show:contrast to solid strain culture,it has such
as

lot of advantages

short cycle,orderly growth and high efficiency,the economy effect for 1 5%to 20%,the promising prospect of liquid fungi

Can

be

enhanced adequately. 4.The

is proved

effect

of the growth element--wood vinegar liquid

on

the Coprinus

comatus liquid strain production is researched.The results show:0.01%to 0.1%wood vinegar liquid

Can

promote biology

quantity

of

Flammulina velutipes for 30%to

40%,yet wood vinegar liquid of high concentration restrain Flammulina velutipes liquid culture. During the process of the

subject,a
II

lot of compositive knowledge such

as

江苏大学硕士学位论丈
biology,chymistry,engineering,microbiology,biochemistry,cell biology and

molecular biology,are employed.And the integrate technics scheme of liquid culture is set up by single-factor,double—factor,mulriple—factor tests using the statistical tools such
as

Excel

and

SPSS.And

the application

research

has

been

carried

out

successfully,an effective way for planting edible fungi industrially has been offered.

Key words:Edible fungi,Liquid strain,Technics,Application,

Flammulina velutipes,Coprinus comatus

In

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本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,

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保密口,在 本学位论文属于 不保密日。

年解密后适用本授权书。

学位论文作者签名:

互缀

……珥币
1.珂r年Z月f≥日

u,r年6月f歹日

本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独立进 行研究工作所取得的成果。除文中已注明引用的内容以外,本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研 究做出重要贡献的个人和集体,均己在文中以明确方式标明。本人完 全意识到本声明的法律结果由本人承担。

学位论文作者签名:

日期:







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第1章绪论
1.1

食用菌菌种液体培养概述:
目前,食用菌菌种的生产方式主要有两种,一种是固体培养,另~种是液体

培养。固体培养就是利用传统的固体原材料如木质、草质等进行食用菌的固体发 酵,获得的固体菌种用于栽培,最终获得子实体。液体培养是菌种培养基采用液 体基质发酵来进行菌种的生产。食用菌液体培养又称深层发酵或沉没培养或液体 发酵,其原理是:在发酵罐或三角瓶中,采用液体培养基,通入无菌空气并加以 搅拌或振荡,增加培养基中溶氧含量,提供食用菌菌丝体呼吸代谢所需要的氧气, 并控制适宜的外界条件,使菌体在液体深处繁殖发育,获得大量的菌丝体或代谢 产物川’。”3。食用菌液体培养基本上和固体培养相比具有很多优越性,故日益受到 重视‘删?…1。 (一)液体发酵应用于液体菌种的优点: 1.生产周期短制备液体菌种一般只要5—7天,周期短,速度快。而培养 一瓶固体栽培菌种需要30天左右,仅发菌时间就比固体菌种节省了1/2—2/3。 此外,用液体菌种作为母种或原种来扩大培养原种或栽培种时,也要比采用固体 菌种快的多。一般液体种要比固体种提前成熟10—20天。因为液体菌种有流动性, 各个菌丝球和菌丝片断可以流散在不同的部位萌芽,这样发育点多,长满菌种瓶 或袋所需的时间也就大大减少。 2.菌龄一致 由于固体菌种是靠接种块上的菌丝体蔓延长成的,这样不仅

培养菌种的速度慢,而且处在菌种瓶(袋)上部和下部的菌丝体菌龄差异较大, 一般要差20-30天,往往当下部菌丝体刚长到瓶(袋)底时,处在接种处的上部 菌丝体就接近“老化”。而液体菌种则不一样,它们生长发育均匀一致,菌龄整 齐,液体发酵5—7天时的菌丝体正值旺盛生长期,接种后萌发快(6小时萌发菌 丝),菌丝活力强,发育健壮。用其拌料栽培(如栽培鸡腿菇),其菌丝生长速度 较一致,现蕾及出菇时间一致,便于管理,采收与加工。 3.菌种生产成本低采用三角瓶或发酵罐生产液体菌种,产量高,原料便 宜,成本较固体菌种要低。例如:IOOL发酵罐产生的液体菌种,用于栽培。可 制栽培袋3000袋。每袋菌种生产成本只有3分钱,不到固体菌种的1/3。同时,

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由于其生产周期短,不使用菌种瓶,可省去装瓶、挑弃污染瓶、接种、挖瓶等繁 杂工艺,节省了劳力、电耗和空闻。 4.接种简便流质状态的液体菌种还便于接种工作的机械化、自动化,有 利于工作效率的提高,更适合食用菌的工厂化、标准化生产“3。 (二)液体发酵在食品、医药等行业上的应用 1.生产菌丝体制备药物应用于医药工业许多液体发酵的食用菌菌丝体,可 用于制药。虽然这些食用菌药物,可取其为子实体,但无论生产规模、生产周期 和经济效果等方面,均不及用液体发酵为好。目前,对于那些在人工栽培条件下 不易形成子实体或者其菌丝体与子实体相类似有效成分的蕈菌,可以利用发酵产 物代替子实体。现在,我国市场上供应的食用真菌药物,如蜜环片、灵芝菌片、 宁心宝胶囊、安终痛等均已采用液体发酵菌丝体制造…_‘州_””。“1。 2.液体发酵生产菌丝体在食品工业上的应用 液体发酵食用菌菌丝体的营

养成分,无论是蛋白质,氨基酸,还是维生素的含量。类似于子实体。因此液体
发酵的食用菌菌丝体是人类的上等食料。 3.生产饲料液体发酵形成的菌丝体以及含有多种代谢产物的发酵液,是上 等的饲料,一般作为蛋白质原料加入饲料中,它比其它方法产生的蛋白质速度快, 经济效益高,是动物饲料中蛋白质来源的一个好途径。 4.扩建容易 且液体菌种的生产厂房面积小,生产效率高,易进行自动化

控制,产品质量稳定;产品易于提取、精制等Ⅲn哺叫-¨…。

1.2国内外发展状况:
食用菌的液体发酵是在抗生素发酵技术的基础上发展起来的,1947年美国
的汉姆非特(Humfeld H)首先提出了液体培养法生产蘑菇菌丝体。1948~1954 年他们选出了适合液体培养的蘑菇菌株。1953年美国人布洛克博士(S.S.Block) 用废柑汁深层培养出了野生蘑菇;1958年沙克斯(Szuecs J)第一个在发酵罐内

培养出羊肚菌菌丝球。1。日本的杉森恒武等于1977年用1%的有机酸和0.5%的
酵母膏组成液体培养基,取得大量香菇菌丝体“…。从此,食用菌的培植开始从农 业生产跨入了工业生产的领域“”“7“。

当前.日本、韩国和我国台湾对液体菌种研究…1呻1,但没有对食用菌液体
菌种应用到出菇生产进行报道。

江苏大学硕士学位论文 我国是在1958年开始研究蘑菇、侧耳深层发酵,到1963年,已经能进行羊 肚菌的工业化商品生产,从此,食用菌的产品获取开始由简单的农业种植而转入 工业发酵生产;60年代末期,我国已能大规模采用深层发酵法生产食用菌,主 要研究单位有四川抗生素研究所、三明真菌研究所、中国医药科学院药物研究所、 上海新型发酵厂等,研究主要集中在药用菌的生产,如灵芝、蜜环菌、银耳芽孢 等菌类”1。70年代开始研究香菇、冬虫夏草、猴头、黑木耳等食用菌的液体发酵。 20世纪90年代,由于发现食用菌多糖有抗癌活性,所以,一些具有生理活性 物质的菌类如云芝、灰树花等已成功地在上海食用菌研究所及浙江等地进行深层 发酵培养”1。 由于用液体发酵法生产食用菌的菌丝体要比栽培子实体简便快速,因此,许 多目前还不能进行人工栽培的野生食用菌,如羊肚菌、美味牛肝菌、松菇、块菌、 鸡油菌等都可以用液体发酵法生产菌丝体。一个发酵罐短期内可以生产几吨至几 十吨的食用菌的菌丝体,而且还可以从发酵液和菌丝体中提取菌体代谢产物。因 而,液体发酵是其发展的必然趋势。 目前对食用菌液体发酵的报道很多,如福建农业大学江玉姬。…、宁夏农学院 食品科学系乔长晟‘…、江苏常熟高等专科学校生化系吴金男””等均对食用菌的液 体培养进行了研究。而在利用液体菌种直接用来生产食用菌子实体方面,国内只 有少量的报道。如甘肃省科学院研究所的李玉珍等研究了耳液体菌种在不同培养 料上的性状表现,重庆师专的朱健勇等进行了液体发酵菌种生产金针菇子实体的 实验,得到了菌丝生活力强、接种面大、发菌速度快的一些结果。但是这些试验 一般也都停留在实验室阶段,没有能在生产上推广应用。究其主要原因,是因为 液体深层发酵的投入设备大,一般个体生产户不愿投入;按种设备不过关,造成 堵塞;接种技术不过关,在接种过程中往往容易产生污染;菌种不易保存,发酵 以后必须马上投入使用等等,所以液体菌种生产子实体一直未能推广应用。

1.3研究的主要内容
本课题的研究,综合运用了农业工程、环境工程、仿生工程等相关学科知识, 它涉及到的基础学科有生物学、化学和工程学、微生物学、遗传学、生物化学、 细胞生物学、分子生物学等领域”1,利用综合知识,主要以金针菇、鸡腿菇为研 究对象建立一套液体菌种的发酵工艺路线并进行栽培应用,找出食用菌液体培养

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的最佳生理条件和环境条件,并应用于实际的生产,以解决液体菌种的瓶颈问题,

真正实现液体菌种的应用价值。所以,本课题不仅具有学术价值,更具有实际的
应用价值和意义。 1.最佳液体菌种培养基配方的筛选:考虑到不同原料的营养成分,不同c源、 N源,最适碳源、氮源的选择、无机盐以及生长素的影响,得出最佳液体培养基 的配方。 2.一级液体菌种制备方法的研究:目前,大多数单位制备一级液体菌种都 采用传统的摇床培养法,此种方法具有耗资大,效益低的特点,本课题试用一种 简便、耗资低、实用的通气式培养方法来实现。 3.过程工艺条件的优化:根据菌体的培养规律,对温度、pH值、溶解氧浓 度、消泡剂的浓度进行优化,得出一种最适合液体培养的的过程工艺条件,达到 最佳的培养效果。 4.菌丝体活性的判断:通过研究菌丝体干重、单位体积的培养基中菌丝体 个数及还原糖、多糖的测定等多种方法来判断菌丝体的活性,从而确定最佳培养 终点。 5.木醋液对液体菌种菌丝生长的影响:在液体培养基中,添加不同浓度的

生长素一木醋液,探讨木醋液对食用菌菌丝体生长的影响, 6.保藏条件和时间对液体菌种活性的影响:研究保存条件和时间对液体菌 种菌丝活力的影响,从而解决液体菌种难保存的问题。
7.对液体菌种进行经济效益、社会效益分析,为其推广作好铺垫。



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第2章食用菌液体发酵培养基的优化配方研究
食用菌液体培养是一个比较复杂的工艺流程,涉及到培养基的配制、灭菌、 液体菌种的培养、栽培种的制备以及出菇管理等一系列过程。一般的流程图如下: 原料


斜面菌种

空气


三角瓶种子培养


气泵

培养基配制


灭菌


一级种子罐


总过滤器


冷 l●,土厶 口 一 一 一 一 一

二级种子罐

I I

一一一一一一一一一一一分过滤器

发酵罐


栽培种




作为原种接麦粒种





栽培种

l-…一出菇管理一…I
本章主要研究液体菌种的培养基配制,培养基是提供食用菌生长繁殖和生物

合成各种代谢产物所需要的、按一定比例配制的多种营养物质的混合物。培养基
的恰当与否是食用菌液体培养的关键条件之一,因此,本章即以金针菇为研究对

象,通过单因子、双因子以及正交试验,研究液体菌种的最佳培养基配方。

2.1食用菌培养基的概述
培养基组成对菌体生长繁殖、产物的生物合成、产品的分离精制乃至产品的 质量和产量都有重要的影响。食用菌的营养活动是依靠向外界分泌大量的酶,将 周围环境中大分子蛋白质、糖类、脂肪等营养物质分解成小分子化合物,借助于 细胞膜的渗透作用,吸收这些小分子营养物质来实现的。不同的食用菌的生长情

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第2章食用菌液体发酵培养基的优化配方研究
食用菌液体培养是一个比较复杂的工艺流程,涉及到培养基的配制、灭菌、
液体菌种的培养、栽培种的制各以及出菇管理等一系列过程。一般的流程图如下: 原料 t 培养基配制 斜面菌种


空气


气泵

三角瓶种子培养


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发酵罐

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栽培种



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本章主要研究液体菌种的培养基配制,培养基是提供食用菌生长繁殖和生物

合成各种代谢产物所需要的、按一定比例配制的多种营养物质的混合物。培养基 的恰当与否是食用菌液体培养的关键条件之一,因此,本章即阻金针菇为研究对 象,通过单因子、双因子以及正交试验,研究液体菌种的最佳培养基配方。


1食用菌培养基的概述
培养基组成对菌体生长繁殖、产物的生物合成、产品的分离精制乃至产品的

质量和产量都有重要的影响,食用菌的营养活动是依靠向外界分泌大量的酶,将

周围环境中大分子蛋白质、糖类、脂肪等营养物质分解成小分子化合物,借助于 细胞膜的渗透作用,吸收这些小分子营养物质来实现的。不同的食用菌的生长情 细胞膜的渗透作用,吸收这些小分子营养物质来实现的。不同的食用菌的生长情

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况不同或合成不同的发酵产物时所需的培养基有所不同,但对于所有发酵生产有 培养基的设计仍存在某些共同点可供遵循,即所有的发酵培养基都必须提供微生 物生长繁殖和产物合成所需的碳源、氮源、无机元素、生长因子、水和氧气等。 2.1.1培养基的类型和用途 (1)根据来源,可分为天然、合成和半合成培养基 天然培养基是采用化学成分不恒定的各种植物、动物组织或微生物的浸出 物、水解液等物质(例如牛肉膏、麦芽汁、蛋白胨等)制成,适合于各类食用菌 的生长,而一般自养生物不能生长。合成培养基是使用化学成分和数量完全了解 的物质配制而成,成分精确,重复性强,可以减少不能控制因素,使用于实验室 范围作为有关营养、代谢、分类鉴定、生物测定及选育菌种、遗传分析定量研究 工作。半合成培养基为既含有天然成分又含有纯化学试剂的培养基。 (2)根据主要成分或使用目的可分为基础、增殖、鉴别和选择培养基 鉴别培养基是培养基中加有能与某一菌的无色代谢物发生显色反应的指示 剂,从而用肉眼区别于该菌与其他菌”3。选择培养基是根据某种生物的特殊营养 要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基。 (3)根据生产工艺的要求可分为孢子、种子和发酵培养基等”3 孢子培养基是供制备孢子用的培养基.种子培养基是满足菌种生长的培养基, 发酵培养基是满足大生产中大量菌体生长和繁殖以及代谢产物积累的营养物质。 2.1.2培养基的选择 不同的食用菌对培养基的需求是不同的,因此.不同食用菌培养过程对原料 的要求也是不一样的。应根据具体情况,从食用菌营养要求的特点和生产工艺的 要求出发,选择合适的培养基,使之既能满足微生物生长的需要,又能获得高产 的产品,同时也要符合增产节约、因地制宜的原则。 (1)根据菌种用途选择不同物理形状的培养基 在液体培养基中,营养物质是以溶质状态溶解于水中,这样食用菌就能更充 分接触和利用营养物质,更有利于食用菌的生长和更好地积累代谢产物。因此, 利用液体培养基进行的深层发酵具有发酵效率高,操作方便,便于机械化、自动 化,降低劳动强度,占地面积小,产量高等优点。所以发酵工业中大多采用液体 培养基培养种子和进行发酵。但在一般农户生产水平上栽培食用菌,以采用固体


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培养基为主,主要是因为一次性投资较小,操作简单,容易实现。 (2)从生产实践和科学试验的不同要求选择原料 生产工程中,由于菌种的保藏、种子的扩大培养到发酵生产等各个阶段的目 的和要求不同,因此,所选择的培养基成分配比也应该有所区别。一般来说,种 子培养基主要是供食用菌菌体的生长和大量增殖。为了在较短的时间内获得数量 较多的强壮的种子细胞,种子培养基要求营养丰富、完全,氮源、维生素的比例 应较高,所用的原料也应易于被食用菌菌体吸收利用。常用葡萄糖、硫酸铵、尿 素、玉米浆、酵母膏、麦芽汁、米曲汁等作为原料配制培养基。而发酵培养基氮 源物质的含量往往要高于种子培养基。 (3)从经济效益方面考虑选择生产原料 对于生产过程来讲,在工业发酵中选择培养基原料时,除了必须考虑容易被 食用菌利用并满足生产工艺的要求外,还要考虑到经济效益,必须以价廉、来源 丰富、运输方便、就地取材以及没有毒性等为原则选择原料。 2.1.3培养基的配制原则 培养基的配制必须提供合成食用菌细胞和发酵产物的基本成分;有利于减少 培养基原料的单耗.单位营养物质所合成产物数量大或产率大;有利于提高培养 基产物的浓度,以提高单位容积发酵罐的生产能力:有利于提高菌体生长速度, 缩短发酵周期;减少对发酵过程中通气搅拌的影响,有利于提高氧的利用率、降 低能耗;并尽可能减少产生“三废”的物质。 当然,设计任何一种培养基都不能面面俱到地满足上述各项要求,需根据具 体情况,抓主要环节。使其即满足食用菌的营养要求,又能获得优质高产的菌种, 同时也符合增产节约、因地制宜的原则。发酵培养基的主要作用是为了获得预期 的产物,因此必须根据产物特点来设计培养基。因此要求营养要适当丰富和完备, 菌体迅速生长和健壮,整个代谢过程pH值适当稳定;糖、氮代谢能完全符合高 单位罐、批的要求,能充分发挥生产菌种合成代谢产物的能力。此外,还要求成 本降低。具体来说,要考虑以下几个方面。 (1)根据不同食用菌的营养需要配制不同的培养基不同的微生物所需要 的培养基成分是不同的,要确定一个合适的培养基,就需要了解生产用菌种的来 源、生理生化特性和一般的营养要求,根据不同生产菌种的培养条件、生物合成

