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遗传学实验指导1


遗传学实验指导
实验 1 细胞有丝分裂与减数分裂 实验 1.1 植物根尖细胞有丝分裂过程的制片与观察
目的要求 学习和掌握植物细胞有丝分裂制片技术; 观察植物细胞有丝分裂过程中染色体的形态特 征及染色体的动态行为变化。 实验原理 有丝分裂是植物体细胞进行的一种主要分裂方式。 有丝分裂的目的是增加细胞的数量而 使植物有机体不断生长。在有丝分裂过程中,细胞核内的遗传物质能准确地进行复制,然后 能有规律地均匀地分配到两个子细胞中去。植物有丝分裂主要在根尖、节间、茎的生长点、 芽及其它分生组织里进行。将生长旺盛的植物分生组织经取材、固定、解离、染色、压片等 处理即可以观察到细胞内的有丝分裂图象。如若需要进行染色体计数,则需进行前处理,即 取材之后采用物理的或化学的方法, 阻止细胞分裂过程中纺锤体的形成, 使细胞分裂停止在 中期。 这时, 染色体不排到赤道板上, 而是散在整个细胞质中。 这十分便于对染色体的形态、 数目进行观察。 试剂和器材 1 材料 均可以大蒜(Allium sativum 染色体数目 2n=16)、玉米(Zea mays 染色体数目 2n=20)、 洋葱(Allium cepa 染色体数目 2n=16)或蚕豆(Vicla faba 染色体数目 2n=12) 等根尖为实 验材料。 2 试剂 95%乙醇、冰乙酸、石炭酸品红、l mol/L HCl。 3 器材 恒温培养箱、显微镜、水浴锅、载玻片、盖玻片、单面刀片、镊子、培养皿、量筒、吸 水纸。 操作方法 1 生根 植物根尖是植物的分生组织,取材容易,操作方便。植物根尖细胞分裂旺盛,因此,它 是细胞有丝分裂相制备与观察的理想选取部位。大蒜、洋葱易于在水培、沙培、土培条件下 生根。采用水培时要注意在暗处培养,以满足根生长条件,使根系生长旺盛。玉米和蚕豆种 子可先用温水浸泡 1 天之后, 再转入铺有多层吸水纸或纱布的培养皿中, 上面盖双层湿纱布 置于 24~26℃温箱中培养,每天换水二次。 2 取材 待根长至 l.5~2.0 cm 时,将根取下。若实验只需观察细胞有丝分裂的过程和各时期的特 征,可将根尖直接放入 Carnoy 固定液(95%乙醇:冰乙酸=3:1)中固定;如果要观察染色体 形态和数目, 则必须对根尖进行前处理后才能固定。 取材和固定必须要在细胞分裂高峰期进 行,即分裂细胞占细胞总数最大值时进行,这样分裂细胞比例大,便于选择和观察。 不同的植物在不同的环境条件, 其细胞分裂高峰的时间是不同的。 大蒜和洋葱的细胞分 裂高峰期通常是在上午 9~11 点,下午 15~17 点左右。 3 前处理

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前处理的方法一般采用低温处理和化学药剂处理。 (1)低温处理:将取材的根尖放入盛有蒸馏水的烧杯或其它容器内,放在 1~4℃的冰箱 或其它低温条件下处理 24h。不同的植物对低温的敏感程度不同,效果也不同。对低温较为 敏感的植物是小麦。 (2)化学药剂处理:常用的药剂有 0.05%~0. 1%的秋水仙素水溶液;饱和对二氯苯溶液; 0.002~0.004 mo1/L 8—羟基喹啉等。 秋水仙素溶液对纺锤体的抑制效果最好, 一般在室温条件下处理 2~4h 可达到理想的效 果。如果处理时间过长,染色体会变得更短,不利于对染色体结构进行研究。 对二氯苯和 8—羟基喹啉对不同的植物效果也不相同。植物染色体数目多,个体小的适 合于使用对二氯苯; 而染色体中等长度的更适合于 8—羟基喹啉, 同时能使缢痕区更为清晰。 4 固定 固定是指用化学药剂将细胞迅速杀死的过程。 固定的目的是为了把细胞生活状态的真实 情况保存下来,避免在对细胞操作中使生活状态发生改变。植物常用的固定剂是 Carnoy 固 定剂。Carnoy 固定剂是用 3 份 95%的乙醇和 1 份冰乙酸配制成的。这二种药品都具有迅速 穿透细胞致细胞死亡的特点,但是乙醇是脱水剂,可使细胞脱水变形;冰乙酸又是一种膨胀 剂,可使细胞膨胀改变生活状态,把这二种药品按照 3:l 配制使用,既可达到迅速杀死细 胞又可保持细胞真实生活状态的目的。 固定的时间可根据被固定的材料大小而定,根尖组织固定 4~24h 可达到固定效果。固 定时间过长,可去掉细胞中的一些脂肪油滴等,便于染色体观察。但是由于固定时间过长, 材料易变脆、变硬,给实验操作带来一定困难。 5 解离 解离的目的是将分生组织细胞之间的果胶质和纤维素等物质破坏掉, 便于在制片过程中 细胞容易散开。常用的解离方法有二种: (1)酸解:将 l mol/L HCl 放在 60℃恒温水浴锅中预热,当 HCl 温度达到 60℃时,将根 尖放入 HCl 溶液中。解离的时间要根据材料来确定。大蒜、洋葱是百合科植物,纤维素、 果胶质的含量相对较低,解离时间约为 4~5min。如果是禾本科植物的根尖,酸解时间要相 对加长些。解离时要注意观察,如果解离时间过长,分生组织会与伸长区脱离,这时分生区 已经被解离过软,很难操作,而且染色效果不好。 (2)酶解:酶解时根尖的伸长区要去掉,只留下分生区。酶的浓度以果胶酶和纤维素酶 分别为 2%~3%为宜,等量混合后使用。酶解时温度条件非常重要,温度与解离时间成反 比,温度高,解离时间就短,但是温度不得超过 45℃,否则酶会失去作用。 6 水洗与低渗 解离后的材料要用清水或蒸溜水冲洗 3~5 次;酶解的材料洗后还要在水中浸泡 10~ 15min。水洗的另一个作用是后低渗,对于压片有好处。水洗时一定要洗净,否则会影响染 色效果。 7 染色与压片 取根尖分生组织的 1/3 左右置于载片上,先用镊子或解剖针将分生组织碾碎,尽量铺 开。 然后, 再滴上石炭酸品红染液, 染色 5 min 左右; 醋酸洋红或醋酸地衣红要染 15~30 min。 为了增强染色效果,可在酒精灯上加热几秒钟后继续染一段时间。压片时先盖上盖片,在没 有用力压之前,先用手固定住盖片,用镊子尖在材料部位垂直轻敲几下之后,再用拇指用力 按压盖片。 8 镜检 压好的片子要先放在低倍镜下观察,寻找不同分裂时期的典型细胞分裂相,然后,再转 换成高倍镜观察。 注意观察细胞核内染色质与染色体结构的特点。 选择典型的细胞分裂相绘

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图。 9 永久装片的制作 将制作好的片子放在冻片机上或液氮容器中将片子冻透, 之后迅速用双面刀片将盖片揭 开。空气干燥后,用二甲苯透明,再用中性树胶或加拿大树胶封片。冻片子时至冻透为止, 切不可时间过长,否则细胞会冻裂。封片时要注意胶量不宜过多,树胶既能达到盖片的边缘 又没有多余是最适量的。 思考题 参照显微镜的观察结果,绘制一套较为完整的植物根尖细胞有丝分裂过程的示意图。

