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RT-PCR详细图文解析


一、实时荧光定量 PCR 原 (一)定义:在 PCR 反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个 PCR 进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 。 (二)实时原理 1、常规 PCR 技术: 对 PCR 扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量,无法对扩 增反应实时检测。 2、实时定量 PCR 技术: 利用荧光信号的变化实时检测 PCR 扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化, 通过 Ct 值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析 3、如何对起始模板定量? 通过 Ct 值和标准曲线对起始模板进行定量分析. 4、几个概念: (1)扩增曲线 :

(2) 荧光阈值:

(3)Ct 值:
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CT 值的重现性:

5、定量原理: 理想的 PCR 反应: X=X0*2n 非理想的 PCR 反应: X=X0 (1+Ex)n n:扩增反应的循环次数 X:第 n 次循环后的产物量 X0:初始模板量 Ex:扩增效率 5、标准曲线

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6、绝对定量 1)确定未知样品的 C(t)值 2)通过标准曲线由未知样品的 C(t)值推算出其初始量

7、DNA 的荧光标记:

二、实时荧光定量 PCR 的几种方法介绍 方法一:SYBR Green 法
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(一)工作原理 1、SYBR Green 能结合到双链 DNA 的小沟部位

2、SYBR Green 只有和双链 DNA 结合后才发荧光 3、变性时,DNA 双链分开,无荧光 4、复性和延伸时,形成双链 DNA, SYBR Green 发荧光,在此阶段采集荧光信号。

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PCR 反应体系的建立及优化: 1、SYBR Green 使用浓度:太高抑制 Taq 酶活性,太低,荧光信号太弱,不易检测 2、Primer:引物的特异性高,否则扩增有杂带,定量不准

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3、MgCl2 的浓度:可以降低到 1.5mM,以减少非特异性产物 4、反应 Buffer 体系的优化 5、反应温度和时间参数:由酶和引物决定 6、其他与常规 PCR 相同 (二)应用范围 1、起始模板的测定; 2、 基因型的分析; 3、 融解曲线分析:可以优化 PCR 反应的条件,对常规 PCR 有指导意义,如对 primer 的评价;可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。 (三)优点及缺点 优点:对 DNA 模板没有选择性;适用于任何 DNA; 使用方便;不必设计复杂探针; 非常灵敏; 便宜。 缺点:容易与非特异性双链 DNA 结合,产生假阳性;但可以通过融解曲线的分析, 优化反应条件; 对引物特异性要求较高。

方法二:TaqMan---水解型杂交探针

**5′端标记有报告基团(Reporter, R) ,如 FAM、VIC 等 **3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) ** 探针完整,R 所发射的荧光能量被 Q 基团吸收 ,无荧光, R 与 Q 分开,发荧光 **Taq 酶有 5′→3′外切核酸酶活性,可水解探针 (一)工作原理

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注意:每扩增一条 DNA 分子,释放一个荧光信号,可以在循环过程中任一点检测荧光 PCR 反应的建立: 1、引物、探针的设计: 探针 Tm 为 68-70℃ ,<30 bp, 5’不能有 G,G 可能会淬灭荧光素, 引物尽量靠近探针,扩增片段<400 bp,引物 Tm 为 59-60℃ 2、反应参数的确定: 一般为:94 ℃,10-20S 60℃,30-60S(Taq 酶 5′→3′外切核酸酶活性在 60℃ 最高) 也可通过温度梯度优化退火温度 72 ℃,45 S, 3、优化引物和探针浓度:获得最小 Ct 值,信号/背景比值的最大值 引物浓度:50-900nM 探针浓度:50-250nM 4、其他与常规 PCR 相同 (二)优缺点 优点: 对目标序列的高特异性 ------阴性结果确定 设计相对简单 ------与目标序列某一区域互补 重复性比较好 缺点: 只适合一个特定的目标; 委托公司标记,价格较高; 不易找到本底低的探针

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