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的代谢途径、代谢产物的化学性质等确定培养基。 (2)营养成分的恰当配比食用菌所需的营养物质之间应有适当的比例, 培养基中的碳氮的比例(C/N)在发酵工业中尤其重要。如果培养基中氮源过多, 会引起食用菌生长过于旺盛,活力不易保持;若氮源不足,则微生物菌体生长过 于缓慢。当培养基中的碳源供应不足时,容易引起食用菌菌体的衰老和自溶。培 养基的碳氮比不仅影响食用菌菌体的生长,同时也会影响到发酵的代谢途径。不 同的食用菌菌种、不同的发酵产物所要求的碳氮比是不同的。 (3)渗透压配制培养基时,应注意营养物质要有合适的浓度。营养物质 的浓度太低,不仅不能满足食用菌生长对营养物质的需求,而且也不利于提高发 酵产物的产量和提高设备的利用率。但是,培养基中营养物质的浓度过高时,由 于培养基溶液的渗透压太大,会抑制食用菌的生长。此外培养基中的各种离子的 浓度比例也会影响到培养基的渗透压和食用菌的代谢活动,因此,培养基中各种 离子的比例需求要平衡。在发酵生产过程中,在不影响食用菌的生理特性和代谢 转化率的情况下,通常趋向在较高浓度下进行发酵,以提高产物产量,并尽可能 选育高渗透压的生产菌株。当然,培养基浓度太大会使培养基黏度增加和溶氧量 降低。 (4)pH值各种食用菌的正常生长均需要有合适的pH值,为此,当培养 基配制好后,若pH值不合适,必须加以调节。当食用菌在培养过程中改变培养 基的pH值而不利于本身的生长时,应以食用菌菌体对各种营养成分的利用速度 来考虑培养基的组成,同时加入缓冲剂,以调节培养液的pH值。 在配制培养基时,除应注意以上几条原则外,还要考虑到营养成分的加入顺 序,为了避免生成沉淀而造成营养成分的损失,加入的顺序一般为先加入缓冲化 合物,溶解后加入主要物质,然后加入维生素等生长素类的物质。

2.2金针菇液体发酵培养基的优化及工艺研究
金针菇又名朴菇、冬菇等。其肉质脆嫩,味道鲜美,营养丰富。据测定,其 含有18种人体必需的氨基酸,每100克干菇中氨基酸总量达20.9克,其中人体 必需的8种氨基酸占总量的44.5%,赖氨酸和精氨酸的含量分别高达1.024克和 1.231克,能增强儿童的智力发育,国外称之为“增智菇”。其还含有朴菇素,对

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小白鼠艾氏腹水瘤EC和肉瘤S-180有很好的抑制作用。近年来临床医学试验证 明,金针菇可预防和治疗肝炎和胃肠溃疡,降低胆圊醇,预防高血压,具有抗癌 作用,被视为“超级食品”。目前,金针菇已经成为世界消费量前五名的食用菌。 因此,以金针菇为研究对象。 根据以上的培养基配制原则,进行金针菇最佳培养基配方的设计及试验。培 养基的组分(包括这些组分的来源和加入方法)、配比、缓冲能力、黏度、消毒是 否彻底、消毒后营养破坏的程度及原料中杂质的含量都对菌体生长和产物形成有 影响。目前还只能在生物化学、细胞生物学等的基本理论指导下,参照前人所使 用的较适合于某一类菌种培养基的经验配方,再结合所用菌种和产品的特性,采 用玻璃瓶等小型发酵设备,对碳、氮无机盐和前体等进行逐个单因子试验,观察 这些因子对菌体生长和产物合成量的影响,最后再综合考虑个因素的影响,得到 一个适合该菌种的培养基的配方,以得到高产。 为了减少实验次数,采用“正交试验设计”等数学方法来确定培养基组分和 浓度,它可以通过比较少的实验次数而得到较满意的结果,另夕},还可通过方差 分析,了解哪些因素影响较大,以引起重视和注意。 2,2.1试验材料 (1)主要原料及试剂 ①复合碳源:玉米粉、玉米淀粉、可溶性淀粉、麸皮

②单糖和多糖:葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、乳糖 ③醇类:乙醇
④有机氮源:黄豆粉、麸皮、玉米浆、尿素、蛋白胨

⑤无机氮源:硝酸钾、硝酸铵、氯化铵、硫酸铵 ⑥无机盐:磷酸二氢钾、硫酸镁 ⑦生长剂:维生素B
⑧消泡剂:新鲜的食用豆油

⑨检测药品:酒石酸钾钠、硫酸铜、氢氧化钠
(2)主要仪器 ①数显式电热培养箱 上海沪南科学仪器联营厂 上海沪南科学仪器联营厂

②10l一3型电热鼓风干燥箱



江苏大学硕士学位论文 ③手提式压力蒸汽灭菌器 上海华线医用核子仪器有限公司 营口市科兴净化设备研究所 南京纯涯机电技术有限公司 北京赛多利斯天平有限公司 中国科学院上海冶金研究所
EUTECH公司

④FcF一600B食用菌接种净化机 ⑤FCY一3A型高效环境消毒灭菌器 ⑥电子天平
⑦93型在线检测溶氧仪 ⑧ph8000 ⑨海尔冰箱 ⑩DZF一6020型真空干燥箱 (3)供试菌种 金针菇杂交19(flammulina 2.2,2试验方法 1.培养基和培养方法 (1)种子培养 ①斜面培养基PDA

中国海尔集团 上海精宏实验设备有限公司

velutipes):

由镇江食用菌研究所提供

a.麸皮培养基:把麸皮与水按重量比1:1 的比例称好,然后加磷酸二氢钾

0。1%,硫酸镁O。05%,拌匀,分装于试管。 b.加富PDA培养基㈨:马铃薯3%,磷酸二氢钾0.2%,硫酸镁0.8%。
培养条件:21℃培养9天。 ②液体种子培养基 玉米粉3%,麸皮2%,蛋白胨0.3%,葡萄糖2%,磷酸二氢钾0.1%, 硫酸镁0,05%,维生素B,O.01%.豆油0.05%。 培养条件: 取500 ml的锥形瓶装培养基450ml,1.4kg/cm2灭菌75rain,冷却后,在无菌 环境下将斜面菌种割成约O.5*0.5的小块,接种到液体种子培养基中,每支斜面

试管中接两瓶,重复四次。采用通气式培养8天,前四天采用通气量为60Llmin
的气泵,后四天采用通气量85L/min的气泵,25+1℃下培养。然后以此为液体

发酵培养基的液体菌种,以10%的接种量转接新的500m1锥形瓶,方法如上。
(2)10

L发酵罐中液体发酵培养工艺研究

1)培养基



江苏大学硕士学位论文 碳源供试培养基 蛋白胨0.6%,磷酸二氢钾O.1%,硫酸镁 0.05%,豆油0.05维生素B,O,01%,再分别加 入3%的各种碳源。 氮源供试培养基 葡萄糖2%,磷酸二氢钾0。1%,硫酸镁0.05%, 豆油0.0596,维生素B,O.01%,再分别加入3%的 各种氮源。 硫酸镁供试培养基 葡萄糖2%,玉米粉3% 蛋白胨0.3%,磷酸

二氢钾0.1%,维生素B,O.01%,豆油0.05%。 磷酸二氢钾供试培养基 葡萄糖2%,玉米粉3% 蛋白胨0.3%,硫酸

镁0.05%,维生素B,O.01%,豆油0.05%。 维生素B,供试培养基 葡萄糖2%,玉米粉3% 蛋白胨0.3%,硫酸

镁0.05%,磷酸二氢钾0.1%,豆油0.05%。 2)培养条件 试验用培养基,500ml锥形瓶装400ml培养基,接种量为10%,采用通气式 培养6天,前三天采用通气量为60L/min的气泵,后三天采用通气量85L/min的 气泵,25+1℃下培养,每个样品做四个重复,取平均值。 在供试培养基中,添加不同的碳源、氮源,添加不同量的无机盐、维生素B, 观察其对金针菇液体培养的影响。从而选出最佳培养基配方。 3)检测方法

①菌丝球数量的测定㈣’㈣1
取5 ml的发酵液,按比例在量简中加水稀释,摇匀后取lml在直径1.5cm的 培养皿中摊匀,培养皿下垫黑白相间的格纸,用方格计数法计数。

②菌丝球直径的测定㈨?…?㈨
随机取菌球20个,成直线排列,测其总长度,重复三次,取平均值。

③生物量的测定一细胞干重法‘1剐?㈣1‘5¨
取5 m1的发酵液,40目过筛,菌丝体经蒸馏水充分洗涤,80。C真空干燥至恒 重,电子天平准确称重,按下式计算生物量: 式中DCB一细胞干重(kg),V一取样体积佃1) ④pH的测定∞“ 取发酵液5ml,采用便携式pH计直接测量 生物量(kg/m3)=(DCB/V)*106

江苏大学硕士学位论文 2.试验设置 1)培养基的最佳碳源的选择 ①不同碳源对金针菇生物量、菌丝体形态、菌球数的影响 该试验采用在

碳源供试培养基中添加5%的各种碳源,包括葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、玉

米淀粉、麸皮、玉米粉、乙醇,每组试验重复三次,通过细胞干重法测定生物量,通 过菌丝体直径来看其形态大小,通过方格计数法测定菌球数量。
②碳源的不同组合对金针菇生物量的影响 以玉米粉和葡萄糖为碳源,总

含量为5%,设置5:0,4.5:0.5,4:1等10种配比,来研究其对生物量的影响。重 复三次,细胞干重法测定生物量。 2)培养基最佳氮源的选择 ①氮源对金针菇生物量的影响 以上试验采用在氮源供试培养基中添加各

种氮源,其中,无机氮加O.6%,有机氮中蛋白胨、尿素为0.6%,其它有机氮添 加3%,每组试验重复三次,通过细胞干重法测定生物量。 ②麸皮与蛋白胨不同配比对金针菇生物量的影响在氮源供试培养基中添 加麸皮与蛋白胨的不同配比,细胞干重法测定生物量,重复三次。 3)培养基的最佳碳氮比的选择设计十个不同的处理,从而确定最佳的碳 氮比。测定各个处理下的金针菇生物量;并测定初始及终点的pH值。试验重复 三次,记录相应数据。
碳氩比的十个不同的处理(单位:%)
处理


b 4 2 1.5 0.3



d 3.5 2 2 O.3 3 2 2 0.3

f 3 2 2.5 0.3



h 2 2 2 0.3 1.5 2 3 O.3 O



玉米粉 葡萄糖 麸皮 蛋自胨

4 2 l O.3

4 2 2 0.3

2.5 2 2 0.3

1 2 4 3

4)无机盐对金针菇液体培养的影响 ①硫酸镁对金针菇生物量的影响 在硫酸镁供试培养基中添加浓度分别为

0.01%、0.03%、0.05%等8种硫酸镁,测定金针菇生物量,重复三次。

②磷酸二氢钾对金针菇生物量的影响在磷酸二氢钾供试培养基中添加浓
度分别为0.01%、0.02%、0.03%等11种磷酸二氢钾。测定生物量,重复三次。

5)维生素B对金针菇生物量的影响在维生素供试培养基中添加浓度分别
为0.001%、0.002%、0.003%等12种维生素B。测定各个处理的生物量。重复三次。

6)正交试验确定最佳培养基的研究根据以上确定的最佳碳源、氮源、无
12

江苏大学硕士学位论文
机盐及维生素的含量,进行三个水平四个因子的正交试验,每个试验组重复三次, 取平均值。 7)验证最佳培养基试验根据正交试验确定的最佳培养基结果,进行试验 验证,进一步确定最佳培养基的组成。重复三次。 2.2.3培养基的最佳碳源的选择 (1)不能碳氮源对金针菇生物量的影响 碳素是构成菌体细胞和含氮次生代谢产物的重要营养物质,也是食用菌生命 活动所需的主要能量来源”。。由图可知,金针菇对碳源的利用相当广泛,既可以 利用成分复杂的缓慢利用的复合碳源,如玉米淀粉、玉米粉等,又可以利用单糖 和双糖等小分子快速利用碳源,如葡萄糖,麦芽糖等,甚至可以吸收利用醇类,

如乙醇。不能碳源对金针菇生物量影响的试验结果如图2—1所示

图2—1碳源对生物量的影响
在单糖和双糖中,金针菇对葡萄糖的利用效果最好,菌丝干重达到 78.8mg/ml,这正符合V.W.Kakilan报道的,真菌的主要呼吸途径碳源都是以葡 萄糖的磷酸化衍生物方式为其始点的”1;其次是麦芽糖,而对蔗糖的利用效果最 差。这说明醛糖比酮糖更容易被金针菇菌丝利用。 在多糖中,玉米淀粉是金针菇最好的碳源,菌丝干重达到60.80mg/ml,其 次是麸皮、玉米粉,而对可溶性淀粉的利用效果最差,菌丝干重仅为36.80mg/ml。 此外,金针菇对醇类的利用效果是所有碳源中最差的,菌丝干重仅为

14.60mg/ml,大约是葡萄糖的1/5。显然,金针菇的液体培养若用单一的碳源,
从菌丝干重考虑,单糖是葡萄糖最佳,而复合碳源中,玉米淀粉是最好的。从应 用生产实际出发,玉米淀粉的价格远远低于葡萄糖的价格,从而用玉米淀粉的经

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济效益远远高于葡萄糖的经济效益。 (2)不同碳源对金针菇菌丝体的影响 在金针菇液体发酵中,不同的碳源对菌丝体的形态也有重要影响,试验结果

如图2—2。由图可知,不同碳源的培养基对菌丝、菌球直径有重要影响,其中,
复合碳源的培养基能够培养出大量的菌球,且菌球直径较均匀一致,其中菌球直 径最小的是玉米粉培养基,菌球直径平均为2.2mm,其次是麸皮,玉米淀粉,可 溶性淀粉。相比之下,小分子碳源培养基培养出的以菌丝为多,菌球较少。究其 原因,可能是因为复合碳源的成分较复杂,营养成分较丰富,且里面含有较多的 固形物质,从而使培养基的黏度增加。由于在一定的范围内,黏度增大有利于菌 球的形成,过高或过低的黏度都不利于菌球的生长和繁殖。而小分子碳源,由于 其能直接被菌丝吸收利用,在短期内即使菌丝分枝、延伸,菌丝生长以变粗变大 为特征,从而在后期出现营养不足,并引起菌丝内部缺氧,形成较大的菌丝片段, 以致影响了菌球的形成。但观察发现,用葡萄糖等小分子做碳源,在前期菌丝生 长较旺盛,后期可能由于营养不足导致生物量有所下降。所以,可以考虑将复合 碳源与小分子碳源结合起来,效果最佳。

图2—2不I司碳源对菌丝体形态的影响 (3)不同碳源对金针菇球菌数的影响 在碳源选择上,还要考虑碳源对菌球数的影响,结果如图2—3所示。由I郅可知, 复合碳源(除乙醇外)的菌球数明显多于小分子碳源。其中,最多的是玉米淀粉培 养基的菌球数,高达528个/ml,次之的是玉米粉、麸皮、可溶性淀粉;在小分子碳 源中,葡萄糖是最佳的,菌球数达到322个/ml,次之的是果糖、乳糖、麦芽糖,最 差的是蔗糖和乙醇。产生此结果的原因,主要是复合碳源营养更丰富,不仅为金针 菇液体培养提供了碳源,其中还含有某些生长因子,从而更有利于金针菇的生长。 因为菌球数多,可以达到单位体积内有更多的发菌点,更有利于下一级的培养。

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碳源种类

图2—3碳源对菌球数量的影响
(4)金针菇液体培养最佳碳源选择 综合以上试验结果,很容易发现,在复合碳源中,玉米淀粉和玉米粉在生物 量、菌球直径以及菌球数方面都是最佳的碳源,而小分子则以葡萄糖、果糖最佳。 考虑到生产中的成本,本试验确定以玉米粉为复合碳源,小分子以葡萄糖为碳源。 由于复合碳源是缓慢利用的营养物质,而小分子碳源有快速被菌体吸收的特点, 为了相互弥补不足,通过在复合碳源中添加小分子碳源来达到最佳碳源的效果
L58

J,”…。因此,设计yt,米粉与葡萄糖最佳配比的试验。结果如图2—4所示。

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A玉米粉 组合方式B葡萄糖



图2—4碳源的不同组合对生物量的影响
由图可知,当复合碳源玉米粉与小分子碳源葡萄糖的最佳配比为:玉米粉 3%,葡萄糖2%,金针菇的菌丝干重达到82.60mg/ml,比单纯用玉米粉高出

31mg/M,比单纯用葡萄糖高出37mg/ml。其原因是,小分子碳源葡萄糖在前期

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提供碳源,使金针菇在短期内大量生长缩短了停滞期,快速进入生长期:而复合 碳源玉米粉在后期及时的补充了营养,满足了菌丝体的营养需求,使其在对数生 长期、稳定期均有较好的营养条件。从而,两者的最佳配比可以相互补充,使金 针菇的菌丝干重达到最多。另外,通过以上分析不难发现,两者的最佳配比还可 以缩短发酵周期,主要是小分子葡萄糖缩短了停滞期.从而使整个培养过程缩短 8小时左右。由以上分析得知,最佳的碳源即为玉米粉3%,葡萄糖2%,能够达 到最多的生物量,花费最短的培养时间,从经济效益出发,是最符合实际生产的 碳源组合。 2.2,4培养基的最佳氮源的选择 氮源是构成菌体细胞和含氮次生代谢产物的重要营养物质,也是食用菌合成 细胞蛋白质、核酸和酶类的主要原料“1。其功能是作为酶的组成分或维持酶的活