实验 1.2 玉米细胞减数分裂过程的制片与观察
目的要求 1 学习和掌握植物细胞减数分裂制片方法。 2 了解植物生殖细胞的形成过程及减数分裂过程各期的细胞学特征。 实验原理 减数分裂是生物在形成配子时的一种特殊的分裂方式。减数分裂是在性母细胞中进行 的。 减数分裂的结果是使二倍染色体数减为单倍染色体数, 以便两性配子结合时恢复形成二 倍体生物。减数分裂的特点是性母细胞染色体只复制一次,然而连续进行两次细胞分裂(即 减数第一次分裂和减数第二次分裂) ,结果一个小孢子母细胞形成四个小孢子,每个细胞只 含单倍数染色体,使原来细胞中的染色体数目减少一半。因此,将这种细胞分裂称为减数分 裂。减数分裂的另一个特点是前期特别长,而且变化复杂,其中包括同源染色体联会、交换 与分离等。 试剂和器材 1 材料 玉米(Zea mays 染色体数目 2n=20) 2 试剂 95%乙醇、冰乙酸、硫酸高铁铵、苏木精。 3 器材 酒精灯、镊子、解剖针、50mL 烧杯、10mL 烧杯、载玻片、盖玻片、吸水纸、量筒、 显微镜。 操作方法 1 取材 采集正处于减数分裂时期的玉米雄花,此时雄花序尚未抽出旗叶,约 10 cm 长左右。用 手摸植株的上部(喇叭口下部),有松软弹性感觉,便可将旗叶一起抽出,扒开旗叶,剥离出 雄花序。取材的时间一般应在上午 8:30~10 :30,下午 2 :00~4:00 为宜。取材时透过颖片可 看到花药,如果发现花药是黄颜色的,说明减数分裂已经结束,取材已晚。 2 固定 将采集来的玉米雄花序放入新配制的 Carnoy 固定液(3 份 95%乙醇 : 1 份冰乙酸)中 固定一周(中间换二次固定液)。 3 保存 采集玉米雄花是有季节性和时间性的,因此每次要多采集一些,保存起来备用。固定好 的材料先用 95%乙醇洗 3 次,然后转入 70%乙醇中可长期保存。保存材料时要注意使用封 口严密的容器,最好使用广口瓶,避免乙醇挥发。保存材料的乙醇每年要更换两次,以保证 乙醇的浓度和材料的质量。

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4 花药剥离 每朵玉米雄性小花中的所有花药几乎都处于同一个减数分裂时期。 不同小花花药之间可 能处于不同的减数分裂时期。因此,在剥离花药时要尽可能地多剥离一些大小不等的花药, 以保证能够在实验中观察到减数分裂各个不同时期的图象。 剥离花药时要注意将小花颖片剥 离干净,使用的镊子和解剖针不可刺破花药,否则花粉母细胞可能会从伤口处外流,影响实 验效果。 5.媒染 剥离出来的花药放进 4%硫酸高铁铵(铁矾)水溶液中进行媒染,媒染的时间需 4~24h。 媒染的目的是让花药中的花粉母细胞中浸入铁离子, 这些铁离子可以和染色液发生反应, 增 强染色体的染色效果。 6 水洗 媒染后的花药要经彻底水洗, 洗净花药表面的铁离子, 否则花药表面的铁离子会与染色 液反应发生沉淀,影响染色效果。为了水洗彻底,可用尼龙网做一个小口袋,把花药装入口 袋里,把口袋固定在水龙头上,流水冲洗 5~10min。 7 染色 将洗净的花药放入 0. 5%的苏木精染色液中染色 4~24h。 为了增强染色效果, 可以在 25~ 30℃的温箱里进行染色。 若染色时间不足, 染色液就很难通过花药壁细胞而进入花粉母细胞 中,影响观察效果。 8 水洗 染色后的花药还须清水冲洗,主要是洗净花药表面的染料。 9 压片 用解剖针和镊子截取 1/2 枚花药置于载玻片上, 然后滴上一滴 45%冰乙酸, 并在酒精灯 上加热 3~5 秒钟, 注意切不可将冰乙酸加热至沸腾。 45%冰乙酸的作用是软化花药壁细胞, 使花药壁破裂。另一个作用是使细胞质褪色,起到细胞质与染色体分色的作用。如果加热时 间过长,也会把染色体上的颜色全部褪掉。因此,45%冰乙酸也是一种褪色剂。 材料加热之后,盖上盖片,用吸水纸折叠二层覆盖在盖片之上,用以吸收多余的醋酸, 然后,在盖有花药的部位用镊子垂直轻轻敲打,使花药内的花粉母细胞扩散出来,肉眼观察 到花药周边有很多云雾状细小颗粒即可。最后,在材料部位用大拇指用力垂直按压,将载片 盖片之间压实。 10 镜检 显微镜下的细胞群中既有花粉母细胞, 也有花药壁细胞。 而且花药壁细胞中的绒毡层细 胞也在进行有丝分裂。因此,在观察时要首先区分花粉母细胞和花药壁细胞。花粉母细胞呈 圆形,个体较大;花药壁细胞是长方形,个体较小。一个花粉母细胞可相当于 4~5 个花药 壁细胞的体积。另外,多核细胞是绒毡层细胞。 实验观察结果 由于同一枚花药中花粉母细胞减数分裂具有同步分裂这一特点, 所以在每枚花药中一般 只能看到减数分裂中的一个期。减数第一次分裂时间相对较长、且复杂,前期 I 中就有五个 期: 细线期:染色体呈非常细长的线状交织成网,好似毛线团状。与其紧密相连的是一个看 似十分圆滑的原球体,即核仁。此时,虽然染色体都经过了复制后,都含有二个染色单体, 但是在显微镜下仍看不到这种结构。 偶线期: 染色体进一步螺旋化进入偶线期。 这时同源染色体之间开始准确地识别、 配对, 这一过程称为同源染色体的联会。 这时在显微镜下看到个别染色体的某一点或端部具有双重 结构或染色体配对的双股结构。

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粗线期:染色体进一步螺旋化、缩短变粗。由于同源染色体的联会,玉米的染色体数目 由原来的 20 条染色体变成 10 个二价体。 联会也为非姊妹染色体之间交换提供了条件, 通过 交换可发生遗传物质的相互转移和基因重组。 另外, 在玉米的某些染色体上存在着若干个深 染的颗粒结构,这些颗粒叫染色体结,是玉米粗线期的特有特征。 双线期:进入双线期以后,联会的同源染色体开始分离。由于配对的二价体在长轴上有 一点或几点结合着,而使二价体没有完全分离。这种结合的部位称为交叉,它代表着同源染 色体间可能发生交换的位点。 终变期:染色体高度浓缩使染色体变得更短更粗。具有交叉的染色体上的交叉位点也 随之向染色体的末端移动,使带有中部、亚中部和近端部着丝点的染色体形成了“O”形或 “V”字形,这一现象叫做端化。终变期也是检查染色体数目的最好时期之一,这时细胞核 内有多少个二价体,说明该生物就有多少对同源染色体。另外,在玉米减数分裂的终变期, 每个细胞核内总有一个染色体与核仁紧密相连, 这是第 6 号染色体, 也是核仁组织者染色体。 减数第一次分裂的中期, 端化的同源染色体排列在赤道面处。 同源染色体的两个着丝点 彼此相对分布在赤道面两侧。此时,核仁、核膜也已消失,纺锤体形成。 进入后期时,二价体的二个同源染色体彼此分开,在纺锤体的作用下,染色体开始向两 极移动。 由于染色体向两极移动时, 是以着丝点为先导的, 具有两个染色体比、 开始解螺旋。 末期的染色体由于不断解螺旋而变成了染色质状态。 核仁核膜重新出现, 形成二个子核, 每个子核的染色体数目减半为 n,即为单倍染色体数,但每条染色体由两个姊妹染色单体所 组成。紧接着是细胞质也分裂,便形成了两个子细胞。但这两个子细胞并不分开,一起进入 减数第二次分裂,这两个细胞又叫二分体。 减数第二次分裂是实质上的一次典型的有丝分裂。 通过这次有丝分裂, 姊妹染色单体分 离,细胞质再次分裂,由原来的二分体(两个细胞)变成了四分体(四个细胞) 。四分体中 的每一个细胞都含有单倍染色体数。 但是每个细胞尚不具有授精能力。 它还需要通过植物雄 配子体的过程,发育成小孢子,才能产生能够授精的细胞,即成熟的花粉粒。 思考题 1 参照显微镜的观察结果,绘制一套玉米减数分裂过程的示意图。 2 简述减数分裂各个时期的特点和意义。

