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全基因组SNP芯片DNA抽提法(CTAB法)


A.准备的试剂和材料: .准备的试剂和材料: CTAB 抽提缓冲液: 2%CTAB, 1.4M NaCl, 100mM Tris-HCl pH 8.0, 20mM EDTA pH 8.0,1%PVP,2% 巯基乙醇(使用前加入) 其他试剂:苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1) 氯仿:异戊醇(24:1) RNaseA 10mg/ml 乙醇/异丙醇 B.提取步骤 .提取步骤 1. 从地里取回的油菜叶片首先置 10%乙醇中漂洗消毒,用蒸馏水冲洗干净后 擦干,用剪刀剪取 0.1-0.2 克(约 2cm2-5cm2)叶片在碾钵中,倒入液氮快 速碾磨成细粉,分装到两管 2ml 离心管中; 2. 加入 65℃预热的 DNA 提取液 700?l,轻磨混匀,将匀浆液倒入相应编号的 2ml 离心管中; 3. 离心管置 65℃水浴锅中保温 1 h,期间上下颠充分混匀溶液,前半小时隔 10min 摇动一次,后半小时每 15min 摇动一次; 4. 取出 DNA 样品冷却至室温, 加入 800?l 的混合液 (苯酚: 氯仿: 异戊醇=25: 24:1) ,轻轻摇动几分钟,待上清呈黄绿色时即可; 5. 室温下 12000 r/min 离心 15 min,吸取上清液通过擦镜纸过滤到新的 1.5 ml 离心管中; 6. 加入等体积混合液(氯仿:异戊醇=24:1)充分混匀进行纯化,12000 r/min 离心 15 min,用枪吸取上清到相应编号的 1.5 ml 离心管中; 7. 加入 2 倍体积无水乙醇,轻轻颠倒混匀,于-20℃静置 40 分钟以沉淀 DNA; 8. 12000 r/min 离心 10 min, 去上清, 再加入 500 ?l 预冷的 75%乙醇洗涤沉淀, 去上清,将两管沉淀合到一管 1.5 ml 离心管中,晾干或者用冷冻干燥机抽 干(约 2 分钟) ; 9. 加入 100ul 的 ddH2O 溶解 DNA, 再加入 0.3% RNase A 去除 DNA 中的 RNA, 于 37℃静置 1h,4℃过夜;(2 毫升的水,加酶 6 微升) 10. 用等体积混合液(氯仿:异戊醇=24:1)再次抽提 DNA 溶液,去除 RNase A,吸取上清(约 80ul) ,再次离心,1min, 经过样品检测后取合适体积的 DNA 样品送样; 11. 吸出 5 微升, 微升用于电泳, 微升用于分光光度计检测 1 2 (稀释倍数 100) , 12. 剩余样品经过无水乙醇沉淀后冻存于-20℃备用。在冻存盒上注明日期、编 号的范围、抽提人姓名等字样。

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C.样品检测 . 用紫外分光光度计检测 DNA 浓度,核酸与蛋白质的比值在 1.8-2.0 之间,DNA 质量用 1%的琼脂糖凝胶电泳检测,在紫外灯下看到明亮、整齐而均匀的条带说 明得到了质量比较高的 DNA,电泳时用 DL2000 做 Marker,每(5 ul)一条电泳 带为 50ng。

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