性,调节渗透压、pH值、氧化还原电位等。1。按其化学性质可分为无机氮,主要
有铵盐、硝酸盐、亚硝酸盐等;有机氮,主要包括蛋白质及其不同程度的降解物 如胨、氨基酸等,如黄豆粉、麸皮、玉米浆、尿素、酵母膏、蛋白胨等。不同氮

源对金针菇生物量的影响试验结果如下图2—5。
Rn




1≥



吲 彝 刊

氮源种类

图2—5氮源对金针菇生物量的影响 由图2—5不难看出,有机氮与无机氮比较,金针菇对大多数有机氮的利用效
果较好,可以说,麸皮、玉米浆、黄豆粉、蛋白胨都是不错的氮源,生物量都较 高。但金针菇对尿素的利用效果最差,生物量仅为23.41mg/mh就无机氮而言, 虽然金针菇可以利用,但其效果不是很好,因为使用无机氮源时,菌丝必须利用

16

江苏大学硕士学位论丈
无机氮合成其需要的各种氨基酸,而某些氨基酸几乎或者完全不能生物合成,另 一方面可能的原因是,由于NH十4的利用会使培养基酸化,而NO’3则更易使培养 基pH升高“…,从而导致不恰当的pU值,影响了菌丝的生长,因此,金针菇虽然 能利用无机氮,但生长缓慢,生物量较低。有机氮效果好的原因可能是,有机氮 源中含有丰富的蛋白质、肽类、脂肪酸、维生素、游离氨基酸且氨基酸的种类较 齐全““。“,金针菇能直接利用氨基酸和其他有机含氮化合物中的各种不同结构的 骨架来合成菌体生长所需要的蛋白质和其他细胞物质,而无需从糖代谢的分解产 物中来台成各种所需的物质。另一方面,金针菇在分泌淀粉酶后才能利用培养基 中的缓慢利用碳源物质,在此之前,无机氮源和蛋白胨等快速利用氮源在碳源缺 乏的条件下,有可能部分充当了提供能源的角色”“。…,因此影响了最终菌体生长 阶段对氮源总量的需求。另外,在选择氮源时,还要考虑培养基产生泡沫的情况, 在以上的氮源中,玉米浆、黄豆粉与其它氮源相比,产生的泡沫最多,泡沫的增 多,会使氧传递系数减少,严重时造成大量逃液,发酵液从排气管路或轴封逃出 而增加染菌机会,所以,最佳的氮源是麸皮、蛋白胨。而麸皮是迟效氮源,蛋白 胨是速效氮源,两者的合理配比将会达到最佳的效果。

麸皮、蛋白胨不同配比的生物量曲线图扣_6。

一.【{警一删搽霜
{8∞侣w:8∞i};∞

枣零

◇枣枣











枣。枣。妒枣j枣j枣j妒j寸?
酉弛b含量^麸良B蛋臼胨 图2—6麸皮与蛋白胨不|可阿配比对生物量的影响

由图2—6可以发现,麸皮与蛋白胨的合理配比效果要好于单纯用麸皮,主
要原因是,其即可满足快速氮源的需求,又可提供长期迟效氮源,满足了金针菇 整个生长过程对氮源的需求。在两者的配比中,麸皮为3%,蛋白胨为0.3%的效

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果最佳。 2.2.5培养基的最佳碳氮比的选择

食用菌所需的营养物质之间应有适当的比例,考虑碳源、氮源时,要注意的
是快速利用的碳(氮)源和慢速利用的碳(氮源)的相互配合,发挥各自的优势,

避其所短,选用适当的碳氮比。根据以上碳源、氮源的试验结果,进行最佳碳氮
比的试验,碳源选用玉米粉,葡萄糖,氮源选用麸皮,蛋白胨;培养方式及条件 不变,设计十个不同的配比方案,观察其对金针菇液体培养的影响。分别比较了 不同配比下,对金针菇生物量以及pH值的影响,从而找出最佳的碳氮比。结果

分别如图2—7和图2—8所示。
18 6. 佰 晒 弱 蟠


5.

一_【{等一哪爨州

4.

3. b




































不同的碳氟比

不同的碳氮此 图2—8不同碳氮}旧寸pH值的影响

图2—7碳氨比不同对生物量的影响

通过图2~7可看出,不同的碳氮比对盒针菇的生物量有很大影响,在碳源
在一定的范围内,随着氮源的增加,生物量也随着逐渐增加,当碳氮比为e时(玉 米粉3%,葡萄糖2%,麸皮2%,蛋白胨0.3%),生物量达到最大值。而当氮源一 定时,生物量会随着碳源的减少而减少。但从图不难看出,碳源、氮源并非是越 多越好,其必须有一恰当的配比才。能达到最好的效果。

碳氮比不仅对生物量的影响,从图2—8中发现,其对培养基的pH值也有一
定的影响。测定培养基灭菌后的pH值,发现,氮源过多是,pH值会偏高;而碳 源过多时,会出现pH值会偏低,如图中的起始pH值线所示。不同的起始pH值 导致了培养终点的不同的pH值。可以看出,两条曲线基本是平行的,说明在培 养的过程中,pH值的变化基本是相同的。但是,由于过高或过低的pH值都不利

于菌丝的生长,结合图2—7,可以得出:氮源过多,则菌体繁殖旺盛,pH值偏
高,不利于代谢产物的积累;氮源不足,则菌体衰老和自溶。另外,碳氮比不当

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还会影响菌体按比例吸收营养物质,直接影响菌体生长和产物的形成。从中可以 看出,金针菇对碳的需求要比氮的量多,这是由于碳既做碳架又做能源,所以用 量要比氮多。 2.2.6无机盐对金针菇液体培养的影响 无机盐可为食用菌提供各种重要元素,它们是细胞结构物质元素或作为代谢 过程中许多酶的活性基团或辅基而参与食用菌生长过程新陈代谢的活动旧1 J‘6…, 或者参与次生代谢产物的建成”。。对食用菌生长及新陈代谢过程起着重要的作 用。因此,浓度过高或过底都会影响新陈代谢,从而导致菌丝生长繁殖不良。不 同的食用菌对这些物质的最适浓度要求均不相同,因此在生产中要通过试验预先 了解菌种对无机盐的最适需求量,以达到最佳的促进菌丝生长的效果。 (1)硫酸镁的添加量对金针菇液体培养的影响 镁是某些细胞的叶绿素的组成分,虽并不参与任何细胞结构物质的组成,但 它的离子状态是许多重要酶(如己糖磷酸化酶)的激活剂。而食用菌菌体对糖的

利用进行的糖解途径中催化由葡萄糖到6一磷酸葡萄糖这一反应的己糖激酶需要 M92+,催化由6一磷酸果糖到1,6一二磷酸果糖的磷酸果糖激酶也需要Mg”,
磷酸果糖激酶这一重要的变构调节酶,是糖酵解步骤中的重要的调控点””。如 果镁离子太少,将会影响基质的氧化,还会影响蛋白质的合成““。另外,硫存 在于细胞的蛋白质中,是含硫氨基酸的组成分。硫是构成一些酶的活性基。因此,

设计了在培养基中添加不同比例的硫酸镁的试验,试验结果如图2—9所示。
85
80

{,--I

75

—70

唰 霎65 圳
60 55 0.01 0.03 0.05 0.07 0.09 0.11 0。13

0.15对照

不同浓度的硫酸镁 图2—9硫酸镁对生物星的影响



江苏大学硕士学位论文 由图2—9可清晰看出.与对照相比,添加不同量的硫酸镁会对菌丝生长有 一定的促进作用。当添加量小于O.05%时,随着其含量的增加,金针菇生物量也
成难比例增加,当含量为0.05%时,达到最大值;然后,生物量随着硫酸镁含量 的增加成下降趋势。这说明,低浓度的硫酸镁对菌丝生长有促进作用,高浓度反 而不利于其生长。所以,在金针菇液体培养基中应添加硫酸镁的量为0.05%。 (2)磷酸二氯钾的添加对金针菇液体培养的影响 磷是构成菌体核酸和蛋

白质等细胞物质的必要成分,也是重要的能量传递者,参与一系列的代谢反应”。。 在代谢途径的调节方面,磷起着重要的作用,磷有利于糖代谢的进行,因此它能 促进微生物的生长,磷酸盐在培养基中还具有缓冲作用,但浓度过高,会抑制菌 体的生长。而钾,虽不参与细胞结构物质的组成,但它是许多酶的激活剂,钾离 子能影响细胞的渗透压和细胞膜的透性,它同样能促进糖代谢的进行““。因此, 选用磷酸二氢钾添加到培养基中,会对菌体的生长有~定的促进作用,试验结果

如图2—10:

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磷酸二氢钾的不同{gt度

图2—10磷酸二氢钾对金针菇生物量的影响
由图可看出,磷酸二氢钾的添加会对菌体生长有重要影响,浓度低于0.05%

时,菌体生长会与其成正比例的增加,浓度大于0.05%后,促进效果会逐渐减差,
这说明磷酸二氢钾的促进浓度最佳为0.05%。另外,其也是缓冲液,有助于培养

基维持菌丝所适的酸碱度,有利于菌丝的生长。
2.2.7维生素对金针菇液体培养的影响 维生素是中间代谢系统的主要成分“”。。食用菌为维持正常生长,~般需要

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一种或多种维生素。这些维生素主要是B族维生素。金针菇是维生素Bl、B2的 天然缺陷型…1,在含有维生素B。、B2丰富的培养基上,菌丝生长速度快。因此, 有必要确定出维生素B(BI、B2)的最佳添加浓度以达到获得最多生物量的目的。

试验结果如图2—1l。
85 :80

{75 罂70


50

q矿。矿奄矿。矿々妒々矿。气,。,。,奄,乜p矿
维生素B的浓度

图2—11维生素B对金针菇生物量的影响
由图可知,与对照相比,添加维生素B对菌体的生长有明显的促进作用, 生物量有了显著提高。按本试验的培养基,当维生素B的含量为O.05%时,促进 效果最好。 2.2.8最佳培养基的确定 根据以上的单因子试验中的结果,选择出了最适碳源、氮源、无机盐的含量 以及合适的维生素的含量,进行三个水平四个因子的正交试验,试验因子及水平

向表如表2—1,各处理调pH值为6.5,硫酸镁0.05%,磷酸二氢钾0.05%,维生
素B 0.05%,豆油0.03%。每个试验组重复三次,取平均值,根据正交试验的结 果,确定最佳培养基的组成。 表2一l正交试验各因素、水平表

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表2—2
正交试验设计表及结果
B C D

\\水\列

\乎\号
l 2 3 4 5 6 7 8 9 I




菌丝干重(mg/m1) 数据
74.12 81.25 70.34 79.56 81.87 80.67 76.34 75.98 80.Ol

黼号\≮


l 1 1 2 2 2 3 3 3 225.71 242.12


1 2 3 1 2 3 1 2 3 230.04 239.10 231.02 9.06


1 2 3 2 3 1 3 l 2 230.77 240.84 228.55 12.29


1 2 3 3 1 2 2 3 l 236 238.26 225.90 12.36

II} IIIj Rj

232.33
16.41

(1)因子对指标影响的重要性比较

表2—2中的R代表了各个因子对指标僮的影响程度,培养基的四个因子的
极差大小顺序为 主————_+次
A:D、C:B

这里,

R』值相近的因子用“、”号隔开,而相差较大的用“;”号隔开““。

由极差结果可知,玉米粉含量(A)对菌丝干重的影响最大,因此,在培养 基中要控制好其含量;对蛋白胨(D)和麸皮(c)的含量也要控制;而对葡萄糖 的用量要求就不是很严格了。 (2)因子各水平的比较

在液体培养的过程中,菌丝量越多越好,因此,由表2—2可得,对于A因
子取2水平即3.0%为好;对于D因子取1水平即0.5%为好,对于c因子取3水 平即2.0%为好;对于B因子取2水平即1.5%为好。所以,从极差分析结果来看, 使生物量最大的因子水平组合应是凡、吼、c,、Dt。 (3)因子水平变化与指标值的变化规律 将每个因子各个水平的实际取值按大小顺序在横坐标上标出,再结合相应的

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指标值1., II.,III,的值在坐标平面上描点连线可得图2—12所示图形。
245 240 235

玉米粉A

230
225 220

麸皮C
243 240 238—

蛋白胨D

235
233

230
225

228一

1.50%2.00%2.50%0.10%0.30%0.50%

从图中可以看出,生物量均是先随着因子A,B,C,D的增大而增大,在中间 时达到最大;然后随着各因子的增大而减小。因此,培养基的最佳的组合是A282CzDz。 我们知道,正交试验并不包含各种组合,具有信息丢失现象。在本试验的研 究结果中,即发现A:B:C:眈不包括在正交试验之内,所以笔者又专门进行了验证 试验,按A2B。C:D,的配方进行三次,结果表明是,菌丝干重达到84.78mg/ml,其 明显高于&、&、C。、D;这一配方之下的81.87mg/ml。这说明了金针菇的液体培 养的配方应是mB。C。D。。

小结
1.根据液体培养基的原则和方法,采用单因子试验,优选出适合金针菇液 体培养的碳源是玉米粉和葡萄糖。 2.通过单因子试验,优选出金针菇液体培养的氮源是麸皮和蛋白胨。 3.通过在金针菇液体培养基中添加无机盐添加硫酸镁0.05%,磷酸二氢钾 0.05%,生长因子采用0.05%的维生素B,发现对金针菇液体培养有很好的促进作用。 4.通过正交试验确定培养基的最佳组合为:玉米粉3%,葡萄糖2%,麸皮 2%,蛋白胨0.3%,硫酸镁0.05%,磷酸二氢钾0.05%,维生素B 0.05%,豆油0.03%。

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第3章食用菌发酵工程工艺过程及控制
对于食用菌液体培养来讲,为了获得较多生物量,在最短的时间获得活力最 强的食用菌液体菌种,必须掌握其代谢过程中变化的各种参数,尤其是培养的温 度、pH值、溶解氧、泡沫的消除以及液体培养终点的判断等是食用菌液体培养 的关键条件。只有控制好这些参数并找出最佳条件,才能达到最佳的培养效果。 本章即以金针菇为研究对象,进行金针菇发酵工程工艺过程及控制。具体如下。
3.1

试验材料和方法及设置
(1)试验材料和方法

①供试菌株:金针菇杂交19,镇江食用菌研究所提供。
②液体菌种培养基:以上优化的液体菌种培养基。 ③试验方法:将液体菌种培养基灭菌后在无菌环境下接种,培养方式为通 气式培养。采用单因子试验确定出金针菇杂交19的最佳的温度、pH值、溶解氧 以及泡沫的消除等条件。每组试验重复三次。

(2)试验设置

根据金针菇的生理特点,研究不同温度、pH值、消泡剂

含量等因素金针菇的液体培养的影响,并提出了几种较实用的金针菇液体培养终 点的判断方法。具体如下: ①不同温度下金针菇液体培养的菌丝生长状况:

②不同温度下金针菇液体培养的生物量。 ⑨pH值在金针菇液体培养过程中的变化。
④初始pH值的不同对菌丝形态及生物量的影响。

⑤金针菇液体培养过程溶氧的变化规律。
⑥不同浓度豆油对金针菇液体培养的影响。 ⑦培养天数生物量的影响。 ⑧金针菇液体培养菌种回试管的萌发情况。 ⑨金针菇液体培养过程中糖及生物量的变化。 采用方差分析法、SPSS系统的回归分析方法来分析数据,并建立相关的数

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学模型㈨㈨㈨㈨。

3.2温度对发酵的影响及其控制
温度对发酵有很大的影响。它会影响各种酶反应的速率,改变菌体代谢产物
的合成方向,影响食用菌的代谢调控机制,影响发酵液的理化性质,进而影响发 酵的动力学特性和产物的生物合成。 (1)最适温度的确定 最适发酵温度随着菌种、培养基成分、培养条件和菌体生长阶段不同而改变。 有关资料表明,金针菇为低温型菌类,菌丝在5~28"C范围内生长,超过这一范 围,菌丝生长受到抑制。因而,有必要找出最适发酵温度,即既适合菌体的生长

又适合代谢产物合成的温度。因此,设计不同培养温度试验,结果如表3一l所
不。 表3一l不同温度下金针菇液体培养的菌丝生长状况
温度
(℃)
5 10 15 20 21 25 28

菌球直径
(mm)

菌球数量 (个/m1)
45 63 78 134 178 157 128

生长天数
(d)
14 12 11 9 6 7 8

气生菌丝形态 菌丝干重
(mg/m1)

7—12
6一ll

菌丝艮势稀弱 绒状爬壁差 整齐絮状爬壁 浓密,絮状爬壁 浓密,絮状匍匈爬壁 浓密,絮状整齐爬壁 浓密,短绒状整齐

40.1 53.5 67.1 75.8 82,3 76.2 70.3

6—10 4一lO
2—5 4—9

5一10

从表3—1可看出,最佳处理的培养温度是2l℃~25℃,在此范围温度下,
菌球直径最小,发菌点最多;菌球数量最多,单位体积的生物量最大,气生菌丝 浓密,絮状匍匐爬壁说明其活力最强,而且其所需时间最短,因此,21℃~25℃ 的条件是最符合金针菇菌丝生长的温度。

根据以上的研究结果,进行单因素方差分析,研究在21℃~25。C之间金针
菇液体培养的生物量对温度变化的情况,试验方法同上,每个处理进行五次重复,

所测试验数据表3—2。采用单因素方差分析数据¨o儿“J,结果如表3—3。

江苏大学硕士学位论文 表3—2不同温度下金针菇液体培养的生物量(单位:mg/m1)
处理号
2I℃ 22℃ 23℃ 1 81 23 79,58 77.36 引.18 75.12 2 77.65 82.Ol 82.17 80.3l 74139 3 79.65 81.34 79.98 79.82 80.01 4 78.54 82.13 78.64 77.68 76.35 5 80.93 79.68 75.37 74.69 75.44