实验 2 染色体制备与染色体组型分析
实验 2.1 小白鼠骨髓染色体制备及观察
目的要求 1 掌握动物骨髓细胞染色体制备技术。 2 学会动物细胞的滴片方法。 3 观察小白鼠染色体的形态特征和染色体数目。 实验原理 小鼠骨髓细胞具有旺盛的分裂增繁能力。如果把秋水仙素溶液注射小鼠体内,则可破 坏骨髓细胞分裂过程中纺锤体的形成,把分裂细胞阻截在中期。通过对小鼠骨髓细胞的低 渗、固定、滴片、染色等处理,可观察到小鼠染色体。这种骨髓染色体制片方法简单,取 材容易,不需无菌条件,方便易行。

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试剂和器材 l 材料 健康小白鼠 (Mus musculus 2n=40),体重约 18~20g,雌雄不限。 2 试剂 甲醇、冰乙酸、石炭酸品红、秋水仙素、KCl、生理盐水。 3 器材 恒温培养箱、普通离心机、显微镜、分析天平、架盘天平、离心管(5~10 mL)、吸管注 射器(5 mL)、100 mL 烧杯、载玻片。 操作方法 l 药品的配制 (1)0.01%秋水仙素:称 10 mg 秋水仙素,溶于 100 mL 生理盐水中。 (2)低渗溶液:称 5.59 克 KCl 溶于 1,000 mL 蒸馏水中,其浓度为 0.075 mL/L。 (3)生理盐水:8.5g NaCl 溶于 1,000 mL 蒸馏水中,浓度为 0.85%。 2 秋水仙素注射 解剖前 2 h,向小鼠腹腔内注射秋水仙素溶液 0.5 mL。秋水仙素的作用是破坏骨髓细胞 分裂中纺锤体的形成,积累细胞中期分裂相。 3 解剖小鼠 秋水仙素注射 2h 后,将小鼠脱臼处死,取出股骨胫骨,剔净肉,再用纱布块将剩余的 肉拧下来,用剪刀剪去骨两端,把注射器针头插入骨腔中,用生理盐水将骨髓细胞冲入离 心管中,要反复冲几次尽可能收集更多的细胞。 4 离心 离心管配平以后,以 800~1,000 r/min 离心 7 min 收集细胞。 5 低渗 离心之后,去掉上清液,轻轻敲打离心管底部,加入 5 mL 低渗液,让细胞与低渗液充 分混匀,达到最佳低渗效果。低渗的目的是为了在滴片时细胞容易破裂,便千染色体散开。 低渗需要在 37 ℃条件下进行,低渗时间为 20 min。低渗之后再离心一次,方法同前。 6 固定 离心后去掉上清液。轻轻敲打离心管底部使离心作用粘在一起的细胞松动开,加入固 定液时要有冲力,将细胞迅速冲开,以防止把细胞固定成团块。在室温条件下,细胞需固定 15min.,固定后还需离心一次。 7 按照 6 的方法再进行第二次固定。 8 制备细胞悬浮液 第二次固定离心后去掉上清液, 加入少量固定液制成细胞悬浮液。 细胞悬浮液不能太浓, 细胞密度过大,细胞重叠,影响观察。细胞悬浮液的密度也不能太稀、细胞太少,这样会 影响观察时速度。 9 滴片 把细胞悬浮液滴在预先冰水浴的载片上,每张载片滴 2 滴细胞悬浮液,分别滴在载片 的 1/3 处和 2/3 处。滴完之后,用嘴用力吹散细胞。冰水片子的作用是细胞受温差作用 容易破裂。为了让细胞破裂、分散得更好,滴片时,滴管与载片之间保持一定距离,让细 胞“摔”破。 10 空气干燥 滴片之后,一定让片子自然干燥后才能染色,否则细胞和染色体会飘浮在染液面上, 水洗时被冲掉,影响实验效果。 11 染色

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彻底干燥之后的片子可以放置在染色缸内或染色板上染色,也可以把染液直接滴在载片 上。由于整个载片表面都有细胞,所以,染色液要铺满载片。染色时每张载片滴二滴染液。 然后,用玻棒再铺展均匀。注意,玻棒与载片之间不能有接触和磨擦,玻棒始终浮在染液 表面,以保证细胞和染色体的完整性。 12 水洗 染色之后,流水冲洗载片背面,让多余的水分从边缘把染料带走。冲洗后,马上把片 子再翻过来,将有细胞的一面朝上放置。 13 显微镜观察结果 显微镜观察可采用“弓”字形搜寻的观察方法,保证观察时不漏掉每一个细胞。另外, 要熟练地使用推进器的座标尺,记录良好细胞分裂相的位置,以便最后比较观察和分析。 小鼠染色体为 2n=40,所有染色体全部为端着丝点。秋水仙素的浓度,注射量和作用时 间对小鼠染色体形态影响很大。如果秋水仙素浓度高、剂量大时,小鼠染色体短粗,进行 组型分析会有一定困难。秋水仙素作用时间长时,小鼠染色体多是晚中期。 思考题 1 绘制小鼠骨髓细胞染色体图。 2 如果有条件时,要进行显微摄影,然后进行组型分析。

实验 2.2 人的外周血淋巴细胞培养及染色体制片方法
目的要求 1 学习人体细胞离体培养的方法。 2 掌握制作人染色体标本的方法。 3 观察人类染色体的形态和染色体数目。 实验原理 正常情况下人的外周血中很少有分裂相细胞,只有在异常的情况下才能出现。上个世 纪 60 年代 Moorhead 等人建立了人体外周血白细胞培养技术,在医学、病毒学、药理学、 遗传学得到广泛应用。 目前, 经过实验技术的改进, 仅用 0.3~0.5 mL 全血就能做一次实验。 外周血液中的小淋巴细胞几乎都处于 Gl 期或 G0 期,PHA(植物血球凝集素)能有效地促 进小淋巴细胞转化成为淋巴母细胞而进入有丝分裂。将细胞在体外培养 3 天之后,经过用 秋水仙素处理,低渗、固定和离心等操作之后,即可制成人类染色体标本玻片.通过显微镜可 以对人的染色体形态和染色体数目进行观察和分析。结合临床医学上的病例还能进行染色 体畸变遗传病的鉴定。 试剂和器材 1 材料 人的肘静脉外周血。 2 试剂 M199 或 RPMI l640 培养液、胎牛血清、肝素、PHA、青霉素、链霉索、5%NaHCO3、 碘酒、75%乙醇、秋水仙素、生理盐水、甲醇、冰乙敢、石碳酸品红、KCl 低渗液等。 3 器材 恒温培养箱、电冰箱、高压灭菌锅、离心机、真空泵、分析天平、显微镜、超净工作 台、注射器、离心管、培养瓶、试管架、量桶、烧杯、酒精灯、抽滤瓶、G6 型号细菌过滤 漏斗。 操作方法

