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RNA干扰技术


RNA
干扰技术

前言
真核细胞中存在着许多非编码RNA(non-coding RNA , ncRNA).这是一类不编码蛋白质但具有重要生物学 功能的RNA分子。
长链非编码RNA:复杂的生物学功能 非编码RNA 核内小RNA(snRNA) 核仁小RNA(snoRNA) 胞质小RNA(scRNA) 催化性小RNA(核酶) 小干扰RNA(siRNA) 微RNA(miRNAs)

短链非编码RNA

一、相关试验

目录
CONTENTS

二、RNA干扰技术的作用机制

三、RNA干扰技术的特点

四、RNA干扰技术的应用

相关试验
PART 01

RNA干扰的发现
1995年,康奈尔大学的Su Guo博士在试图阻断

秀丽新小杆线虫的par-1基因时,发现了反义RNA和正
义RNA都能切断par-1基因的表达途径。这与传统上对 反义RNA技术的解释正好相反。
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正义RNA
携带了遗传信息, 可以直接翻译成 蛋白质的RNA。 Eg: mRNA

反义RNA
与正义RNA互补配 对的RNA分子,不 能直接用来翻译 成蛋白质的RNA。

?秀 ?丽 ?隐 ?杆 ?线 ?虫

RNA干扰的发现

1998年,华盛顿卡耐基研究院的Fire等首次在秀丽新小杆线虫中证明上述现象属于

转录后水平的基因沉默。他们发现Su Guo博士遇到的正义与反义RNA均可阻断基因
表达的现象,都是由于体外转录所得的RNA中污染了微量双链RNA而引起。
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纯化单链RNA:基因抑制效应十分微弱

体外转录所得RNA
纯化双链RNA:高效特异性阻断相应基因的表达

RNA干扰 (RNAi)

dsRNA及其产生方法 双链RNA(Double-stranded RNA, dsRNA),双链核糖核酸。

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RNA病毒入侵

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转座子转录

外源基因导入

基因组中反向重复序列
(inverted repeats)转录

RNA干扰技术的作用机制
PART 02

RNA干扰技术(RNAi)

RNAi的作用机制 1.起始阶段
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RNA干扰(RNA interference , RNAi ) 是通过小干 扰 RNA(small interference RNA , siRNA)造成目的 mRNA特异性降解, 从而使基因转录后 沉默的一种现象.

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2.效应阶段 3.级联放大阶段

1)起始阶段

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dsRNA分子在细胞内被一双链 RNA酶Ⅲ型内切酶也叫

Dicer酶剪成 21~ 23nt大小的小干扰RNA(siRNA)。

1)起始阶段

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研究认为在3′ 端带有2个碱基突出的黏性末端, 5′ 为磷酸基

团的siRNA诱导的RNAi效应最强。

2)效应阶段

?RNA诱导 沉默复合物形成

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生成的siRNA和RNAi特异性酶,如AGO-2、RED-1、DNA-RNA螺旋酶等 结合形成RNA诱导沉默复合体RISC。(RNA-inducing silence complex, RISC)

2)效应阶段

?效应阶段

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siRNA引导RISC识别靶mRNA,其中的反义链与靶mRNA互补结合,正义链则 被置换出来。继而,RISC复合物中的核酸酶在靶mRNA与siRNA结合所形成 的双链区的5’起始端下游7~ 10nt处切断mRNA。

3)级联放大阶段

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3)级联放大阶段
此阶段以siRNA中的一条链为引物, 以靶mRNA为模板,在RNA依赖性RNA聚 合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RDRP)的作用下,扩增产生足 够数量的新的二级dsRNA作为底物提供给 Dicer酶,产生更多的siRNA,从而使效应阶 段反复发生,一个完整的mRNA被降解成多 个21~23nt的小片段,从而导致相应的基因 表达沉默。

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RNAi作用机制总结

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dsRNA


RNA诱导沉 默复合体 RISC

效应
反义链互补结合 核酸酶切断mRNA


RDRP扩增dsRNA 效应阶段反复

siRNA

RNA干扰技术的特点
PART 03

RNAi特点

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高特异性

RNAi是转录后水平的基因沉 默机制,有高度的序列特异性,19nt 的dsRNA几乎可以完全抑制基因的 表达,而其中的1nt突变后,它对基因 的抑制作用就消失了,这种高度的序 列特异性能够使dsRNA非常特异地 诱导与之序列同源的mRNA降解,避 免降解与目的mRNA同家族的其他 mRNA从而实现对目的基因的精确 沉默。

RNAi特点

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高效性

RNA存在级联放大效应,效应阶段可以 循环发生,使相对很少量的dsRNA分子(数量 远远少于内源mRNA的数量)就能产生强烈 的RNAi效应(每个细胞仅需几分子siRNA就 可产生RNAi效应),并可达到缺失突变体表 型的程度。相比普通的siRNA,具有短发卡 结构的双链RNA产生的RNAi效应更强。

RNAi特点

01
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02
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03
可传播性

浓度时间依赖性

高稳定性

04
可遗传性

05
靶基因位点的高选择性

RNA干扰技术的应用
PART 04

RNAi的应用

?在基因功能研究中的应用

针对某已知基因,设计可诱导其
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沉默的dsRNA,通过合适的手段导入 细胞或机体,使该基因表达水平下降 或完全沉默,从而了解该基因的功能。

RNAi的应用

在疾病治疗研究中的应用
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利用RNA干扰技术可以特异地沉默 与疾病有关的内源或外源基因,或者沉默 致病过程中与一些中间代谢产物的合成、 分解有关的蛋白基因,而不会对个体的生 长发育产生影响, 这一特性为 RNA 干扰 在疾病治疗上的应用开创了广阔的前景。

RNAi的应用

在植物抗病毒研究中的应用
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利用RNA干扰赋予植物病毒抗性, 人为将与病毒同源的dsRNA导入植物体, 基于植物体的RNA干扰机制对病毒基因 组进行特异性切割降解, 阻止病毒的复 制扩散,从而保护植物体不受病毒危害。

?文献查阅网址

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file:///C:/Users/xindi/Desktop/RNA干扰技术/RNA干扰技术 的原理与应用_孙平.pdf https://wenku.baidu.com/view/63ed4d55cc17552707220867 .html?from=search file:///C:/Users/xindi/Desktop/RNA干扰技术/RNA干扰技术 在几项研究领域的应用_燕飞.pdf https://wenku.baidu.com/view/7daf6bfca1c7aa00b42acb06. html

感谢聆听


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