24℃ 25℃

表3—3单因素方差分析结果表

方筹分析

从表3—3中可以看出,不同温度下的生物量有差异,这种差异一方面是由
于不同温度造成的,通常称为“条件差异”,它直接影响到生物量的数量。而同 一温度下,不同的重复也出现了不同的生物量,这种差异是由于偶然原因造成的, 通称称为“随机误差”,它对生物量不会有很大影响。组间差异的大小可以用组 间方差表示,组内差异的大小可以用组内方差表示。通过以上数据可看出,组间 方差14.6202大于组内方差4.4365。P值0.03147小于显著性水平0.05,说明 不同温度对生物量的影响具有显著差异。另外,按显著性水平0.05,比较F统 计量与F临界值。3.295436>2.866081。说明不同温度对生物量有显著性差异。

从表3—2中不难看出,22"C时能得到最大的生物基,因此,可以说22。C是
其最佳培养温度。 (2)温度的控制

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对于一级培养的简单装置,可以通过调节室温来调节培养温度;而对于二级、 三级培养来讲,仅仅通过室温是不够的。由于在发酵过程中产生了大量的发酵热, 需要冷却的情况较多。利用手动调整的阀门,将冷却水通入发酵罐的夹层,通过

热交换柬降温,保持恒温发酵。如果气温较高(镇江夏季),冷却水的温度也高,
致使冷却效果差,达不到预定的温度,可采用冷冻盐水进行循环式降温。如出现 要升温时,可用发酵罐夹层的电阻丝加热,来调节温度。从而保证最适温度。
3.3

pH值对发酵的影响及其控制
(1)pH值对发酵的影响 发酵培养基的pH值,对食用菌生长具有非常明显的影响,也是影响发酵过

程中各种酶活的重要因素。培养基中营养物质的代谢。是引起pH值变化的主要
原因,发酵液pH值的变化是菌体代谢的综合效果。由于pH值不当,可能严重影 响菌体的生长。各种不同的食用菌,对pH值的要求也不相同。多数食用菌生长 都有最适pH值范围及其变化的上下限:上限都在8.5左右,超过此上限,食用 菌将会自溶:下限最低为3.3。另外,pH值对液体培养基的稳定性也有~定的影 响。由于pH值的高低对菌体生长的重要影响,因此,最适pH值的确定已成为发 酵成功与否的关键因素之一。从经济效益的观点来说,食用菌发酵培养最好在其 最适生长pH值下培养,这样可以获得更好的效益。 (2)发酵过程pH值的变化 在发酵培养过程中,pH值的变化决定于所用的菌种、培养基的成分和培养 条件。在菌体生长过程中,其本身有一定的调整周围pH值的能力,创造最适的

pH值的环境。但是,如果差距太大,本身的调节能力不能满足要求。因此,必
须努力为其提供最佳pH值条件,而最适pH值是根据试验结果来确定的。试验方

法如下:将发酵培养基用氢氧化钠(先将其溶解到水里,制成氢氧化钠溶液)调 节成不同的起始pH值进行发酵培养,每天采样测定其pH值,并观察不同条件下 的生物量以及菌丝生长状况。试验结果如下图3一l。

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6.5 6

翟5.5
4.5 4 2 3 4 5

培养天投

图3—1pH值在金针茹培葬过程中的变化
由图可看出,起始pH值不同导致培养结束后仍不同,而变化的幅度却不同, 这说明在产生菌的代谢过程中,菌本身有一定的调整周围pH值的能力,使培养 终点的pH值相差不是特别明显。在发酵开始的前天,菌体利用糖旺盛,碳代谢 产生有机酸(如葡萄糖产生酮酸)使pH值下降。然后,菌体合成的蛋白酶等物 质,对氮源的代谢产生了铵等物质使pH值开始回升。此后,pH值丌始缓慢下降, 处于平稳期。在整个过程里,最终的pH值都下降。 (3)最佳pH值的确定 初始pH值的不同还会对菌丝形态及生物量的影响有影响,具体情况见表3—2
表3—2初始pH值对菌丝形态及生物量的影响 菌球数量 初始pH
5 5.5 6 6.5 7

生眭天数
(d) 7 7 7 7 7

气生菌丝形态 菌丝干重
(mg/m1)

终点DH
(个/m1)
4.2 4.5 4.7 4.8 4.8 98 134 157 183 142

浓密,短绒状整齐 绒状爬壁 整齐絮状爬壁 浓密,絮状匍匐爬壁 浓密,絮状整齐爬壁

56.3 68.5 75.6 81.8 71.9

从表3—2可看出,当初始pH值为6.5时,菌球数量最多,且气生菌丝浓密, 能够匍匐爬壁,说明其活力最强,最适合做液体菌种。另一方面,不同的初始 pH值导致生物量也不同,其主要可能是:由于pH值影响酶的活性,当其太低 或太高时会抑制菌体中某些酶的活性时,会阻碍菌体的新陈代谢。一般认为,细

江苏大学硕士学位论丈 胞内的H+或OH能影响酶蛋白的解离度和电荷情况,改变酶的结构和功能,引

起酶活性的改变…。。但培养基的一或OH一并不是直接作用在胞内酶蛋白上,而
是首先作用在胞外的弱酸(或弱碱)上,使之成为易于透过细胞膜的分子状态的 弱酸(或弱碱),它们进入细胞后,再行解离,产生H+或OH一,改变胞内原先 存在的中性状态,进而影响酶的结构和活性。pH值还影响菌体对基质的利用速 度和细胞的结构,影响菌体的生长和产物的合成。pH值还影响菌体细胞膜的电

荷状况,引起膜透性发生改变,因而影响菌体对营养物质的吸收和代谢产物的形
成。正是由于以上原因,导致了不同的pH值产生了不同的生物量。根据以上结 果,不难看出,6.5是其最佳pH值。
85

“r-4

80

唱75

70

裂65

尊60
55

4.5



5.5




6.5



7.5

H,直

图3—2pH散点图
为了能够找出pH值与生物量的定量关系。利用数据表3—3,用SPSS建立数 学模型,其中X为自变量,代表pH值;Y为因变量,代表生物量。根据散点图

3—2,可发现其回归曲线最好是曲线。采用SPSS的曲线拟合里的二次项曲线模
型以及三次项曲线模型及线性模型三种方式进行。根据方差分析表及各条曲线的

拟合数据,得表3—4各拟合曲线的分析表。
表3—3
pH值


pH对生物量的影响
5.5 6.0 6.5 7.O

5.0

l生物量(mg/m1)

56.3

68.5

75.6

81.8

71.9

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表3—4方差分析与曲线拟台的数据表
项目

线性拟合

二次项曲线拟合

三次项曲线拟合

F值、P值

3.64994>O.152l

19 64409>0.0484

22.70224>0.0422

判定系数∥

0,54887

0.95156

0.9578l

调整判定系数

0.39849

0.90312

O.91562

X:4.307,0.0499

X:4.879,0.0395 X3:一4.403,0.0479 Y=一291.291816

自变量X检验t

X:1.910,0,1521

∥:一4 078,0.0552

Y=-440.022857 +87 393999x

拟合方程

Y=17.42+8.9x

+163.528571x +119.128646x‘ -12 885714x‘ 一0.72112lx‘

从方差分析的F、P值可以看出,线性拟合的F与P值3.64994>0.1521, 但曲线拟合中的二次项曲线、三次项曲线的F与P分别为:
19.64409>0.0484;

22.70224>0.0422,说明二次项、三次项曲线拟合的方程较线性更显著。另一方 面,从判定系数群的大小也可以看出,0.95781>0。95156>0.54887,即心> R2:>R2.,因为R2越大,回归方程越精确,所以也就是说二次项曲线、三次项曲 线的回归方程较线性精确。 三条曲线的回归方程如下 直线拟合方程:
Y=17.42+8.9x

二次项拟合方程:Y一440.022857+163.528571x一12.885714x2 三次项拟合方程: Y一291.291816+87.393999x一0.721
121x


从图3—3中同样可以看出,二次项曲线与三次项曲线都有较好的拟合。而
比较二次项曲线与三次项曲线,虽然相差不是很大,但通过以上的各项的比较, 不难发现三次项曲线更好一些。 通过对方程两边求导数,并令其等于零,由二次拟合方程得,当x=6.345344 时,Y取得最大值;由三次项拟合得,当x=6.355886时,Y取得最大值。这说明

江苏大学硕士学位论文 回归方程得出的最佳pH值为6.34—6.36之间,此时得到的生物量最大。

生物量

口Observed *Lir_Iear ▲Quadratic
x Cubic

图3—3各拟合曲线

通过以上的回归方程,即可简便的计算出不同的pH值所对应的生物量,为以
后的应用带来了很大的方便。当然,在选择拟合方程时,最好选择二次项拟合方

程或三次项拟合方程,得到的结果会更准确一些。但从计算简单考虑,选择二次
项拟合会减少计算量,因此,可以将二次项拟合作为最佳拟合曲线。 (4)pH值的控制 通过以上的试验知道,金针菇液体培养的最佳pH值是6.5。如果在培养过 程中.出现较低的pH值,可通过补料的方法来调节,即以生理碱性物质来控制。 它们不仅可以调节pH值,还可以补充氮源。当发酵的pH值和氮含量都低时,补

加氨水,就可以达到调节pH值和补充氨氮的目的;反之,pH值较高,氨氮含量
又低时,就补加硫酸铵。在加多了消泡剂的个别情况下,还可采用提高空气流量 来加速脂肪酸的代谢,以调节pH值。

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3.4溶解氧对发酵的影响及其控制
(i)溶解氧对发酵的影响

在发酵过程中,影响耗氧的因素有以下几个方面:①培养基的成分和浓度

显著影响耗氧——培养液营养丰富,菌体生长快,耗氧量大;发酵浓度高,耗氧 量大。②菌龄影响耗氧——呼吸旺盛,耗氧量大。发酵后期菌体处于衰老状态,
耗氧量自然减弱。③发酵条件影响耗氧——在最适条件下发酵,耗氧量大。
在25。C,i01325Pa下,空气中的氧在水中的溶解度为0.25mm01./L,在发酵 液中的溶解度只有0.22 mmol/L,而发酵液中的大量微生物耗氧速度(耗氧速率)

大于25一100 mmol/L”。,因此,供氧对于好氧微生物来说是非常重要的。金针菇
是好氧性微生物,因此,供氧是必不可少的。另外,溶氧的大小对菌体生长和产 物的形成及产量都会产生不同的影响,并且需氧发酵并不是溶氧愈大愈好,溶氧 高虽然有利于菌体生长和产物合成,但溶氧太大有时反而抑制产物的形成。因此, 为避免发酵处于限氧条件下,需要考查最适氧浓度(optimal concentration),并使发酵过程保持在最适浓度。 (2)金针菇液体培养过程中溶解氧的变化 通过93型全自动溶氧电极在线检测发酵罐溶氧,得出金针菇液体培养过程
oxygen

中的溶解氧的变化规律。从图3—2可看出,在金针菇液体培养的前期,菌丝体
处于适应期,生物量变化不大,溶氧量基本不变。随着培养的进行,菌丝体进入 对数生长期,生物量逐渐增多,溶氧量却随着减少,这一变化趋势一直持续到 140小时。伴随菌丝体浓度的增加,培养液的黏度急剧增加,从而影响了溶氧的 程度,使其低于了20%。J下是由于溶氧的减少,导致了菌丝体因缺氧而自溶和衰 亡,因而生物量下降。因为我们知道,培养液浓度越低,氧溶解量越高,但不能

通过稀薄的培养基来满足氧溶解度,由于菌丝体生长需要足够的营养基质。从这
可以看出,在一定意义上,菌丝体的浓度增加是影响氧传递的重要因素,所以解

决此问题的关键的是增大供氧量,可以通过增加气泵的通气量来解决此问题,此
方法是目前解决高黏度下的氧传递的最好方法。

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: ^*v 古 E V

0Ⅱ卿辟建

埘 霉


∞ ∞伯∞ ∞ 加m



20

40

60

80

100

120

140

160

培养时阳:|

图3-4金针菇液体培养过程溶氧的变化规律

单位:小时

3.5泡沫对发酵的影响及其控制
(1)泡沫的形成及其对发酵的影响 在液体培养过程中,由于培养基中有蛋白类表面活性剂存在,在通气条件下, 培养液中就形成了泡沫。泡沫是气体被分解在少量液体中的胶体体系,气液之间 被一层液膜隔开,彼此不相连通。泡沫的来源有二,一是由于外界引进的气流被 机械地分散所形成;二是发酵过程中发泡性物质,如“蛋白胨、玉米浆”等是主 要的发泡剂。因此,发酵过程产生少量的泡沫是正常的。但是,过多的持久性的 泡沫会影响发酵的正常进行,主要是影响发酵罐的装料系数;造成发酵代谢异常; 导致污染等。所以,在发酵时,要采用适当的方法控制泡沫的增长。 (2)泡沫的消除 根据泡沫产生的两个原因,可知,消除泡沫有两种方法:机械消泡沫法及化 学消泡法。机械消泡沫是利用机械强烈振动或压力变化而使泡沫破裂“…。但此方 法效果不理想,且需要增加设备及动力消耗。而化学消泡法是借助消沫剂降低泡 沫的机械强度或降低泡沫液膜的表面黏度,使泡沫因受力不均匀而破裂。其关键 的技术是消泡剂的选择及其用量。 有关资料表明,豆油具有很好的消泡效果,因此,本试验选择用豆油做消泡 剂,因为豆油不仅用做消泡剂,还可作为碳源和发酵控制的手段,设计不同的浓 度来观察其对金针菇液体培养的影响。培养基配方为:葡萄糖2%,玉米粉3%,

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蛋白胨0.3%,磷酸二氢钾0.1%,硫酸镁O.05%,维生素B,O.01%,在其中添

加不同浓度的新鲜豆油,观察其对金针菇液体培养的影响。具体情况见表3-3。
表3—3不同浓度豆油对金针菇液体培养的影响
豆油的浓度
0.01% O.03% 0.05% 0.07% O.09% O.11% CK

污染率(%)
10 5 0 O O 2 15

菌丝干重(mg/m1)
57.3 68.2 87.6 80.1 73.5 64.9 50.7

菌丝性状 菌球少而大小不均,无绒毛 菌球多但大小不均,少绒毛 菌球多而均匀,直径小,绒毛长 菌球多.但绒毛短 菌球多。绒毛跃短不一 葫球直径偏大,绒毛较短 菌球少,菌丝较多,绒毛少

通过表3—3可知,不同的豆油浓度对金针菇液体培养有重要影响,尤其是
污染率。当其浓度低于0.05%时。污染率均不为零,而大于0.09%时,污染率也 不为零,而且污染直接影响到菌丝的性状。原因是:浓度太低或太高时,泡沫较 多,从而会造成大量逃液,发酵液就会从缝隙等地方逃出而污染杂菌。同时,泡 沫太多,会使菌丝体缺氧,从而形成较大的菌球。另外,由于菌丝体缺氧,也会 导致菌体自溶,结果生物量就会较低,即菌丝干重较小。从以上数据,不难看出, 当豆油的浓度为0.05%时,从各个方面来讲都是晟佳的。 另外,在选择豆油时,一定要用新鲜的。因为油越新鲜,所含的天然抗氧化

剂越多,形成过氧化物的机会少,酸价也低.消泡能力强,副作用也小。植物油
与铁离子接触能与氧形成过氧化物,故要注意油的贮存保管。

3.6发酵终点的判断
(I)发酵终点判断的意义微生物发酵终点的判断,对提高产物的生产能 力和经济效益是很重要的。生产能力是指单位时间内单位体积的产物积累量而 言。生产过程不能只单纯追求高生产力,而不顾产品的成本,必须把二者结合起 来,既要有高产量,又要降低成本。在发酵末期,菌体的分泌能力要下降,产物

的生产能力相应下降或停止,甚至在营养耗尽时,菌体衰老而进入自溶,释放出 体内的分解酶会破坏已形成的产物,因此,必须确定一个合理的放罐时间,需要
考虑下列因素。

江苏大学硕士学位论文 ①经济因素发酵时间需要考虑经济因素,即要以最低的成本获得最大生产
能力的时间为最适发酵时间。在实际生产中,发酵周期缩短,设备的利用率提高。 但在生产速率较小(或停止)的情况下,单位体积的产物产量增长就有限,如果继 续延长时间,使平均生产能力下降,而动力消耗、管理费用支出,设备消耗等费用 仍在增加,因而产物成本增加。所以,需要从经济学观点确定一个合理时间。 ②产品质量因素发酵时间长短对后续工艺和产品质量有很大的影响。如果 发酵时间太短,势必有过多的尚未代谢的营养物质残留在发酵液中。这些物质对下 游操作都不利。如果发酵时间太长,菌体会自溶,释放出菌体蛋白或体内的酶,又 会显著改变发酵液的性质,使一些不稳定的产物遭到破坏。所有这些影响,都可能 使产物的质量下降,产物中杂质含量增加,故要考虑发酵周期长短提取工序的影响。 ③特殊因素在个别特殊发酵情况下,还要考虑个别因素。如染菌、代谢 异常等,就应根据不同情况进行适当处理。为了能够得到尽量多的产物,应该及 时采取措施,适当提前或拖后放罐时间。 合理的放罐时间是由实验来确定的,即根据不同的发酵时间所得的产物计算 出的发酵罐的生产能力和产品成本,采用生产力高而成本低的时间作为放罐时间。 (2)发酵终点判断的方法 对于发酵终点的判断总结起来有六种方法,它们是计算单位体积的菌球数, 计算单位体积的菌丝干重,观察菌球性状,采样回试管培养法,测定还原糖和总 糖以及显微镜观察法。下面详细分析每种方法。研究对象仍为金针菇。