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1 药品器皿的无菌处理 (1) 实验用的所有器皿、器具都必须按规定洗净,高压灭菌处理备用。 (2) 实验用全部药品都要经高压灭菌或过滤除菌处理。具有生物活性的药品要经 G6 型 号细菌过滤漏斗抽滤除菌,其它药品可经过高压灭菌。 2 各种药品及培养基的配制 (1) M199 基础培养基的配制 称取 M199 培养粉 9.8g 溶于 1,000 mL 双蒸水中,经 G6 型号细菌过滤漏斗抽滤后备用。使用前最好做热源培养以确保实验顺利进行。 (2) 5% NaHCO3 的配制 称取 5g NaHCO3,溶于 100mL 蒸馏水中,高压灭菌备用。 (3) 生理盐水的配制 称取 0.85g NaCl 溶于 l00mL 蒸馏水中高压灭菌备用。 (4) PHA(植物血球凝集素)的配制 称取 PHA 50mg 配制成浓度为 lmg/mL (生理盐水 配制)的溶液。由于 PHA 使用量较少,配制时使用注射器式无菌过滤器,以减少药品损失。 (5) 肝素溶液的配制 用生理盐水按效价单位配成 500 单位/mL,高压灭菌后备用。 (6) 双抗溶液的配制 将青、链霉素用生理盐水按效价单位配成 l0 万单位/mL,配制 过程要求使用注射器式无菌过滤器。 (7) 秋水仙素溶液的配制 用生理盐水配制成浓度为 40 微克/mL) 秋水仙素溶液, 使用 注射器式无菌过滤器进行除菌操作。 (8) 低渗液溶液的配制 称取 5.59g KCl 溶于 1,000mL 双蒸馏水中,配制成溶液浓度为 0.075 M 的低渗液溶液。 (9) 细胞培养基的配制 在每个培养瓶中假如 M199 基础培养基 4mL, 小牛血清 l mL, 肝素 3 滴,PHA 0.3 mL, 加入双抗至最终浓度为 100 单位/mL,NaHCO3 调 pH 至 7. 2~7. 4。 3 接种全血 用无菌注射器从肘静脉抽取适量人的外周血,应由专业护士操作。在无菌条件下,向 每瓶培养液内加入全血 0.3mL 即可。 4 血细胞培养 将细胞培养瓶放在 37℃±0.5 的恒温培养箱中培养,每天至少摇动培养瓶一次,以保证 培养液通气。 5 秋水仙素处理 细胞培养至 68h,向培养瓶中注入秋水仙素 0.05~0.1 mL,使最终浓度为 0.4~0.8ug/ mL,继续培养 2~4 h。 6 低渗处理 细胞培养至 72h 后,小心地从培养箱中取出培养瓶,轻轻地打开瓶塞,切记不要震荡, 避免沉淀的细胞悬浮起来,不利于实验操作。然后用吸管弃去上清液,再加入经 37℃培养箱 预温的低渗液 5mL,盖上瓶塞,轻轻摇动让细胞悬浮起来与低渗液充分混匀。再放回 37℃ 温箱中,保温低渗 20min。 7 收集细胞 把低渗后的细胞悬液全部移入离心管中,以 1,000 转/分 速度离心 7min。 8 固定 离心后弃去上清液, 轻轻敲打离心管底部以便让沉淀细胞松动开, 再加入新配制的 5mL 固定液。 加固定液时要有冲力, 靠冲力把细胞冲散, 以防细胞固定成团块。 室温下固定 15min 以后,再离心。 9 重复固定 去掉清液后,再重复做 8 的过程。 10 滴片

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弃掉上清液之后,根据离心管壁回留量与沉淀细胞量的多少,再加入少量(约 0.2~0.3 mL)固定液制成细胞悬浮液。然后,将 2-4 滴细胞悬浮液均匀地滴在冰水预冷的载片上。 为了便于细胞分散和破裂,滴片时应使滴管与载玻片之间保持一定距离,大约 20-30 cm 为 宜。最后,空气干燥。 11 染色 在干燥后的载片上,滴加 2 滴石炭酸品红。用玻棒将染色液展匀,染色 5 min 之后,自 来水冲洗载片的背面(以防冲走细胞) ,洗去多余染色液,晾干。 12 显微镜观察 载片晾干以后,先用低倍镜观察,找到分散好的细胞相后灾转至高倍镜下观察。观察 时要使用推进器座标尺记录分散良好的细胞位置,便于重新查找。 13 实验结果 人的染色体 2n=46,其中 22 对常染色体,一对性染色体。男性是 XY、女性是 XX。按 照染色体个体大小和着丝点位置,人们将 46 条染色体分为 A、B、C、D、E、F 和 G 等 7 个组,各组别中染色体的特征参见表 1。 表 1 人染色体组型及其特征 组别 A B C D E F G 染色体序号 形态、大小 1~3 4~5 6~12.X 13~15 16~18 19~20 21~22.Y 最大 次大 中等 中等 小 次小 最小 着丝点位置 中部着丝粒(1、3) 亚中部着丝粒(2) 亚中部着丝粒 亚中部着丝粒 近端着丝粒 中部着丝粒(6) 亚中部着丝粒 中部着丝粒 近端着丝粒 有 16 号染色体 9 号染色体 有 次缢痕 1 号染色体 随体

思考题 1 试绘制人类细胞的染色体图相。 2 比较人与小鼠染色体的形态差别。

实验 2.3 生物染色体组(核)型分析
目的要求 掌握染色体组型分析的基本方法。 实验原理 染色体组型通常是指生物体细胞所有可测定的染色体表型特征总称,包括染色体的总 数、染色体组的数目、组内染色体基数、每条染色体的形态、长度、着丝点位置、随体或次 缢痕等。染色体组型是物种特有的染色体信息之一,具有很高的稳定性和再现性。染色体组 型分析不仅能对细胞内的染色体进行分组,还能对每条染色体的特征进行定量和定性的描 述,是研究染色体的基本手段之一。利用这一方法可以鉴别出染色体结构变异,染色体数目 变异,B 染色体及真假杂种等。同时,这也是研究物种的起源、生物的遗传与进化、细胞遗 传学和现代分类学的重要手段之一。 材料和器材 1 材料
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可以用不同生物为分析对象,如大蒜(Allium sativum)、洋葱 (Allium cepa)、蚕豆 (Viola faba)、大麦 (Hordenm spp)、人等,选择各自 10 个以上染色体分散相好、染色体个体相对 较长的细胞,经图象采集、放大、打印后,对其进行分析。 2 器材 显微镜、测微尺、毫米尺、镊子、剪刀、绘图纸、计算器。 操作方法 1 染色体制片(略) 。 2 制备显微摄影的放大图像 将选定的染色体图象进行拍摄和打印输出。 3 染色体测量 参照测微尺的放大倍数, 对输出图像中的染色体进行实际测量, 获取每条染色体各臂的 长度数据,测算染色体长度和臂比率,求出着丝粒在染色体上的位置、染色体臂比值、着丝 粒位置与染色体类型(参见表 2) 。 臂比率
臂比率 ? 长臂长度 短臂长度

(q) (p)
表2 染色体分类标准 表示符号 M m sm st t T

臂比值 1.00 1.01~1.70 1.71~3.0 3.01~7.00 7.01~∞ ∞ 着丝粒指数
着丝粒指数 ?