①计算单位体积的菌球数
品,每次抽5ml培养液,将其放 到培养皿(或其他平器)中计数,

从液体的培养的第二天开始,每天抽取一次样
snn

龟400

如果数量太多,可先在量筒内稀宝300

释100倍或其他相应倍数(]§lllml羹200
培养液+9ml水稀释10倍)后,再捆100 取出Iml或5ml进行计数,然后将 其乘稀释倍数即为每ml的菌球
0 1 2 3 4 5 6 T 8 9 IO

培养天数(天)

数。图3—5为金针菇菌球数随培
养天数的结果,从中很容易看

图3—5蔺球数随天数的变化

出,培养的第6天和7天菌球数较多,可以将其作为发酵终点。此方法简单易行
35

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不需要太多的技术,对大多数生产者来说都能做到,是最适用的--it方法。

②计算单位体积的菌丝干重 a.首先采用离心分离技术进行分离:离心分离技术是借助于离心机旋转所
产生的离心力,根据物质颗粒的沉降系数、质量、密度及浮力等因子的不同,而 使物质分离的技术…。。本试验采用的是GTL.16A型高速台式离心机。离心转速 为4000转/min,离心时间为lO分钟。 b.然后将其放到干燥过的滤纸上,滤纸于电子天平上称重,接着一起放于 真空干燥箱进行烘干,温度为60℃,烘干时间为80min,此方法从液体的培养的 第二天开始,每十二时抽取一次样品,每次抽5ml培养液(可与计数采样同时抽 取),比较菌丝干重,当其达到最大值时,说明生物量晟大,可以作为发酵终点 的一个依据。

在试验中,按如上方法测得金针菇液体培养的结果如图3—6。
80

70

60

罢50
恻40

壶。。
20 10 O 0 1
Z J













IO

11

培养天数

图3—6菌丝干重随培养天数的变化 从图中可以看出,在前3天即培养初期,种子接入液体培养基中,菌体处于 适应期,以适应新的环境。细胞进行呼吸作用,利用本身贮存物质合成大分子物

质和所需的能量,菌体个体长大,但没有繁殖新的菌体,此时糖等基质基本不消
耗或消耗很少,培养基处于初始的浑浊状态。经过3天的适应期后,菌体进入生

长期,即大量繁殖新的菌体,代谢逐渐旺盛,碳源、氮源等快速消耗。由于菌体
不断增加,代谢旺盛,耗氧量很快增加,培养基中的溶解氧下降,因此,此时要

加大通气量。否则,会由于缺氧形成直径很大的菌球,可达至lJ3cm左右,大的菌

江苏大学硕士学位论文 球将会使接种不方便,具有发菌点少等缺点,所以应尽量避免氧气不足。随着菌 体的增多,营养物质不断被消耗,培养基逐渐澄清。到第6天时,培养基已经变 的透明光亮,菌体量也达到最多。经过生长期后,到第7天,菌体开始逐渐减少, 菌体衰老,细胞开始自溶,培养基因自溶的菌体而变的浑浊。此时,必须停止培 养。进行扩大培养或低温贮存。

③观察菌球性状
当培养达到最佳时间时,菌球表面会出现毛刺,菌球颜色较淡,菌球分散在培 养基中;培养基非常澄清,且光亮;培养基与菌球不分层。此时,即为发酵终点。 而当发酵时间一旦超过发酵终点,菌球或菌丝就会衰老,菌丝衰老的征象是:菌球 表面毛刺消失而变得光滑:菌丝球颜色由浅变深,培养基因菌丝的自溶变的浑浊, 且菌丝易结合到一起,此时的菌丝体含量不再增加而是迅速减少,因此,其终点应 在菌丝衰老之前。此方法是一辅助方法,最好结合以上方法一起使用。一般以菌丝 含量效果达一定值为指标,再结合菌丝及菌丝球的观察结果为参考指标。 ④回试管法 此方法简单易行,技术要求不高,但必须保证采样时在无菌环境下进行。具 体方法如下:从第二天开始(由于第一天可以肯定不会是发酵终点,这一点是凭 经验确定的),每天采样至I]PDA斜面,每次采样量为一环(太多就会浪费培养基, 只要能看出结果,量是越少越好),每次转4支试管(防止出现特别情况。例如, 抽样时感染细菌等),在相同的培养条件下,观察菌丝萌发情况。本试验的试验 设备为恒温箱,设定培养条件均为22。C的恒温下培养,详细记录情况各支试管的

萌发情况。如表3~4。
表3—4金针菇液体培养菌种回试管的萌发情况
菌球数 培养天数 (个/环)
2 3 4 5 6 7 8 l 2 4 8 10 9 8

菌丝长满试管 (天)
12 lO,5 8 6.5 4 6 8

菌丝萌发 (小时)
12 10 7 6 4.5 5 6.5

菌丝长势 菌丝较淡,细弱 菌丝稀疏,细弱 菌丝较密.洁白,爬壁 菌丝浓密,洁白,整齐爬壁 菌丝浓密、洁白、粗壮,匍匐爬壁 菌丝浓密、洁白、粗壮,爬壁 菌丝较浓,壮弱不一

江苏大学硕士学位论文 通过表3—4,很容易看出,液体培养6天的金针菇,其在PDA里能够很快萌发,
且菌丝菌丝浓密、洁白、粗壮,匍匐爬壁,说明其活力最强;况且其菌球数最多, 发菌点多,生长也最为迅速,此时应作为发酵终点,将其作为液体菌种进行扩大 培养或接入固体种、栽培袋,或冷藏贮存。此方法较简单,易操作,不需要太多 的技术,一般的接种人员即可完成。但是,此方法存在滞后的缺点,因此,是辅 助其它方法的~个实用的简易方法。当然,如果缺少其它的检测发酵终点的办法, 也可作为判断发酵终点的依据。

⑤测定还原糖和总糖
总糖:

3,5-二硝基水杨酸法㈨

还原糖:斐林(Fehling)试剂置换法㈨

由于食用菌是大型真菌,属于真核微生物。而对于微生物来讲,一般都会有 4-I"明显的时期,即:延缓期、对数期、稳定期及衰亡期”…。本试验的目的即是 通过测定液体培养基中的还原糖和总糖,得出金针菇液体培养过程中的对数期以 及稳定期,此时作为发酵终点,可以得到最佳的培养效果。 (1)试验方法:从培养后24小时开始,每隔24小时采一次样,分别测定其 还原糖和总糖的含量,与此同时测定生物量。

(2)结果如图3—7所示

80

∞ 垢 如

70

60召

50窖
40唰

^召/暑5巢锄”擘峨投



so嘉 20枢I
10 0 l 2 3















培养天数 图3-7金针菇液体培养过程糖及生物量的变化

从图3—7可看出,在培养后的2天内,还原糖是随培养时间的增加而增大的,
而总糖是迅速下降。菌丝干重增加较缓慢。这可能是因为培养基中的玉米粉及麸

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皮中所含淀粉,金针菇菌丝体产生的淀粉酶降解,从而增加了培养基中还原糖的 含量。这一阶段可以称为是培养的延缓期,在这一时期,是菌种在新鲜的培养基 中的适应过程,用来调整以适应新环境;并且菌体细胞表现为自身体积增大,少 数菌体分裂。这一阶段的表现在胞外水解酶的合成与分泌、有效矿物质及微量元 素的调整等“…。一般来讲,此阶段的长短与菌种的遗传特性、菌龄及接种前后 的环境有密切关系。为了缩短期,采取转接对数期的菌龄或培养基尽量吻合。因 此,菌丝干重增加不多。

在培养后的3—6天内,还原糖及总糖逐渐减少,而菌丝干重直线上升。这一
阶段称为对数期或指数期,在这个时期中,细胞代谢活性最强,细胞生长旺盛, 每分裂一次所需时间最短,单位时间内细胞数量成倍增加,从而菌丝干重表现为 上升的直线。由于其快速生长,导致了还原糖和总糖的减少,这与生物量的增加 是相对应的。其表现是菌丝顶端生长的方式迅速放射状地向四周延伸,形成分支 状的细胞结构“…。在液体培养基中,菌丝体相互缠绕形成各种形状的菌球。细 胞数量呈现几何级增加,此时,其干重可表示为Xt L/3=x。,”3+kt,式中,t是培养 时间,x。是t时细胞浓度,xo是初始细胞浓度。k为常数,在不同的时期其值不同, 这主要是由于营养物质在菌丝球内逐步耗尽的结果。当菌丝球达到一定的大小以 后,营养物质扩散到菌球中心太慢,以至于不能维持整个菌丝体的无限生长,菌 丝生长只能在菌球表面,内部菌丝则停止生长甚至死亡。正是由于此原因,在液 体培养时,最好是菌丝球直径小些,这样能够保证其活力较强。在此阶段,即可 作为发酵的终点,因为此时的金针菇菌丝体具有较强的活力,且形态、生理和化 学组成特性较一致,所以能够很好的保持其菌种的遗传特性,并且对不良的环境 条件有较强的抵抗力。 在培养6天N7天的阶段内,菌体处于较为稳定的阶段,可以称为稳定期,由 于前期菌体的旺盛生长,培养环境发生了很大的变化,某些营养物质开始缺乏,

代谢产物的积累以及培养过程中产生的有机酸致使pH值变化等因素限制了菌体 的快速生长和分裂。菌丝由顶端生长开始分化成一些特性繁殖器官,从而停止了
细胞的继续延伸,甚至菌球内部分菌丝死亡。此时,使得老细胞死亡数与新细胞 的增长数接近平衡状态,生物量有减少趋势。此时是发酵终点的最后期限,否则

江苏大学硕士学位论文 将会导致进入下个阶段一衰亡期。衰亡期即在稳定期后继续培养,环境条件更不
适合菌体的生长和分裂,细胞的死亡率明显增高,细胞的活性大大降低,这是因 为营养物质的耗尽及一些代谢产物释放,从而改变了菌丝体的正常生长条件,菌 丝体内液泡增大,直观现象是贮藏物开始自溶,菌丝体呈现多种形态,甚至畸形。 此时的总糖增加,可能是金针菇开始分泌多糖所致:因菌体的自溶导致还原糖及 生物量均减少。 综合以上可知,在培养的第6天即可作为发酵终点,才能达到最好的效果, 得到最高的经济效益。

小结
通过以上对温度、pH值、溶解氧、泡沫以及发酵终点五个方面的研究,初步 确定了金针菇液体培养过程中的最佳条件是温度24。C,pH值>b6.5,消泡剂豆油的 浓度为0.05%,溶氧量保持在20%以上。对于发酵终点来讲,培养到第6天;菌丝 干重达到78mg/ml以上;发酵液较澄清,且菌球与培养基不分层。

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第4章金针菇液体菌种的筛选及栽培应用
近年来,金针菇因其味道鲜美且具有一定的增智效果,消费量迅速增加,金 针菇菌种一般采用固体发酵法生产,存在生长周期长、菌龄不一致、操作不方便 等缺点,而液体菌种以其发菌均匀,菌丝萌发早,发菌速度快,菌丝老化慢,菌 龄一致,出菇整齐,结菇密度大等优势成为生产的发展方向。前几章已经进行了 金针菇液体培养的最佳培养基以及生长的环境条件及其控制,本章进行栽培应用 效果的研究。
4.1

适合做液体培养的金针菇菌株的筛选
目前,金针菇的菌株种类较多,但由于液体培养与固体培养的生理条件的变

化,不同的菌株对培养条件及环境有一定的区别,在固体培养条件下好的菌株不 一定适合做液体培养,因此,本文研究了适合此种液体培养方法及条件的金针菇 菌株。 4.1.1材料与方法 1.供试菌种列于表4—1
表4-1供试菌种名称及来源 品种名称
8801

来源 福建三明真菌研究所 福建三明真菌研究所 中国农业大学 中国农业大学

品种名称 白金K 自金01 白金02 黄金针菇

来源 上海农科院食用菌研究所 镇江市食用菌研究所保存种 镇江市食用菌研究所保存种 镇江市食用菌研究所保存种

杂交19 玉雪金针菇 白雪金针赫

2.培养基 (1)斜面培养基:PDA加富培养基:土豆2009,玉米粉209,麸皮509,葡 萄糖209,KH2POn
1 g,MgS04

lg,VB。10片,琼脂209,水1000

ml。

(2)液体种子培养基:蛋白胨0.3%,葡萄糖2%,KH:POlO.1%,MgSO,0.05%, VB,0.01%,玉米粉3%,麸皮2%,水6400ml,pit通过NaOH调节到6.5(即以上优 化的液体培养基)。

江苏大学硕士学位论丈 3.一级烧瓶液体菌种的制作 取500 ml的三角瓶装培养基400ml,I.2kg/cm2灭菌35min,冷却后无菌操作 接种;使用无菌的三管式橡胶塞封口,并用硅胶管连接装有棉花的二连球管作通 气装置。每支斜面试管种接两瓶,贴上标签。重复三次。采用三管式通气式培养, 气泵通气量为60L/min,22+i℃下培养7天。 4.二级10L发酵罐菌种的制作 培养基的制备同一级烧瓶,在无菌条件下,将已培养好的一级菌种接到二级 发酵罐中。每罐装培养基8L,接种量为800ml,置于22+I℃下培养6天,通气
量为85 L/min。

5.接种到栽培袋 将以上的二级液体种作为栽培种,每个品种接100袋,栽培袋规格为15X28 (cm),观察其发菌速度、污染率及菌丝长势。供试栽培袋原料成分如下:棉籽 壳65%,麸皮2396,玉米粉6%,过磷酸钙1%,糖2%,Ca0调酸碱度到6.5,料水

比l:1.02,即含水率57%…3(即以上优化的培养料)。在无菌室采用压差法进
行,每袋接种量为10ml。将接种后的菌袋置于发菌室培养,温度为22一+I℃,观

察不同品种的金针菇的发菌情况。重复3次。
将发好菌的袋放冷库,开袋进行搔菌,而后进行出菇管理。湿度保持85%, 温度保持12+1℃。

4。1。2测试方法
i.菌丝球数量的测定 取5 ml的发酵液,按比例在量筒中加水稀释,摇匀后取iml在直径1.5cm的 培养皿中摊匀,培养皿下垫黑白相间的格纸,用方格计数法计数。 2.菌丝球直径的测定

随机取菌球20个。成直线排列,测其总长度,重复三次,取平均值。
3.生物量的测定一细胞干重法 取5Ⅲl的发酵液,40目过筛,菌丝体经蒸馏水充分洗涤,真空泵抽滤,80"C烘 干至恒重,电子天平准确称重,按下式计算生物量: 生物量(kg/m3):(DCB/V)*1 06

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式中DCB一细胞干重(kg),V一取样体积(m1) 4.pH的测定 取发酵液5ml,采用便携式pH计直接测量 4.1.3一级液体菌种的生产结果 一级三角瓶培养液各项生理指标测定结果与分析:见4—2。 从pH值的测定结果可发现,8个菌株的pH值变化杂交19和玉雪最小,从 pH值的测定结果可发现,8个菌株的pH值变化杂交19和玉雪最小,差值分别 为1.94和1.98,而变化最大的菌株是8801,差值为2.63,其它菌株变化在2.00.2.50 之间。从生物生化的角度可知,发酵液中的pH值的下降是由于菌丝体在培养过 程中产生有机酸等代谢物所致,且品种的不同所产有机物的种类和数量也不同。 另外,发酵液中菌丝球的数量也是杂交19和玉雪最多,均在340以上,且菌丝 球直径在0.5.0.7mm之间,这与培养基的粘滞性和生物物理上的剪切力作用关系 很大。与其它品种相比,其菌丝球体积小,大小均匀,可在短时间获的得较多的 生物量,显然其最适合做液体菌种。从发酵液的色泽和澄清度也可看出,红棕色 的透明清亮的菌液说明菌株对培养液中的营养成分完全吸收,利用的比较充分, 从而生物转化率最高。而发酵液的气味是菇香味,说明培养过程正常,没有污染 杂菌,从而也可以为食用菌菌丝体有效成分的提取等深加工提供可靠的依据。


初DH 终DH

表4—2瓶发酵液生理指标
菌株 白金K 玉雪 白雪 白金01 杂交19 白金02 黄金
880l

项日\
pH变化值 菌球直径(ram)


6.50 4.43 2.07 278 0.8 1,2l 6.50 4.52 1.98 345 0.65 1.36 6.50 4.2l 2.29 249 1.14 0.89 6.50 4.27 2.23 297 1.24 1.26 6.50 4.56 j.94 355 O.59 1,41 6.50 4.17 2.33 301 1.0l 1,28

6.50
4.14 2.36 267 1.09

6.50 3.87 2.63 25l 0.66 O.92

菌丝球个数(个/m1)

l凝丝体于重(mg/mi) 发酵液气味 菌液色泽

0.95

菇香 红棕

菇香 红棕

菇香 红棕

菇香 红棕

菇香 红棕

菇香 十黄

菇香 红棕

菇香 土黄

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1.4二级液体菌种的生产 因为IOL发酵罐是不锈钢容器,难以观察罐内菌丝生长情况,通过发酵时间

和测菌丝球的数量及于重来确定其发酵终点,安排在最佳接种期内转罐或接种, 由于前面通过试验已经确定出发酵终点基本在第六天,所以培养到第六天。不同 发酵时间的菌球的数量如表4-3。
表4-3不同培养时间的菌球数量



\菌株
白金K

L、茁球数\
1 2 3 4 5 6

f天、\∑

玉雪

白雪

白金01

杂交19

自金02

黄金

8801

12 20 58 150 256 278

15 29 53 370 357 369

10 30 56 166 282 289

8 22 50 132 257 264

11 19 60 165 344 384

7 21 5l 156 249 256

lO 25 57 172 267 292

ll 23 46 129 212 237

从表4—3中可清晰的看出,玉雪和杂交19是菌球数最多的。这主要是与自
身的生理条件有关。此项试验表明,玉雪和杂交19在此培养基及环境条件下能 够很好的生长。 4.1.5液体菌种的栽培应用
表4-4栽培袋发苗情况

、\项
白金K 玉雪



品≯\ \
白雪 向金Ol 杂交19 白金02 黄金
8801

菌袋数
100 100 100 i00 100 100 100 100

污染率%
0 2 4 8 0 4 4 10

菌丝长速(cm/d)
1.3 1.1 O.95 1.1 l-2 1.1 1.1 0.87

发菌天数(d)
10 12 14 12 1l 12 12 15

菌丝长势
++++

++

++++

+++

注:菌袋规格为15.28cm,料高度为13cm++++为长势最好,菌丝浓密洁白;+++长势较好 菌丝浓密洁白:++氏势一般,菌丝较淡。
44

江苏大学硕士学位论文 由于发茸情况将对出菇有重要的影响,是出菇的前提条件,导致每个菌株的
发菌情况有一定差别。试验研究发现,污染率低的菌株是玉雪、白雪、杂交19 以及白金K,这说明其抗逆性较强。从菌丝长势看,玉雪和杂交19的菌丝浓密、

粗壮、洁白、旺盛,是发菌最好的菌株。具体情况见表4—4。
4.1.6不同菌株产量及经济性状分析 在相同的环境条件下,杂交19和白金K的产量最高,且其菌盖较小,菌柄 较长,符合高质量商品菇的标准,这是由于培养室c0。的浓度较高。据资料,金 针菇的菌盖随着CO。的浓度的增大而减少,超过1%时,抑制菌盖发育,而且c0。 的提高促使菌柄的伸长“…。因此,为了生产出符合国际标准的金针菇,要适量 的提高cO:的浓度,即减少通风量。子实体的具体经济性状见表4—5。


白金K 玉雪 白雪 白金01

表4-5不同品种子实体经济性状 产量
(g) 104

菌柄长度
(cm) 13-19 13—17 13-17 14—18 13—17 14—19 14一18 10-20

菌盖直径
(mm) 4—8 3-6 3—6 3—7 4—8 3—6 4—9 3—6

菌柄直径
(mm) 2—4 2—4 2—5 3—5 3—5 2—4 3—5 2-4

数量

颜色 (根/袋)
260 245 233 240 253

白色 白色 白色
白色

134
92 102 156 99 11 7 88

杂交19
白金02

黄色 白色 黄色 白色

242 226
180

黄金
880l

从以上对八个品种的金针菇进行液体培养和栽培应用试验效果分析,证明玉 雪和杂交19分别是白色品种和黄色品种中最适合液体培养的菌株。

4.2栽培料的pH值和含水量的优化
由于液体菌种与固体菌种的理化特征的不一致,在栽培方面有一定的区别, 尤其是酸碱度及含水量对其有重要影响,如果其不恰当,将会出现“不吃料”, 即菌丝不向培养料里生长,因此,其已经成为制约液体菌种应用的重要因素之一。 为此,本课题适合金针菇液体菌种的培养料的酸碱度及含水量进行了试验研究。

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4.2.1材料与方法
1.材料

①供试菌种杂交19,由镇江食用菌研究所提供
②液体菌种培养基蛋白胨0.鼢,葡萄糖2%,KH2PO。0.1%,MgSO。0.05%, VBl0.01%,玉米粉3%,麸皮2%,pH通过NaOH调节到6.5

③pH值供试栽培料配方:棉籽壳65%,麸皮23%,玉米粉6%,石膏2%,过 磷酸钙1%,糖2%,含水率60%,通过添加不同量的CaO来调节pH值。
④含水率供试栽培料配方:棉籽壳65%,麸皮23%,玉米粉6%,石膏2%, 过磷酸钙1%,糖2%,pH值,调节到不同的含水率。 2.方法 ①液体菌种的培养:见2.2.2,依照该节的方法确定发酵终点,然后接种。 ②发菌:栽培袋为17x33(cm),厚度为0.05mm的聚丙烯塑料袋。装袋时先 把少的培养料装到袋中,用食指把袋的两个角压入袋内,压紧培养料使之能直立 站稳,并在袋中间放入圆形的木棒,然后继续装料并用手压实,装满后拔出木棒, 在袋中间即有--?L,目的是可以将液体菌种倒入培养基里面。然后将栽培袋常压 灭菌,灭菌冷却后,在无菌环境下接液体菌种,每个处理接100袋,重复3次:

接种量为lOml,于2211℃、湿度为60%一70%之矧的发菌室培养。当菌丝封面后,
菌袋换套换,目的是增加透气性,使菌丝生长更快。并与固体菌种栽培袋作对照。 3.试验设置

①培养料不同pH值的单因子试验:在pH值供试培养料配方中添加不同量 的CaO,调到不同pH值。固体菌种的培养料pH值供试栽培料配方为7.5(即常
规的固体菌种培养料),菌种均为杂交19。每天定时测定菌丝生长量,记录其长 速,观察菌丝性状以及污染率。

②含水率对发菌的影响的单因子试验:通过添加不同的水在含水率供试培
养料中,得出几种含水率处理。固体菌种的含水率为65%。菌种均为杂交19。每 天定时测定菌丝生长量,记录其长速,观察菌丝性状以及污染率。

③双因素试验:将培养料的pH值及含水率做为两个因素,每个因素取三个
水平,水平的选择以单因子的结果为基础,用方差分析法确定两因素对发菌的影
响。

江苏大学硕士学位论文 4.2.2栽培料的pH值对发菌的影响 (1)栽培料的pH值对发菌的影响 由于液体菌种与固体菌种的理化性质有所不同,所以它们对栽培料的酸碱度 需求也不同。在相同的培养环境条件下进行培养,结果却有一定的差别,对固体 菌种而言,一般食用菌生产者采用的栽培料的pH值为7.5,所以将对照组cK取

为7.5,具体情况见表4—6。
表4—6栽培料的pH值对发菌的影响 pH值 污染率
% 6,0 6.5 7 0 7。5 8.0 8.5 CK 4 O 0 O 0 2 3

封面时间 (天)
5 3 4 5 7 8 6

平均日长速
(mm) 12.6 14。4 11.3 9.O 8.1 7.5 6.7

满袋时间 (天)
19 16 21 24 26 29 35

菌丝长势

粗壮,洁白.旺盛 粗壮,洁白,旺盛,整齐 粗壮,洁白,旺盛,较齐 洁白,较壮,强弱不齐 细弱,浅向,茁丝较淡 细弱,菌丝发黄,稀疏 粗壮,洁白,旺盛,较齐

通过表4—6可看出,对固体菌种而言,培养料pH值为7.5是最佳条件,而
对液体菌种而言,栽培料为pH值为7.5时,其长速较慢,满袋时间也较长,这

说明栽培料为pH值为7.5弗不适合液体菌种。我们比较表4—1中的各个处理,
不难看出,栽培料的pH值为6.5的处理,其封面时间最短,仅需3天;平均日长速 最快,达到14.4mm;满袋时间也最短,仅需16天。其次是pH值为6.0和pH值 为7.0的两种处理,其日长速较固体菌种快,满袋时间比固体菌种短,但当pH 值为6.0时,污染率却高达到4%。当液体菌种在栽培料的pH值大于7.5的条件

下,如pH值8.0,pH值8.5时,封面时间比固体菌种还长,虽然目长速较固体
菌种快,但菌丝细弱,稀疏,抗病能力也较弱,当然也不利于出菇。这就说明此 pH值不适合液体菌种的生长。而液体菌种与固体菌种之所以最佳pH值不同,

是因为对液体菌种而言,其在液体培养后的pH值~般在4—5之间,当其接入
偏碱的栽培料上时,会因为酸碱度差距太大而不适应,出现菌丝萎缩,吃料慢以 及生长缓慢等症状,如pH值pH值为6.0为8.5:而液体菌种接到偏酸的培养料 中,如pH值为6.0时,会因为在较酸的环境下,容易感染绿霉菌等喜酸性杂菌,

47

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尽管其长速、长势均可,但因其污染率太高,所以也不太适合作为液体培养料。 总体来看,在恰当的pH值条件下,液体菌种的污染率低于固体菌种,目长速快 于固体菌种,这是由于液体菌种接种迅速,从而污染的机会减少;液体菌种因其 呈流体状,分散的地方多,所以萌发点多,封料面早,满袋时间短,因而成品率

高。综合以上可知,用液体菌种的栽培料的pH值最好是在6.5—7.0之间。栽培
料的pH值是液体菌种应用成功与否的关键因素之一,因此,在生产中必须控制

好pH值在6.5~7.0范围之内。
4.2.3培养料含水率对发菌的影响 由于液体菌种本身含有较多的水,所以对于应用液体菌种的栽培料的含水率 不同于固体菌种的栽培料的,通常采用固体菌种的栽培料的含水率为65%,即料 水比为1:1.49…1。如果培养料的水分不适,将会抑制菌丝正常生长。具体情况

见图4一l。



9 3l

H<

8 7 6 5




莒 旧 辅 赵 一 琶
扣l卜

28竖
叵 25盔 搿 22蟾 趟
19


3 2 , e



16幽




i3凿
i0 f

52

50

54

55

56

57

58

59

60

6I

62

63

64

65

66

含水翠怫)

圈4-1含水率对发菌的影晌

从图4—1可看出,含水率为57%一59%之间时,菌袋的污染率为零,其污染 效果远远好于含水率为65%的固体菌种的菌袋。从封面时间来看,先是随着含水
率的增加而缩短,到57%是达到最小值,此时仅需3天;接着随着含水率的增大 而增加,当含水率为63%时,所需时间最长达8天,而固体菌种需要7天。日长 速的变化曲线是随着含水率的增大,Fj长速增快,在57%时到最大值为15.1mm, 接着长速逐渐下降,但总体上,液体菌种较固体菌种长速快。从满袋时间曲线看

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出,其规律基本与封面时间曲线相同,先是逐渐减少,在含水率为57%时最小仅 17天,然后逐渐增大,而固体菌种所需时间最长为34天。出现以上结果的原因 是,当液体菌种接到培养料里,培养料的水分加上液体菌种的水分导致含水率太 高,这些将引起菌丝吃料慢,还会影响到发菌后菌丝生长缓慢,迟迟不满袋;另 外,含水率过高容易感染杂菌,从而导致污染率提高。对于含水率低的培养料来 讲,由于水分不足,菌丝生长不旺盛,抗逆性较弱,导致生长较缓慢,污染率偏

高。通过以上分析可看出,在用液体液体菌种时,含水率最好控制在57%~59%
之间,能够达到最好的应用效果。无论是从污染率、封面时问还是从日长速以及

满袋时间,液体菌种用在含水率为57%一59%之间的培养料的效果远远好于固体 菌种,仅发菌时间就可提前15一17天,可见其有很好的应用前景。
4.2.4有重复双因素方差分析 在许多实际问题中,往往不能只考虑一个因素的各水平的影响,还必须同时 考虑几种因素的相互影响作用。研究两种因素对试验指标的影响,称为双因素方 差分析“”。而有重复的双因素方差分析指有交互作用的双因素方差分析。因此, 用此方法判断培养料的不同pH值和含水率交叉对发菌的影响。根据以上的单因 子试验确定出栽培料的pH值及培养料含水率,每个因子三个水平,重复2次, 现通过有重复双因子方差分析进行研究““。通过此种方法来确定适合金针菇液 体菌种的栽培料豹成分和水分,为金针菇液体菌种的应用生产作好铺垫,使金针

菇液体菌种真正应用到生产中去。试验结果如表4—7。
表4--7不同pH值和含水率的发菌天数



承攀嘏^八
I 55 II I 60 II I 65 II 24 21 26 19 26 16 19 23 27 21 20 2l 17 22 2l 24 23 20

岔\耋\茁

\\pH

6.O

6.5

7.O

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表4—8方差分析表(口=0,05)

通过以上的方差分析表4—8和表4—9可看出,由于行因素中的P值0.00085
小于显著水平,则拒绝原假设(95%的置信度),也就是说不同的含水率明显影响 发菌天数,同样,列P值0.002547也小于显著水平,说明pH值明显影响发菌天 数。而相互影响的P值0.022795也小于显著水平,说明不同的相互作用下总体 均值有显著差异。从F检验来看,样本(行)的F统计量17.15625大于显著性 水平口=0.Ol的F临界值,说明含水率对发菌天数有非常显著影响,同样,列F 统计量12.46875也大于口=O.01的F临界值,说明pH值对发菌天数也有非常显 著的影响。而交互作用的F处于两个临界值之间,说明交互作用具有显著的影响。

此方法同样说明了培养料的pH值和含水率对液体培养的重要性,其是液体菌种 应用的关键因素。通过试验结果可以看出,含水率为60%,pH值为6.5是最适合
会针菇液体菌种的发菌条件。

4.3金针菇液体菌种与固体种袋栽对比试验
研究液体菌种的目的是应用于生产,进行金针菇液体菌种与固体菌种的栽培 比较试验,目的是对比研究两种菌种的应用情况,从而得出较优的栽培方式。而

江苏大学硕士学位论文 液体菌种的应用方式有二,一是直接应用其接栽培料,另一方式是先将其按麦粒 种,再接栽培料。

斜面菌种——+固体母种——+原种——+栽培种—..接到栽培料中
并进行培养——+栽培管理——+出菇
2.液体菌种的制作及其栽培的工艺流程:

1.常规固体菌种的工艺流程:

斜面菌种——+一级液体菌种的培养——+IOL种子罐——斗60L种子罐

——1接到栽培料中并进行培养叫栽培管理叫出菇
4.3.1试验材料与方法

r麦粒种

,接到栽培料中并进行培养——+栽培管理——卜出菇

金针菇菌种为杂交19,菌盖浅黄,稍内卷,不易开伞。菌柄细长,粗细均 匀。菌丝生长快.出菇早且多,栽培周期短,抗病力强,是适合液体培养的良好 菌株。液体培养的方法同上(4.2),栽培料采用优化的栽培料,固体培养按常规 方式进行。栽培袋为17cmX 33cm的聚丙烯袋,每袋装干料为1509。常舰灭菌。 在栽培管理方面,按正常的管理(即适宜的温度、湿度、通风量、光照)进行。 4,3.2试验方法 液体菌种分为5处理,4个是直接用液体菌种接栽培料,液体菌种分为5、 lO、20、30m14种接种量,分别为处理的1、2、3、4,处理5的栽培种为液体菌 种转的麦粒种,处理6为固体菌种栽培料。每个处理3次重复。同时在2004年 4月1日接到栽培袋。 4.3.3产量比较

试验表明,接液体菌种的产量,都不低于固体菌种的产量。当接种量为10%
时,袋平均产量达161.49,生物学效率为107.6%,麦粒种的袋平均产量为163.59, 生物学效率为109%,而固体菌种的产量为141.79,生物学效率为94.5%。具体

情况见表4—10。

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菌种类型 处理编号 出菇时间 袋平均产量 污染率 生物学效率
1 5/20 143,8 3 95.9 2 5/10

液体菌种
3 519 147.2 2 98,1


麦粒种
5 5,1l 163.5 O 109

固体菌种
6 5/24 14l-7 7 94.5

5/16 142.1 4 94.7

161.4 O 107.6

从表中不难发现,液体菌种的出菇日期要比固体菌种提前,最快的提前达 15天。而且用液体菌种的产量比固体菌种的产量要高,其原因可能是液体菌种 活性强(在适宜保藏期内),液体的流动性使的萌发点增多,菌丝曰长速较快, 从而所需时间缩短。其产量的增加是因为液体菌种的萌发整齐,同时因为液体菌 种的培养基里含有很好的营养物质,增加了培养袋里的营养成分,所以液体菌种 较固体菌种的产量商。 4.3.4子实体质量的比较 加入WTO后,金针菇的销售渠道之一是外贸出口,因此,对质量的要求逐渐

提高,好的质量才有好的效益。表4—7是液体菌种与固体菌种的子实体质量的
对照。 表4一ll液体菌种与阎体菌种的子实体性状比较

金针菇液体菌种袋栽的子实体品质与固体菌种相近。菌盖浅黄,稍内卷,菌
柄黄褐色,有光泽。通过表可看出,液体菌种的子实体的菌柄较长,菌盖的稍大 于固体菌种的。在相同的管理条件下,其差异的原因可能是液体菌种本身的营养

稍好于固体菌种,所以长的较粗壮。但由于菌柄长,更符合高质量商品菇的要求,
尤其做金针菇加工,例如做金针菇罐头。

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4.4液体菌种应用的效益分析
液体菌种作为一种新的技术,具有良好的经济效益,而经济效益是通过各种 生产资识(劳动力、机械、肥料、农药、种子、能源等)的投入和使用价值的产出 来计算的”…。这种生产中投入与产出之间的关系,实质是物质生产资源投入于 一定的农业生产之后,在人的劳动和机械化动力的推动下,借助于各种自然力的 作用所产生的一种物质交换关系。这种物质关系通过价值量的换算,反映为成本

耗费与产品收益之间的经济关系。简单来讲,就是经济效益=所得一所费。液体
菌种的经济效益高在于用其生产食用菌,生产能够按照高产、优质、低消耗的要 求进行。因此,根据前面的应用研究和试验数据,以及对正东生态农业有限公司 的调研情况,本课题以金针菇为例,进行了液体菌种与固体菌种的效益比较,结 果如下表。
表4—12金针菇每千袋液体菌种与圆体菌种生产成本比较(单位:元) 项目 原料费 制袋人工费 接种费 灭菌费 水电费 菌种费 设施折旧费 损耗费 菌袋管理费 采收、包装、销售成本 平均袋产量(g) 销售价格 液体菌种生产
310 300 50 100 50 10 50 100 100 20 400

l刮体菌种生产
310 380 120 80 20 50 20 48 110 30 370

4.5元/kg

4.3元/kg

通过表可以计算得出金针菇液体菌种的每千袋的经济效益Y.为:
Y。=4.5×400X

1000/1000—310—300—50—100—50-10-50—100—100—20=710(元)