着丝点位置 正中部着丝点 中部着丝点区 亚中部着丝点区 亚端部着丝点区 端部着丝点区 端部着丝点

短臂长度 该染色体的长度

?1 0 0

总染色体长度 细胞单倍染色体总长度,包括性染色体在内。 相对长度 求出每条染色体占总染色体的长度。
相对长度

=

每一条染色体的长度 总染色体长度

? 100

4 列表 将以上测量项目列表,并将测量结果填入表 3 中。 表 3 染色体测量数据统计表 编号 1 绝对长度 相对长度 短臂 长臂 臂比率 着丝点指数 随体 类型

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2 3 4 · · · n 5 染色体配对 根据测量数据进行同源染色体剪贴配对。 6 排列染色体组型图 把染色体对从大到小、短臂在上、长臂在下,各染色体的着丝点排列在一条直线上。 7 翻拍或绘图 完成上述步骤的染色体剪贴,可以通过翻拍摄影或描图成为染色体组型图。 8 核型的描述公式 结合核型分析的结果,用公式的形式加以表示,既简明扼要又利于记忆和比较。以海岛 棉(Gossypium barbadensc)为例,其核型可写成:2n=4x=52=38m+12sm(2SAT)+2st(SAT) 9 核型的综合描述 说明分析对象的染色体数目,所含染色体组的数目及来源(同源或异源) ,每个染色体 组的基数,染色体大小和核型。 思考题 分析某一种生物的染色体组型,包括文字和图片的综合分析结果。

实验 3 染色体畸变观察 实验 3.1 果蝇唾腺染色体制片与染色体畸变观察
目的要求 1 练习解剖果蝇幼虫和分离果蝇唾腺的方法。 2 掌握唾腺染色体的制片技术。 3 了解唾腺染色体的结构及其变异特点。 实验原理 果蝇唾腺染色体是永久性间期染色体,由于间期染色体不螺旋化,而且 DNA 不断地进 行复制,细胞并不进行分裂,这样就使唾腺染色体变成了巨大染色体(多线染色体)。唾腺染 色体可以比果蝇其它细胞染色体大几百倍。果蝇唾腺染色体能进行体细胞配对(拟联会),配 对时所有染色体的着丝点聚集在一起形成染色中心,同源染色体的两条臂紧密配合自由伸 展。因此,在唾腺细胞里,查不出 2n 的染色体数目,只能观察到从染色中心向空间伸展的 染色体臂。与其它细胞染色体相比的另一个特点是,唾腺染色体上有深浅不同、宽窄不一的 带纹。这些带纹的数目和位置是恒定的,代表着种的特征和一些基因的位置。由于这些带纹 的存在,染色体上发生缺失、重复、倒位、易位等很容易在唾腺染色体上识别出来。 试剂和器材 1 材料 果蝇 (Drosophila virilis 染色体数目 2n=12) 三龄幼虫。 这种果蝇幼虫比黑腹果蝇(Drosophila melanogaster 染色体数目 2n=8)幼虫个体大,唾腺 大、脂肪少,便于操作和观察。

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2 试剂 乙醚、丙酸、酵母粉、绵白糖、琼脂条、玉米粉、1mo1/L HC1、0. 85%NaC1、石炭 酸品红、蒸馏水。 3 器材 恒温培养箱、高压灭菌锅、显微镜、天平、培养瓶、棉花塞、滤纸片、载片、盖片、镊 子、解剖针 操作方法 1 三龄幼虫培养 实验前将果蝇(D.virilis) ,转接到新配制的培养基中,放在 23~25℃的条件下饲养约 10 天左右。为了让果蝇幼虫长得肥大更便于操作,在实验前一天,将溶解好的酵母液添加 在培养基里,添加前要先把培养瓶中的成虫转移掉。添加的数量因培养基的情况而定,一般 约 0. 5~l mL。 2 解剖幼虫 取一洁净的载片,滴上 2 滴生理盐水。在瓶壁上挑选肥大,行动迟缓的三龄幼虫放在生 理盐水中,这时生理盐水如果很混浊,要更换生理盐水或把幼虫转移到另一张载片上。唾腺 位于幼虫头部两侧,长度约占身体总长 1/3~1/4 左右。解剖时要用解剖针压住头部,压 住的地方越小越好。用镊子夹住幼虫身体后 2/3 部分,将幼虫在身体前端拉开。 唾腺是半透明的囊状物,会飘浮在生理盐水里,无沦怎样触动都不发生形状改变。唾腺 找到以后,用解剖针将唾腺与其它组织分开,只留唾腺在载片上。在显微镜下观察,唾腺仍 呈半透明状态,由单层细胞构成,细胞形状不规则,细胞轮廓清晰,细胞大,细胞核也大, 甚至可以看清楚细胞核是由染色体卷缩在一起形成的,一个唾腺约几十个细胞构成。 3 解离 用滤纸条吸净唾腺周围的其它物质,然后在唾腺上滴上 1mol/L HC1 解离 2~3min, 以解除细胞间联系,便于染色体散开。 4 水洗 解离后的唾腺用蒸馏水洗 3~4 次,水洗时要注意不要把唾腺弄丢,水洗要彻底,否则影 响染色效果。另外,水洗过程也是细胞低渗过程。 5 染色压片 水洗后的唾腺周围要用滤纸条清理干净, 然后在唾腺上滴上一滴石炭酸品红, 染色 5min 后盖上盖片,先用滤纸吸去盖片周围溢出的染液,最后在有材料的位点上用力压实。 6 显微镜观察 先用低倍镜观察,发现分散好的染色体图像后再转换至高倍镜观察。 果蝇(D. virilis)的体细胞染色体数 2n=12,全部为端部着丝点。其中有 5 对染色体臂较 长,一对染色体臂很小是点状染色体。唾腺染色体是 5 条长臂,点状染色体附着在染色中心 附近。另外,在染色体臂上有明显深浅不同、宽窄不一的带纹。在染色体臂的不同部位有时 会出现疏松区(胀泡),这是转录活性区。 我院遗传学实验室饲养的果蝇(D. virilis) 唾腺染色体中, 常见某一条染色体局部区域出 现不联会的分叉或分枝现象,该区域的带纹彼此间也存在明显差异。这表明,这对同源染色 体之间存在着遗传上的差异。 关于这种差异产生的畸变原因是否与某种环境因素有关, 目前 尚不清楚。 思考题 1 认识唾腺染色体的结构特点,绘制唾腺染色体变异结构图像。 2 讨论染色体结构变异的类型及其特点。

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实验 3.2 紫萼玉簪染色体结构变异的显微镜观察
目的要求 1 进一步掌握染色体结构变异的特点及细胞学特征。 2 了解染色体结构变异在遗传上的意义。 实验原理 染色体结构变异是自然界中存在的一种生物进化和新物种形成的重要因素之一。染色 体结构变异主要有缺失、重复、倒位、易位四种。其中易位是最容易发生的一种染色体结 构变异,也是自然界中存在的最广泛的一种结构变异。不同的染色体结构变异具有各自不 同的特殊表型。臂内倒位杂合体在倒位圈内发生交换后形成一条具有双着丝粒染色体和一 个无着丝粒的染色体片段。 在减数分裂后期 I,同源染色体由纺锤体拉向两极时形成染色 体桥和落后的断片。染色体断裂之后,不论是有着丝点的缺失染色体还是无着丝粒的断片, 都可能形成微核,尤其是无着丝粒的染色体片段最终都可能形成微核。有时可以利用对微 核测试方法检测环境污染等因素对染色体畸变的影响。染色体的变异现象越丰富,说明诱 变因素的作用越大。 试剂和器材 1 材料 紫萼玉簪花蕾(东北师大校园内栽培种)。 紫萼玉簪花染色体数目多,个体差异大。由于染色体数目和结构有严重的变异,不能 产生有效配子,因而导致有性生殖率极低,几乎不产生种子或只产生少数败育的种子,繁 殖方式主要依赖分根法进行无性繁殖。这种紫萼玉簪是一份天然的、不需人工诱导即可观 察染色体结构变异的好材料。 2 试剂 乙醇、冰乙酸、硫酸铁铵、苏木精。 3 器材 广口瓶、酒精灯、镊子、载片、盖片、吸水纸、解剖针、小烧杯、表玻皿。 操作方法 1 取材 东北师大校园内栽培的紫萼玉簪花开花的时间是每年夏天的 7 月上旬,取正处于减数 分裂时期尚未开花的花蕾,取材的时间一般在上午 8~9 点,下午 2~3 点为宜。 2 固定 花蕾取来要放入 Carnoy 固定液中固定。由于花蕾体积较大,需固定一周时间,中间要 更换 2~3 次固定液。材料固定之后转入 70%乙醇中保存。 3 剥离花药 花蕾有许多小花组成,小花中有三枚花药。花药若呈黄色,表明减数分裂已经完成。 剥离花药时要选择白色的。使用的解剖针和镊子都不能伤害花药,否则花粉母细胞会从伤 口处流失。 4 媒染水洗 剥离出的花药放在 4%硫酸铁铵水溶液中浸泡 4~24h,浸泡时花药必须浸于底部,飘浮 于液体表面的花药则达不到媒染效果。媒染后的花药要彻底水洗,最好是流水冲洗 5min 左 右。 5 染色

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冲洗后的花药放入苏木精染液中,染色时间 4~24h,染后的花药为蓝黑色。染色之后的 花药用清水洗去表面的染料,存放于清水中备用。 6 制片 取一枚花药放在一张洁净的载片上,滴上一滴 45%的冰乙酸,酒精灯上加热 3~5s,盖 上盖片,覆盖上一层吸水纸,在材料部位用力压实,载片盖片之间不能有摩擦,否则会造 成细胞变形变碎。 7 实验结果观察 在显微镜下,选择体积大、圆形花粉母细胞进行观察。在不同的细胞分裂相中会发现, 有的中期细胞中有落后染色体和断片,后期会有染色体桥形成,而且有的细胞中还有双桥 和多桥现象,末期有染色质桥和微核。从这些细胞学现象分析,紫萼玉簪细胞中的染色体 结构曾发生过的多种变异。 思考题 1 绘制所观察到的紫萼玉簪变异细胞的染色体图相。 2 记录紫萼玉簪变异细胞出现的类型和频率。 3 讨论紫萼玉簪变异的原因及其意义。

实验 3.3 植物多倍体诱发实验
目的要求 1 了解染色体整倍性变化的特点。 2 掌握诱导多倍体的方法技术及其在植物育种上的意义。 实验原理 多倍体是指细胞核内具有二个以上染色体组,如 3n、4n、6n 等的植物。多倍体广泛地 存在于自然界中,小麦是异源六倍体,棉花是 4 倍体等。多倍体产生的途径除自然发生外, 还可以人工诱导。诱导多倍体可以采用物理方法如射线处理、低温、高温、嫁接等手段。 还可以采用化学的方法,如秋水仙素、富民农、异生长素等药品都能诱发多倍体。其中以 秋水仙素效果最好。 秋水仙素是百合科植物秋种番红花—秋水仙 (ColcMcum autumnale) 的种子及器官中 提炼出来的一种生物碱,具有麻醉作用。化学分子式为 C 22 H 25 NO
6

?1

1 2

H 2 O 。秋水仙素

对植物的种子、幼芽、花粉、嫩枝等都能产生诱变作用。秋水仙素主要作用于细胞分裂过 程中纺锤体的形成,使细胞分裂后期染色体不能分向两极而被阻截在中期,经过间期染色 体复制,使染色体数目加倍。 试剂和器材 1 材料 大蒜 (Allium sativum 染色体数目 2n=16) 2.试剂 秋水仙素、乙醇、冰乙酸、l mol/L,HCl、石炭酸品红。 3 器材 恒温水浴锅、显微镜、天平、培养皿、镊子、刀片、吸水纸、载玻片、盖 玻片。 操作方法 1 生根 大蒜去老根,经水培或沙培生根长至 l.5~2 cm 左右取出,洗净根部的泥土或沙子。

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2 秋水仙素处理 把蒜根转入 0.1%的秋水仙素溶液中培养 36~48h,由于培养时间较长,需添加秋水仙素 溶液,以防干枯。待根尖膨大时可取材固定。 3 固定 将经过秋水仙素诱导分生组织已经膨大的根尖在上午 10~11 点或下午 4~5 点时剪下 来。清水冲洗几次以后,放在 Carnoy 固定液中固定 4~24h。固定好的材料可以放在 70% 的酒精中保存,备用。 4 解离 1 mol/L HCl 放在 60℃的恒温水浴锅中预热,再把根尖放入 1 mol/L HCl 中开始计时, 解离时间为 4 min。根尖解离之后,要用清水反复冲洗干净。 5 根尖压片 取根尖分生组织一部分放在一洁净的载片上,先用解剖针把材料碾碎并铺展开。然后, 滴上一滴石炭酸品红染色 5 min 以后,盖上盖片,先把材料轻敲几下,然后再用力压实。 6 实验结果观察 借助显微镜寻找染色体分散良好、染色体形态清楚的 4n=32 细胞。在观察时有的细胞中 确是 32 条染色体,但每条染色体只是一条染色单体,这不能算是 4n 的细胞,只能说是 2n 的后期相,这样的细胞必须要经过间期染色体复制才能成为真正的 4n 细胞。 思考题 1 绘出大蒜 2n=16、4n=32 的细胞染色体图。 2 如果要得到能够栽培的稳定遗传的 4 倍体大蒜还要做哪些工作?

实验 4 有性杂交与基因连锁分析 实验 4.1 果蝇杂交与连锁分析 实验 4.1.1 果蝇的饲养与性状识别
目的要求 1 了解果蝇的生活史,学会饲养果蝇。 2 掌握区别雌雄果蝇的方法。 3 掌握遗传学实验常用果蝇品系的特征及常见突变类型。 实验原理 黑腹果蝇 (Drosophila melanogaster 染色体数目 2n=8) 是遗传学实验的重要材料来源 之一。果蝇具有饲养方便、来源广泛、生活史短、性状便于观察等许多特点。因此,在遗传 学研究中, 果蝇可广泛地用来完成遗传三大定律及连锁互换的验证性试验, 以及唾腺染色体 观察等。 试剂和器材 1 实验材料 野生型雌、雄性黑腹果蝇 (Drosophila melanogaster) 及其常见的各种突变体。 2 试剂 乙醚、琼脂、绵白糖、丙酸、酵母粉、玉米粉、乙醇。 3 器材 显微镜、放大镜、恒温培养箱、高压灭菌锅、培养瓶、麻醉瓶、白磁砖、毛笔、石棉网、