而固体菌种的经济效益也可计算,也得出Y:为:

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Y224.3×370×1000/1000~310—380~120—80—20—50一20一48—110—30=423(元) 这是同批次生产所得不同的差异,可以看出用液体菌种生产金针菇的效益可 以比固体菌种提高近二倍。从而,可以得出液体菌种的生产具有良好的应用前景。 下面具体分析液体菌种的优势所在。 (1)降低成本产生的效益 采用液体菌种,每个栽培袋菌种所占的成本为2—3分钱,而采用固体菌种 为1角钱左右。我们以年生产20万袋计,可至少节省菌种投入1.4万元。采用 固体菌种进行生产的污染率都在8%左右,而采用液体菌种污染不到2%,成品 率提高6个百分点,可以增加净收入l-2万元以上。所以,采用液体菌种,降低 成本产生的效益可以达到15.20%。 (2)缩短时间产生的效益 采用液体菌种栽培金针菇,把传统的固体菌种的制种时间由3个多月缩短为 30天,栽培袋的养菌时间仅为过去的一半。由于生产周期的成倍缩短,栽培户 在原有设施不变的前提下可提高栽培批次至少1倍,对原有设施稍加改造,就可 以进行全年候标准化生产。产品提前上市,生产批次成倍提高,其效益当然是成 倍增长。 (3)提高产量产生的效益 经多次试验,采用液体菌种栽培金针菇头潮菇产量提高17%左右,总产量提 高4.25%。以年生产20万袋计,头潮菇和总产量的增加可带来效益3万元以上。 (4)减少用工产生的效益 固体菌种生产需重复拌料、装瓶(袋)、灭菌、接种、养菌,操作复杂,劳 动强度大。而采用液体菌种不但可以省去这些生产环节,而且在接种操作上也比 固体效率提高2—3倍。综合以上各种因素,一个小型栽培户采用液体菌种可比 采用固体菌种减少用工50多个,我们按一个工20元计,那么就可节省1000元: 一个年产100吨的菇场,在采用液体菌种后可减少用工5—7人,年节省开支5万 元左右。 以上分析结果充分证明,液体菌种具有显著的经济效益和社会效益。

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金针菇液体培养只要在适宜的培养条件下生产,所得液体菌种,无论是直接

做栽培种还是做原种,均能达到较好的出菇效果,其中栽培料的pH值为6.5— 7.0,含水率57%—60%最好。而对于金针菇液体菌种来讲,适合做液体培养的菌
株,黄色品种中以杂交19为最好,白色品种中以玉雪最好,这两个品种可以作 为液体菌种生产的看家品种。就生产经济效益而言,1000袋的金针菇,液体菌 种的经济效益达到710元,而固体菌种的经济效益仅423元。因此,可以说,液 体菌种具有很好的应用前途。

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第五章鸡腿菇液体菌种栽培应用
鸡腿菇又名毛头鬼散,属担子菌纲,伞菌目,鬼散科。因幼菇形态似鸡腿而 得名;欧美国家称瓶盖菇,日本称细裂一夜茸。鸡腿菇是~种适应性很强的土生 菌,其菇肉肥嫩,鲜美可1:3,营养丰富,干菇中含粗蛋白质25.4%,含有20种 氨基酸(包括8种人体必需而不能合成的氨基酸),鸡腿菇还是一种药用菌,味 甘滑、性平,有益脾胃、清心养神、助食、治痔和降血糖等功效,可作为糖尿病 患者的辅助食疗。经常食用还能促进儿童智力发育,增强人体免疫力‘21
3?‘3

9|。近

年来,鸡腿菇无论是鲜菇、干菇、罐头均受到欢迎,是具有商业潜力和发展前景 的食用菌新秀。因此,本试验以其为研究对象,进行液体菌种的栽培应用的研究。
5.1

鸡腿菇液体菌种的应用研究

5.1.1材料和方法 1.供试菌株 白鸡腿菇(引自镇江食用菌研究所) 2.原料配方 棉籽壳80%,麸皮16,石膏粉2.4%,尿素0.4%,磷酸二氢钙1.2%,食用菌 三维营养精素1袋,料水比l:1.4。 3.试验方法 (1)原料的处理 将原料按配方加水拌匀,注意加水过程要循序渐进,否则会因一次性加水过 多而流失,不但使用水量无法掌握,而且,流失的水中将带走大量的速效营养成 分,造成不必要的营养损失。然后将其分为三部分,一是建堆发酵,二是常压蒸 汽灭菌,三是先发酵再灭菌,即发酵熟料。 (2)栽培方式的试验 设置了发酵料、熟料、发酵熟料三种栽培方法,每个方法均分两个处理,为 袋栽、瓶栽。其中,栽培袋为17cmX 33cm聚丙烯塑料袋,每种栽培方法装袋50 袋,50瓶,其中,发酵料采用拌料接种,即将液体菌种均匀拌入料中,再装袋、

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装瓶,而熟料、发酵熟料,采用在无菌的环境下,袋栽采用两端接种,瓶栽直接
将液体菌种到入瓶内,然后均放到23。C左右的发菌室发菌。发好菌后,搬入温 室大棚出菇,菌袋脱袋排放,然后采用菜园土进行覆土,覆土厚度为3厘米左右, 进行出菇管理,最后采收。 5.1.2不同栽培料的发菌状况 各个处理的发菌及出菇结果见表5—1。由表可知,发酵料和熟料菌丝生长正 常,且菌丝生长速度较快,而发酵熟料最好。而瓶栽和袋栽的区别不是很明显。 从出菇情况分析,瓶栽和袋栽,不管发酵料还是熟料、发酵熟料,菌丝覆土后都 能正常穿土、正常出菇,且产量较高,生物学效率达70%左右。而发酵熟料栽培, 虽然投资最大,耗能最高,但污染率很低,发菌速度、生物学效率都最高。这主 要是由于经过发酵和灭菌后,杂菌已经完全被杀死,因此,污染率基本为零。但 从生产上来讲,不仅要求污染率低,生物学效率高,还要求耗能少,即以最低的 成本获得最高的利润。因此,综合考虑消耗与所得,即从经济效益最好来讲,发 酵料与熟料均适合做鸡腿菇的液体菌种的栽培,而发酵熟料由于其耗能原因并不 能作为最价生产方式。
表5一l备个处理的发菌及出菇情况 发酵料 处理编号


熟料



发酵熟料





菌丝日氏餐
4.24 4.53 5.98 5.86 6.0l 5.78

(mm/d)

菌丝长势 污染率(%) 现营速度(d) 生物学效率

粗壮、较密、灰白
l 22 69 2 20 70

粗壮、浓密、洁白
1 18 74 1 17 75

粗壮、浓密、灰白
O 18 80 19 85 0

注:a为瓶栽,b为袋裁

经试验研究发现,用液体菌种在发酵料和熟料上栽培鸡腿菇,在相同的环境 条件下,比固体菌种快了20多天,而且菇的经济性状和产量与固体菌种不相上 下,这样,在相同的时间内,可以提高生产的批次,可以提前上市,经济效益会 大大提高。另外,用发酵料栽培鸡腿菇,用液体菌种不需要接种枪,可用拌料方

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式进行,不需要购买任何接种设备,也不需要太多的技术,是最简单最容易操作 的食用菌品种,适合一般的食用菌生产者,所以,液体菌种栽培鸡腿菇具有很好 的应用前景。 其最适的液体培养基配方为:蛋白胨0.3%,葡萄糖2%,KH2P040,1%, MgS040.05%,VBIO.01%,玉米粉3%,麸皮2%。pH为6-6.5,最适宜培养温度为 25。C,通气培养5—6d,通气量为60L/min,菌球赢径3-5mm,菌球数量800个/ml, 菌丝干重1.39/lOOml。根据索洛茂斯提出的观点,适合液体发酵生产菌丝体的 食用菌应具备三大条件:①发酵菌丝体中含有大量蛋白质等营养物质;②能在 简单培养基上很好的生长;③生长速度快且产量高‘绷。因此,鸡腿菇是适合液 体培养的食用菌之一。
5.2

木醋液在液体菌种制备中的应用
木醋液(也叫植物酸)是在木材干熘过程中所得到的具有熏臭味的赤褐色液

体,是一种以酸为主,含有多种物质如醇、酚、酮及其衍生物的混和物m3t‘蚓。近 几年来,国内外有关人士对木醋液有过在农业方面的应用研究,如鲁京兰等研究

了木醋液的抑菌效果㈣;杜相革等研究了木醋液及其主要成分对土壤微生物数
量影…1;张建明等研究了木醋液对水稻产量及氮肥利用效率Ⅲ1。韩国、同本、 我国台湾等地区已将木醋液广泛应用于无公害栽培蔬菜的生产实践之中‘蚍JⅢ’。 但就木醋液对食用菌液体发酵的研究尚未见报导。由于它具有促进植物生长、土 壤消毒、杀菌、防虫、防腐、除草、脱臭等多种作用,所以笔者探讨木醋液对金 针菇液体发酵菌丝体生长的影响。本试验通过在鸡腿菇液体培养基中加入不同浓 度的木醋液,研究其对鸡腿菇菌丝体生长的影响,为今后的生产应用提供理论依 据,现将试验结果报道如下: 5,2.1材料与方法 1.供试材料

①供试菌株:白鸡腿菇,由镇江食用菌研究所提供 ②木醋原液,日本产,由镇江市食用菌研究所提供
③液体培养基配方(优化的培养基):蛋白胨0.3%,葡萄糖2%,K扎POt0.1%,

江苏大学硕士学位论文 MgS040.05%,VBl0.01%,玉米粉3%,麸皮2%。 2.试验方法

①菌球培养:取500 ml的锥形瓶装培养基400ml,1.2kg/cm2灭菌40min, 冷却后无菌操作接种;每瓶接两个lcm2的斜面菌块,使用无菌的三管式橡胶塞封 口,并用硅胶管连接装有棉花的二连球管作通气装置。重复三次。采用三管式通
气式培养,气泵通气量为60L/min,25+1℃下培养7天。

②木醋液实验:分为7个处理,其中1个为对照组,在每个锥形瓶分别添
加木醋液,使其浓度分别为0.01%、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%, 并设1个对照组,每组4次重复,然后接入50ml液体菌种后,如上方法培养7 天,测定其菌丝球数量及生物量。 3.测定方法 (1)菌丝球数量的测定 取5 ml的发酵液,按比例在量筒中加水稀释,摇匀后取lml在培养皿中摊匀, 培养皿下垫黑自相间的格纸,用方格计数法计数。 (2)生物量的测定一细胞干重法 取5ml的发酵液,40目过筛,菌丝体经蒸馏水充分洗涤,真空泵抽滤,80"C烘 干至恒重,电子天平准确称重,按下式计算生物量: 生物量(kg/m:’)=(DCB/V)*10”
5 2

式中DCB一细胞干重(kg),V一取样体积(m1)

2木醋液对鸡腿菇液体培养的影响

i.不同浓度木醋的发酵液的pH值变化及其他生理指标(见表5—2)
表5—2本醋液对鸡腿菇液体培养的影响 木醋液
0.01 0.05 0.1 O.15 0.2 0.25 0.3 CK

浓度(%) 初pH 终pH 发酵液 气味 菌液色泽 菌液澄清 程度 较澄清 澄清 最澄清 澄清 较澄清 较浑浊 浑浊 较浑浊 红褐色 红棕色 红棕色 红棕色 红棕色 土黄色 士黄色 土黄色 菇香味 菇香味 菇香味 菇香味 菇香味 菇香味 菇香味 菇香味
6.5 4.86 6.5 4.49 6.5 6.5 6.5 4.16

6,5
4.12

6.5 4.14

6.5 3.87

4.65

4.27

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首先,从pH值的测定结果可发现,在鸡腿菇液体培养的7个处理中,pH值 的变化相差不大,这符合微生物具有调节自身生存环境的能力,但从总体来看是 下降的,从生理生化的角度来看,发酵液中pH值的下降,是由于菌丝体在培养

过程中产生有机酸等代谢物所致。而各个处理相差不明显说明木醋的添加并没
有对培养液的pH值产生很大影响。
从发酵液的色泽和澄清度也可看出,红棕色的透明清亮的菌液,说明菌株对

培养液中的营养成分完全吸收,利用的比较充分,从而生物转化率最高。发酵液 的气味是菇香味,说明培养过程正常,没有污染杂菌,由于鸡腿菇含有某些长期
有效的保存活力的物质,从而可以迸行鸡腿菇菌丝体有效成分的提取,此条件为 深加工提供了可靠的依据。具体见表5—2。

2.不同浓度的木醋液对鸡腿菇菌丝体生长的影响(见表5—3)
表5-3不同浓度的木醋液对金针菇菌丝体生长的影响 术醋液浓度
0.0l (%) 0.05 0.1 O.15 O.2 0.25 0.3 CK

菌球分布 菌球直径
(mill)

均匀
0.4— 1.0

较均匀
0.3— 1.1

是均匀
0.4— 0.8

较均匀
O.6— 1.2

较均匀
0.6一 1.3

不均匀
0.8一

不均匀
1.O一2,

均匀
0.5— 1.4

1.3

菌丝球数量
746 804 892 722 678 624 534 637

(只/M)

增长率(%) 菌丝体干重

17.0

26.2

40.0

13.3

6.4

—2.0

一16.2



73.62

80.59

87,{29

71.56

65。36

60.41

42.33

64.17

(g/lOOml)

增跃率(%)

14.72

25,59

36.03

11.52

1.85

—5.86

—34.03



不同浓度的木醋液对鸡腿菇菌丝体的生长具有明显影响,其结果见表5—3。 由表5—3可知,当木醋液浓度低于0.1%时,随着其浓度的增大,鸡腿菇菌球数 量及菌丝体干重均成正比例的增加,当其浓度为0.1%时,菌球数最多,达892 只向l,与对照组比较,增长了40%;此时的菌丝体干重最重,达87。27mg/ml,
与对照组比较,增长了36%。当浓度超过0.1%时,菌球数及菌丝体干重则逐渐减

少,当浓度达到0.3%时,与对照组比较,菌球数减少了25%,菌丝体干重减少了 34%。由于木醋液的添加,菌球的直径也小于对照组,而小的直径对于活性维持
有一定的好处,且小的菌球更利于接种,具有更好的流动性。对于木醋液能够促
60

江苏大学硕士学位论文 进菌丝生长的原因,可能是其含有的有机成分达到最佳的组合,麸同起到作用, 其还有待于进~步研究。 为了定性研究木醋液对鸡腿菇生物量增长率之间的关系,现根据表5—0中的

木醋液浓度与生物量增长率(即菌丝体干重增重率)数据进行曲线拟合分析‘矾‘3
们 % 孙




2|。




















咱 一兰阱半粤唰霉州





0.05

0.1

0.15

0.2

0.电5 0.3

0.: 5

木醋液浓度

筠 %




图5一l木醋液对生物童增长率的散点图

通过图5—1可以看出,木醋液对生物量增长率的关系是曲线形式,现用统
计软件SPSS进行瞌线拟合㈨3,结果如下。 表5~4方差分析与曲线拟台结果表
项目

线性拟合
4.85527 0.0698 0.44727 0.66878 0.35515

二次项曲线拟合
17.02425 0.0059 O 87195

三次项曲线拟合
15.23524 0.0118 O.91953 0.95892 0.85917 X:2.712,0,0534

F值 显著性水平f 判定系数R2 复相关系数R 校止判定系数

0.93378 0,82074

X:2.761,0.0398 T,sig.T X:一2,203,0.0698 X‘:一4.072,0.0096 X4:t.538,0.1989 Y--8.763880 Y=4。597433 +629.538445x 一4485.398850x2 +6650.338586x3 X‘:一2.289,0.0840

Y=23.175717

+306.178213x


拟合方程
~127.911073 —1515.1 13992x。



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生物量增长率

口observed 可Linear

*Quadratic o Cubic

木醋液浓度
图5—2本醋液对增长率的拟合曲线 通过表5—4的结果,比较三种线型的复相关系数R、判定系数R2、校正判
定系数,发现三个参数的大小关系均有如下关系:三次项>二次项>线性,由于 复相关系数R、判定系数群、校正判定系数越大回归模型越好,模型估计精度越 高,因此,三条拟合线最适顺序由高到低是:三次项>二次项>线性。各拟合曲

线与观测曲线的对比关系如图5—2。
另外,通过给方程两边求导数,得出最佳的木醋液浓度,结果为:二次项拟 合为当x=0。101041,Y=24。2322;三次项拟合为当x=O.087016时,Y=29.79656

这与前面的单因子确定的木醋液浓度0.01%一O.10%是一致的,说明三次项拟合
曲线达到了较好的预测效果。

小结
通过鸡腿菇液体菌种栽培试验的良好效果,表明了鸡腿菇用液体菌种可以提 高经济效益。通过在液体培养基中添加不同浓度的木醋液,发现木醋液作为一种

生长剂用在鸡腿菇液体培养上,具有低浓度O.01%一0.1%之间可以提高生物量 30%--40%的良好效果。鸡腿菇作为珍稀的食用菌品种,用液体菌种栽培具有简单、
方面、生产周期短,产量高等优点,因此,鸡腿菇的液体菌种应用前景非常广阔。

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第六章液体菌种的贮存和污染的防治
通过以上的研究发现,液体菌种可以用于工业化生产模式集中生产。在商业 化生产过程中,必须解决菌种的贮存问题。当前,制约液体菌种发展的原因之一 是液体菌种的贮存问题。有关资料报道,液体菌种的不足之处是不便贮藏,液体 菌种一旦生产出来,应尽快使用,不能久存…。为了解决液体菌种的保存问题, 本课题进行了低温贮存的试验研究。