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棉花、纱布、口取纸、滤纸片、牛皮纸、小镊子。 操作方法 l 果蝇饲养 (1)果蝇生活史 果蝇是昆虫纲、双翅目、果蝇属中的一个种。果蝇生活史具完全变态过程,即完成一 个生活史周期要经过卵、幼虫、蛹、成虫四个阶段。果蝇生活史短,完成一个生活史周期在 最适生活温度条件下仅需两周时间。饲养果蝇方便容易,如果没有特殊要求。可在 20~30 天左右继代一次。果蝇的繁殖率高,一对果蝇交配以后可产卵几百个,这对遗传学来说是非 常重要的。另外,果蝇的突变类型多,性状容易辨认。因此,果蝇作为遗传学实验材料是十 分适宜的。 (2)果蝇培养基 果蝇因经常在果园和水果上见到而得名。 果蝇以酵母菌为食, 腐烂的水果上经常有酵母 菌。凡是能作为酵母菌发酵的基质都可以作为果蝇培养基。目前,常用的果蝇培养基有香蕉 培养基(多在南方使用)和米粉培养基(多在北方使用)。 下面以 l00 mL 为单位介绍米粉培养基 的成分配比(表 4)。 表 4 果蝇培养基的成分(100mL) 成分 H 2O 玉米粉 绵白糖 琼脂条 丙酸 酵母粉 数量 80 8.2 6.2 0.62 0.5 少量 单位 mL g g g mL 作用 溶剂 基本成分 基本成分 固化剂 防腐剂 菌种

配制时先将水分成两份,其中一份用于溶解琼脂和糖,另一份煮玉米粉,待两份分别溶 解煮好后再混合到一起煮沸。关掉火后再加入丙酸,这时培养基很粘稠,要充分搅拌之后再 分装培养瓶内。待培养基冷却之后,在培养基表面撒上一层酵母粉,插上一块经灭菌后的滤 纸片作为幼虫化蛹的干燥场所。 (3)培养瓶和灭菌 经常用来饲养果蝇用的容器是广口瓶和指管。 根据实验的特点和所需果蝇的数量来决定 采用哪种容器。实验室最常用的是 125 mL 和 60 mL 两种培养瓶。不管是哪种培养瓶,在使 用之前必须经过灭菌,包括瓶塞在内。灭菌一般采用高压灭菌方法,灭菌温度 121~125℃, 时间 18~20 min。灭菌也可采用煮沸方法和干热灭菌的方法。 2 果蝇的繁殖过程 果蝇生活的最适温度是 20~25℃。在最适温度下完成一个生活史周期需 12~15 天。果 蝇的生活史周期与温度关系密切,提高温度和降低温度会使果蝇的生活史周期缩短和延长。 将温度提高到 26℃以上,完成一个生活史周期只需 10 天左右。如果超过 30℃,会造成雌蝇 的育性下降或不育,甚至可引起果蝇死亡。相反,把温度降低到 10℃,果蝇的生活史周期 可延长到 50 多天,这时果蝇的生活力很低。 雌果蝇一般在羽化后 12h 开始交配繁殖, 交配后两天开始产卵。 卵孵化成幼虫后要经过 两次脱皮才能从一龄幼虫变为三龄幼虫。幼虫生活 6~7 天准备化蛹,化蛹之前从培养基中 爬出来附着在瓶壁或插在培养基上的滤纸片上逐渐形成一个梭形的蛹。 幼虫在蛹壳内完成成 虫体型和器官的分化,最后从蛹壳的前端爬出。 3 果蝇的雌雄识别 雌、雄果蝇在外形上有很大区别,稍加注意便可找出雌、雄果蝇的特点。例如,果蝇个

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体的大小、腹部条纹的数量、腹部末端圆与尖、性梳的有与无等(表 5)。 表 5 果蝇的雌雄区别 特征 个体 腹部条纹 腹部末端 性梳 雄蝇 小 3 圆 有 雌蝇 大 5 尖 无

在鉴别雌、雄果蝇的特征中,除性梳这一性状需要借助显微镜观察外,其它性状都用肉 眼直接观察。 果蝇的性梳是一个决定雌、 雄果蝇的第二性征。 性梳着生在雄性果蝇第一对前足的第一 个跗节上。因其形状与梳头的梳子非常相似,又与性别有关,故得此名。 4 处女蝇的选取方法 雌性果蝇生殖器官有受精囊,可保存交配所得的大量精子,能使大量的卵受精。因此, 在进行果蝇杂交实验的时候,雌性果蝇必须是处女蝇,以保证实验结果的可靠性。雌果蝇自 羽化开始 10h 之内尚未达到性成熟,因而没有交配能力。选择处女蝇时,先把培养瓶中原有 的果蝇全部除去, 收集 10h 之内由蛹羽化出来的新果蝇, 从中选出的雌蝇应该全部都是未交 配过的处女蝇。如果要验证选取的处女蝇是否准确,先单独放入一个培养瓶内,不要放入雄 蝇,3 天后看雌蝇是否产卵。如果有新卵产出,那么它就不是处女蝇了。处女蝇选定后即可 进行杂交试验。 5 果蝇的麻醉 无论是杂交实验还是进行性状观察, 都需要先麻醉果蝇。 麻醉果蝇时切忌不要在原来的 培养瓶中直接麻醉,否则被麻醉的不仅是成蝇,蛹和幼虫也被连带麻醉了。麻醉前,要先把 果蝇导入另外一个麻醉瓶中进行麻醉。 把果蝇导入麻醉瓶时要注意,先轻轻敲打果蝇培养瓶,让果蝇落到瓶的底部,然后迅 速打开瓶塞,把麻醉瓶扣在培养瓶上,让其瓶口对接,果蝇会自然向上运动。另外,也可以 用黑纸包住培养瓶,果蝇向上运动更快。如果确有部分果蝇始终不进入麻醉瓶,也可以把培 养瓶倒过来,不断敲打培养瓶壁,使果蝇被动进入麻醉瓶,然后快速分离麻醉瓶,塞上瓶棉 塞。 麻醉时,仍然先敲打麻醉瓶,让果蝇落到瓶的底部,迅速往麻醉瓶棉塞上滴上少量乙 醚再盖到瓶口上。麻醉开始后,果蝇很快就会进入麻醉状态。因此,要密切注意观察麻醉情 况,要根据实验的要求来掌握果蝇的麻醉程度,试验人员切忌离开。用于杂交实验的亲本果 蝇切不能麻醉过度,否则会影响果蝇的生活力。在观察时发现麻醉现象出现,就可以去掉麻 醉剂。 如果被麻醉果蝇只是用来识别雌雄和观察性状, 这些果蝇要深度麻醉直至死亡。 否则, 在实验没做完之前果蝇便苏醒过来,影响观察,有的还会飞跑。 区别麻醉状态和麻醉致死果蝇的方法是以翅膀是否外展为依据。 处于麻醉状态的果蝇两 个翅膀仍然重叠紧贴在背腹上; 而麻醉致死的果蝇翅膀则离开腹部呈外展状态, 不管外展程 度如何,都按死亡果蝇对待,切不可以选择这种状态的果蝇做杂交用的亲本。 6 果蝇突变性状的观察 果蝇的突变类型很多,实验室常用的有很多种变异品系,如白眼、棒眼等(见表 6)。这 些果蝇性状大多数都是可用肉眼观察到的,只有刚毛的形状需要在显微镜下观察。 表 6 果蝇常见突变性拽特征 突变性状名称 白眼 基因型号 w 性状特征 复眼白色 所在染色体 X
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棒眼 黑檀体 黑体 黄身 残翅 焦刚毛 小翅

B e b y vg sn m

复眼横条形 体呈乌木色、黑亮 体呈深色 体呈浅橙黄色 翅退化,部分残留不能飞 刚毛卷曲如烧焦状 翅较短

X ⅢR IIL X IIR X X

思考题 1 绘制雄性果蝇性梳图。 2 绘制果蝇直刚毛和卷刚毛图。 3 观察下表中列出的果蝇,通过观察把结果填人表中 类型 特征 体色 眼色 翅形 刚毛形态 (+) (vg) (e) (b) (w) (snmw)