6.1液体菌种的贮存
6.1.1材料和方法 1.供试菌株玉雪 引自中国农业大学

2.试验方法根据不同的保存时间.依次制种,制种方法为通气式培养方

法。培养基为优化的液体菌种培养基,培养条件为以上试验得出的最佳条件。将 用锥形瓶培养的一级液体菌种培养好后,在室温22—26℃下分别存放3、5、7、
lO、20、40天,以及在4℃的冰箱保存140、210天,以接固体菌种为对照,在 2004年11月20日同时将不同保存期的液体菌种接栽培袋。栽培袋为17cm×33cm 的聚丙烯袋,每袋装干料200克,采用熟料栽培,无菌环境下接种,每个处理3

个重复。栽培室温度24。C,空气湿度保持6596_72%,在相同的环境条件下管理。

菌丝长满袋后,于10一14℃,空气湿度75%一80%下出菇。观察并记录生长状况。
6.1.2不同保存温度和不同保存期对发菌的影响
表6—1不同存放期对发菌的影响(单位:℃,天,%) 保存温度 菌种类型 处理编号


22—26

2 3



22.26


4 5





7 8

固体种 CK(固 体种)

存放天数 发菌速度 污染率 菌丝氏势



5 22 0



lO 30 1

20 34 5

40 35 15

140 20 O

210 22 O

0 36 5

2l


27


密、粗壮、洁白

稀、细、灰白

密、粗、白

浓、粗

江苏大学硕士学位论文 由表6—1可知,从发菌速度看,处理1,2,7,8较快,仅需要21—22天
即可发满菌袋,CK最慢,需要36天。从污染率来看,处理1,2,7,8未出现 污染,而其他处理均有不同程度的污染,说明常温保存时,超过7天后,菌丝活 力受到一定的影响。从菌丝长势看,只有处理5,6的菌丝稀疏,细弱且灰白, 其他的菌丝均旺盛、浓密且洁白。这说明金针菇液体菌种的活力保持不仅与时间 有关,保存的温度也是其重要的影响因素。其原因可能是低温的情况下(如4。C), 菌丝的新陈代谢活动非常缓慢。使之处于近乎休眠状态。杂菌在低温的情况下也 不易生长繁殖,从而菌丝的活力得以保持并且无污染。 6,1.3不同保存时间对产量的影响表
表6-2不同存放期和温度对菇性状及产量的影响(单位:℃,g.%,cm) 保存温度 处理编号 存放天数
1 3 5340 178 89 0 2 5 5180 172 86.0 3 7 5051 168 84.0

22—26
4 10 4903 165 82.5 5 20 2382 91 45.5 6 40 1534 54 27.O 7 140 5604 187 93.5

4 8 210 5034 168 84.O

22—26

CK(固体种)
0 4320 152 76.O

总产量
袋均产量 生物学效率

通过表6—2可看出,金针菇液体菌种在气温较高的情况下(22—26℃),存
放lO天对菇的产量影响不大,产量之间没有显著的差异,其产量均高于固体菌种

的总产量和平均产量。而在冰箱保存(4。C),菌种保存到210天时其活力仍然较
强,通过表可看出,低温保存140天¥9210天的液体菌种,无论是袋平均产量还是 总产量,均高于相应的固体菌种的产量,而且,与高温保存的相比较,低温保存 120天的液体菌种效果比高温保存3天的效果要好。而高温保存超过10天以后,液 体菌种的应用效果受到一定的影响,在高温保存40天时,虽然也能出菇,但产量 很低,远远低于固体菌种的产量。 由于液体菌种的营养物质条件较好,菌丝生长旺盛,养料积累较多,从而产 量可能要高于固体菌种,因此,其生物学效率较高。在高温保存10天之内的液体

菌种,生物学效率可高出固体菌种的6—13%,而低温保存的210之内的液体菌种, 其生物学效率高出固体菌种的8—17%。所以,对于液体菌种的保存来讲,温度的

江苏大学硕士学位论文 影响大于时间的影响。因此,从生物学效率来讲,在合理的保存温度下,液体菌
种的产量效果要好于固体菌种。 6.1.4不同保存时间对出菇时间及性状的影响 对不同保存时间的液体菌种除了对产量和生物学效率有影响外,还对出菇及

其性状有一定的影响。从表6~3看出。液体菌种在高温保存10天之内的条件下,
出菇时间没有很大的影响。从整体来讲,液体菌种出菇时间较固体菌种提前,即 头潮菇较早。相同条件下,菌种保存时间月越长。出菇越早,但产量越低,这可 能是因为菌体的生理条件发生了~定的变化。另外,菌种保存时间越长,出菇时 间越集中,尤其在低温保存更明显,低温保存210天的液体菌种出菇整齐且集中,

这可能是在保存的过程中,使菌丝处于同一阶段,达到了同步的效果。 从出菇的性状来看,相同条件下(如22—26℃),在适当的保存期内,保存 期越长,其菇盖径越小,菇柄长度越短;从表6—3可看出,在高温保存10天内
和低温保存210天内,其性状均与固体菌种相差不是很大,但菌柄和菌盖稍大于 固体菌种的,其原因可能是液体菌种的营养较好,使其长的更健壮。具体情况见

表6—3。
表6—3不同存放期对出菇时间和性状的影响(单位:
保存温度 处理编号 保存天数 出菇日期 菇盖径 菇柄K
1 3 l/12 4.2 16.6 2 5

am,月/日) 4℃

22—26℃
3 7 4 lO 5 20 6 40 7 140

22—26℃
8 210 l/10 4,3 16.8 CK 0

1/11
4.5 17.3

1/9
4.1 16.4

1/9
3.O 15.5

1/5
2.9 10.1

1/4
3.1 9.4

1/10
4.5 17.1

1/18
3.3 15.7

通过以上的研究发现,液体菌种并非不能保存,关键是保存的条件,最重要 的是保存温度要恰当。根据试验结果可以看出,金针菇的液体菌种在常温下,保 存10天对于出菇等基本不受影响;而低温保存,保存时间可达210天,甚至时
间可以更长,其出菇质量等各方面均没有大的影响。这从根本上解决了液体菌种 难保存的瓶颈问题,突破了当前人们普遍认为的液体菌种不可保存的界限。

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6.2液体菌种生产中的染菌及其防治
污染是影响液体菌种制备的关键问题,也是制约液体菌种应用的难题。因 此,在液体菌种的制备过程中,要严格把守污染关.本部分就介绍一下关于染菌 和防治的一些知识和方法。
6.2.1

染菌对液体菌种生产的影晌

由于液体菌种生产过程均为纯种培养过程,需要在无杂菌污染的条件下进 行。所谓液体菌种生产中的染菌指在液体培养的过程中,生产菌以外的其他微生 物侵入了培养系统,从而使培养过程失去真正意义上的纯种培养。染菌对培养过 程的影响很大,可以从以下三方面来看:一是,染菌对不同菌种的培养过程的影 响不同。由于各种液体培养所用的菌种、培养基以及培养条件、产物的性质的不 同,染菌造成的危害程度也不同。但对于一般的食用菌而言,发生染菌后,由于 培养基中的营养成分被消耗或代谢产物被分解,严重影响到菌丝的生成,使液体 培养的产品的产量大大降低,导致液体菌种的培养的失败。二是,在不同的培养 时间染菌造成的结果也是不同的。在种子培养期染菌,由于此时菌体浓度低,培 养基的营养丰富,比较容易染菌。此时一旦染菌,必须要重新灭菌,重新接种, 否则会造成大批量的损失。在培养前期染菌,菌体主要处于生长、繁殖阶段,染 菌后杂菌会迅速生长,与生产菌争夺培养基中的营养物质,严重干扰生产菌的正 常生长、繁殖及产物的生成。在培养中期染菌,容易导致菌体自溶,产生大量的 泡沫,代谢产物减少,此时的染菌危害最大,最好在生产过程中尽快发现,尽快 处理。而培养后期染菌,由于培养基中的营养物质基本已耗尽,且培养的产物已 较多的积累,如果染菌量不太多,最好停止培养,因为在培养液里,生产菌占优 势,可以将杂菌慢慢地吃掉。 6.2.2杂菌污染的途径和防治 液体培养过程中,染菌污染的途径和防治主要有以下几种: (1)种子带菌及其防治 由于种子带菌而发生的染菌率不是很高,但菌种

的好坏是培养成功与否的前提,种子染菌的原因主要是保藏的斜面试管菌种污 染、培养基和器具灭菌不彻底、种子转移和接种过程染菌以及种子培养所用设备 和装置染菌等。因此,必须对种子染菌进行检查和防治。首先,严格控制无菌室

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的污染,交替使用各种灭菌手段对无菌室进行处理,如紫外线杀菌、离子风机灭

菌、甲醛、双氧水或高锰酸钾等灭菌剂进行处理。然后,对于菌种培养基或器具
进行严格的灭菌处理,例如,用常压灭菌一定要保证灭菌时间达到所需的时间; 而高压灭菌如用高压锅要保证先将锅内的空气排除,再计算灭菌时间,防止造成 假压,导致灭菌不彻底。 (2)空气带菌及其防止空气带菌是液体培养污染的主要原因。要杜绝无 菌空气带菌,必须从空气的净化入手。当前,空气除菌的方法主要有以下几种:

①加热灭菌,即利用空气被压缩时所产生的蒸气中的热来杀灭空气中的微生物, 此方法须考虑空气管道的长度及灭菌,投资较大。②辐射灭菌,即利用各种射
线,如口,z,卢,Y,∥v,超声波等从理论上都能施加能量,使DNA、蛋白质变性,

生物活性物质受损,但实际应用的较少。有较少的用于接种室、无菌室等。③静
电除菌,即使用静电除菌器除去空气中的水雾、油雾、尘埃同时除去空气中的微 生物。此设旌是利用静电引力来吸附带电离子而达到除菌目的,它具有除菌不彻

底的缺点。④过滤除菌,即利用定期干燥介质来阻截流过空气中所含的微生物,
获得无菌空气。此方法是目前最适用的简单易行的方法,因此,在本课题中,就 采用三级过滤除菌,用两个过滤器,过滤介质为干燥的棉花和活性炭,达到很好 的效果。另外,要定期对过滤器进行灭菌处理,并尽量减少生产环境中空气带油、 水,降低空气的相对湿度,保证过滤介质的干燥。 (3)操作过程中染菌及其防止一般而言,操作过程染菌主要是灭菌不彻 底,例如高压时出现“假压”现象。另一方面,在培养过程中泡沫太多而造成逃 逸,很容易造成染菌。因此,必须在培养基中添加消泡剂防止产生大量的泡沫。 本课题中以食用豆油为消泡剂,达到了较好的效果。最后,在采样过程中,必须 注意保证各器具的无菌状态时再进行采样工作。 6.2.3杂菌污染的处理 在液体培养过程,一旦出现染菌,应根据不同的染菌种类、染菌时间以及污

染的程度进行不同的处理。①种子培养期染菌后,则该种子不能进行下一步的 扩大培养,应经灭菌然后废弃,同时对其设备进行灭菌处理,然后重新进行液体 菌种培养。②在培养前期染菌后,如果培养基中的营养物质还较高时,终止培
养,将培养基加热至规定的灭菌温度,重新进行灭菌处理。如果营养物质已被杂
67

江苏大学硕士学位论文 菌消耗较多,可放掉一部分料液,补充新的培养基,重新进行灭菌处理。也可以 采取降温培养。调节pH值、补加培养基等措施进行处理。③在培养中、后期染 菌,可以添加适当的杀菌剂来抑制杂菌的生长,也可以降低培养温度来进行处理。 ④染菌后对设备的处理是必须的,无论是在哪个阶段染菌,在重新使用时,必 须进行彻底的灭菌,当然可以用高温灭菌,也可利用甲醛熏蒸或甲醛溶液浸泡等 方法来处理。

小结
通过对液体菌种的贮存研究发现,温度对液体菌种的影响远远大于保存时 间的影响,对于低温保存如4"C的条件下,保存210天的液体菌种活力仍然较强, 而常温保存如25*(2的条件下,保存20天的液体菌种产量就明显下降。因此,我 们保存液体菌种最好是低温保存,从而也解决了液体菌种的难以保存的瓶颈问 题。而对液体菌种的污染防治,我们必须严格按规范的操作进行,并树立预防为 主的观念。这样,即可解决困扰液体菌种应用的两个难点。

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第七章总结
7.1

全文总结
本论文以金针菇、鸡腿菇为研究对象,采用通气式培养方法,通过单因子试

验、双因子试验以及正交试验,对液体菌种的最佳培养基、最佳培养环境条件、 培养过程及控制、液体培养的染菌及其控制进行了研究,得出培养基的最佳组合

为:玉米粉3%,葡萄糖2%,麸皮2%,蛋白胨0.3%,硫酸镁0.05%,磷酸二氢钾
O.05%,维生素B O.05%,豆油0.03%。通过对不同金针菇品种的筛选,发现杂 交19和玉雪是较适合做液体培养的金针菇菌株。通过液体菌种的栽培试验,得

出金针菇的栽培料的pH值为6.5—7.0,培养料的含水率为57%一60%较好。
通过一系列的试验研究发现,对于食用菌液体培养过程来讲,提高溶解氧的 方法,可以通过增大气泵的供气量来解决氧不足问题。对于培养过程中的气泡, 可以添加消泡剂,豆油的浓度为0.05%时即可达到较好的效果。对于液体培养的 pH值为6.5最好,可以通过添加氢氧化钠来调节。 通过对金针菇液体菌种的贮存试验,发现常温条件(22。C左右)能保存lO 天左右,而低温条件下(4。C左右),保存210天的液体菌种的活力仍很强。从而 解决了目前食用菌液体菌种的瓶颈问题。

本课题还将新型的生长素一木醋液应用到鸡腿菇的液体菌种的制备中,发现
木醋液浓度为0.01%一O.1%时,鸡腿菇的生物量可提高30%一40%,而高浓度的木
醋液对鸡腿菇液体培养却有抑制作用。另外,本课题还进行了液体菌种与匿I体菌

种的对比应用试验,并进行了效益分析,发现采用液体菌种比固体菌种的经济效 益提高15%一20%,充分说明了液体菌种的应用前景。
在课题的研究过程中,充分运用了生物学、化学和工程学、微生物学、生物 化学、细胞生物学、分子生物学等综合知识,通过进行单因子、双因子、多因子 试验,采用方差分析,利用Excel、SPSS等统计工具对数据进行处理,建立了相 关的拟合曲线,为其他用户的应用做了一个铺垫。 本论文研究了食用菌液体菌种的整个工艺过程,从液体菌种的一级制备,一 直到栽培应用,建立了一套完整的液体菌种的工艺方案,真正实现了研究为应用

江苏大学硕士学位论文 服务的目标。

7.2有待进一步深入研究的方向和内容
随着人们生活水平的提高,人们对食物的营养要求越来越高,而食用菌最为

高营养、低脂肪的营养食品将会受到更多人的青睐。因此,对食用菌的产量提出 更高的要求,尽管作者做了大量的工作对食用菌液体菌种的工艺研究,但仍然有
很多工作要做: 1.规模生产与配套应用技术的研究。目前,发酵罐的生产主要是应用于制

药,面对食用菌液体培养来讲,此神发酵罐代价太高,不是很实用。因此,研究
专门应用于食用菌液体培养的发酵罐势在必行。 2.接种枪的设计。对于食用菌液体培养来讲,污染的控制是关键,而接种 过程最容易污染。为了达到快速、无污染的目的,设计新型接种枪是迫在眉睫。 3.液体菌种与工厂化的栽培的配套技术研究。食用菌液体菌种与工厂化是 食用菌发展的必然趋势,两者相互带动,液体菌种的工艺研究已经初有成效,因 此,其配套技术的研究也要一起发展。 4.珍稀食用菌品种的液体培养。对于不同的品种,液体培养的条件是不同 的。目前,对于一些珍稀品种还不能进行人工栽培,因此,可以其研究液体培养 的条件,从而为珍稀食用菌的扩大培养开拓新思路。

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本文是在导师李萍萍教授的亲切关怀和悉心指导下完成的。读研三年期 间,李老师在学业上严格要求、精心指导,从论文的选题、实验方案以及试 验方法的确定,到论文撰写的每一个细节,使我能够顺利地完成论文的各项 工作;在生活上更是给予了无私的关怀和帮助。同时导师渊博的知识、严谨 的治学态度、科学求实不断进取的精神给了我极大的鼓舞;导师正确的育人 方法,教我踏上光明的人生之路,为我以后的人生路打下坚实的基础。在此, 谨向李老师表示衷心的感谢! 指导小组成员毛罕平、吴沿友教授在论文研究过程中提出见解性的宝贵 意见,使我在做课题和论文撰写时思路清晰;在生活中也给予了很大的帮助 和关新,在此特向毛老师和吴老师表示真诚的感谢! 同时感谢镇江市食用菌研究所朱忠贵所长在我试验和论文阶段的支持, 正东生态农业有限公司的员工以及同实验室的胡永光、左志宇、胡建平、卢 泽民老师的帮助;同实验室的王纪章、陈娟、陈歆等同学和所有实验室其他 师兄妹也给予了许多关心、支持和帮助,在此一并表示真挚的谢意。 最后,还要感谢我的家人在我研究生阶段给予的鼓励与默默支持!





二o o五年四月

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江苏大学硕士学位论文

江苏大学硕士学位论丈

江苏大学硕士学位论文

攻读硕士期间发表的论文
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王稳,朱忠贵


李萍萍.芦苇末液体菌种栽培秀珍菇技术研究

中国蔬菜2005年第一

【2】王稳,朱忠贵 [3】王稳,朱忠贵


李萍萍.儿种实用的液体菌种检测方法食用菌2005年第一期 李萍萍.木醋液对金针菇液体发酵的影响江苏农业科学2005年第三

【4]

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食用菌2005

[5]

千稳,朱忠贵,李萍萍.Study
varieties flammutina velutipes

on

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食用菌液体菌种的工艺研究及应用
作者: 学位授予单位: 王稳 江苏大学

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