实验 4.1.2 果蝇伴性遗传实验
目的要求 l 进一步掌握伴性遗传的规律和特点。 2 正确认识伴性遗传与常染色体遗传的差别。 实验原理 果蝇的性染色体有 X 和 Y 2 种类型。 雌蝇细胞内有 2 条 X 染色体, 为同配性别 (XX) , 雄蝇为 XY 是异配性别。 性染色体上的基因在其遗传过程中,其性状表达规律总是与性别有 关。因此,把性染色体上基因决定性状的遗传方式叫伴性遗传。 试剂和器材 1.材料 黑腹果蝇 (Drosophila melanogaster) 的二个品系,野生型红眼 (+) 和突变型白眼 (white eye,w)。决定黑腹果蝇红眼和白眼的基因位于 X 染色体上,是一对等位基因。 2 试剂 乙醚、乙醇、丙酸、酵母粉、玉米面、琼脂条、绵白糖。 3 器材 恒温培养箱、架盘天平、高压灭菌锅、培养瓶、麻醉瓶、白瓷板、毛笔、镊子、棉花 塞、滤纸片、牛皮纸、口取纸。 操作方法 1 果蝇培养 参照实验 3.1.1 中的果蝇培养方法,分别饲养这二个品系的果蝇,待饲养瓶中有蛹出现
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后将成蝇移去。 2 选择亲本 从刚羽化的果蝇中分别选择红眼雌蝇和白眼雌蝇, 为了保证雌果蝇是处女蝇, 在选择的 时候,羽化的果蝇不能超过 l0h。 3 果蝇杂交 进行伴性遗传杂交时, 应该同时配置正交和反交试验组合。 因为决定性状的基因在性染 色体上,正、反交的结果会出现性状和性别的差异。把选好的红眼、白眼雌蝇分别放入培养 瓶中,再按实验的要求将白眼雄蝇放入红眼雌蝇的培养瓶,相反,把红眼雄蝇放入白眼雌蝇 瓶中。在果蝇培养前,要在杂交培养瓶上贴上标签,标明实验题目、杂交组合、杂交日期、 实验者姓名。最后,把培养瓶放在 20~25℃恒温培养箱内饲养果蝇。 4 去亲本 果蝇饲养 7~8 天以后,肉眼可见培养瓶中出现了幼虫和蛹,这时可以将亲本移出,以防 亲本与 F1 果蝇混杂,影响实验结果。 5 F1 代性状观察和统计 再经过几天饲养之后,培养瓶中会陆续羽化出 F1 代果蝇,仔细观察 F1 代果蝇性状,统 计正、反交 F1 代表型性状的观察结果,并将结果填入表中(见表 7,表 8) 。 表 7 果蝇伴性遗传正交(X X ×X Y)F1 代的性状观察统计表 观察结果 统计日期 各类果蝇的数目 红眼♀(+) 红眼♂(+)
+ + w

表 8 果蝇伴性遗传反交(X X ×X Y)F1 代的性状观察统计表 观察结果 统计日期 各类果蝇的数目 红眼♀(+) 白眼♂(w)

w w

+

6 F1 代自交 把正交试验得到的 F1 代果蝇转入一个新培养瓶中进行相互交配,把反交试验得到的 F1 代果蝇也转入一个新培养瓶中进行互交(不需挑选处女蝇) ,以期获得 F2 代。 7 去亲本 经过 7~8 天的培养,当培养瓶里出现了 F2 代幼虫和蛹时,把培养瓶里的成蝇转移出去, 防止与 F2 代果蝇混杂。 8 F2 代性状观察和统计 再经过几天饲养之后,F2 代果蝇会陆续羽化来,仔细观察 F2 代果蝇的性状,统计正、 反交 F2 代表型性状的观察结果,并将结果填入表 9 和表 10 中。

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表 9 果蝇伴性遗传正交 F2 代的性状观察统计表 观察结果 统计日期 各类果蝇的数目 红眼♂(+) 白眼♂(w) 红眼♀(+) 白眼♀(w)

合计 百分比 表 10 果蝇伴性遗传反交 F2 代的性状观察统计表 观察结果 统计日期 各类果蝇的数目 红眼♂(+) 白眼♂(w) 红眼♀(+) 白眼♀(w)

合计 百分比 9 伴性遗传试验结果分析 根据实验观察和统计结果,应用统计学分析方法,分析果蝇眼色遗传的现象和特点, 深入理解伴性遗传的本质和规律。 在果蝇伴性遗传杂交实验中,有时也有例外个体产生,比如在前面提到的反交实验中, ♀性果蝇应该全是红眼,F1 中确实出现了♀性的白眼果蝇,虽然出现这种现象的概率很低, 但确实出现过。造成这种例外产生的原因是由于减数分裂过程中 X 染色体不分开所致。 思考题 1 认真填写杂交实验结果。 2 2 用 X 测定和分析有关实验数据。 3 讨论伴性遗传的本质、特点和规律。

实验 4.1.3 果蝇的三点测交和基因定位
目的要求 1 加深理解遗传学基因连锁与互换定律的本质。 2 学习和掌握果蝇基因定位和绘制连锁图的方法。 实验原理
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两个基因在同一条染色体上呈连锁状态时基因间经常发生交换, 交换值可作为两基因间 的距离。因此,对于同一条染色体上的两个基因彼此之间距离的测定,可以通过设计双因子 杂交试验, 统计后代中两个基因性状分离的百分率就可以确定出二者之间的相对距离。 然而, 如果分析三个连锁基因彼此间的相对位置和距离, 则需要进行三次不同组合的双因子杂交试 验。由于这样的实验存在费时、费力、存在较大试验误差等缺点,因此,人们发明了三点测 交的方法, 其优点是只需一次杂交一次测交就能确定三个基因在染色体上的位置顺序和基因 间的相对距离,而且结果更加准确。 试剂和器材 1 材料 黑腹果蝇(Drosophila melanogaster) 两个品系,即(1)野生型果蝇,其性状为红眼、长翅、 直刚毛、基因型+++。(2)三隐性突变体,其性状为白眼(w) 、小翅(m) 、焦刚毛(sn) 、基 因型为 w ms n。 2 试剂 乙醚、乙醇、酵母粉、丙酸、玉米粉、绵白糖、琼脂条。 3 器材 恒温培养箱、高压灭菌锅、显微镜、架盘天平、培养瓶、棉花塞、麻醉瓶、滤纸片、牛 皮纸。 操作方法 1 实验果蝇的饲养 三隐性突变体果蝇白眼小翅焦刚毛三个基因是位于 X 染色体上的连锁基因,相对这三 个性状的显性是野生型果蝇。实验前先把这两种果蝇分别饲养,7~8 天以后,培养瓶中出 现幼虫和蛹之后,将瓶中的成蝇转移出去。 2 选择亲本 培养瓶中的果蝇羽化之后, 选择三隐性雌性果蝇作为三点测交试验的母本, 野生型雄蝇 作为父本。 3 亲本杂交 把三隐性的母本雌蝇和野生型的父本雄蝇放入同一培养瓶中,仔细检查确认无误之后, 粘贴标签,填写实验名称,亲本性状、杂交日期、实验者姓名。每个培养瓶内放入 3~5 对 亲本果蝇为宜。培养瓶放在 23℃恒温箱中饲养。 4 去除亲本 果蝇杂交 7~8 天以后,培养瓶中开始陆续有幼虫和蛹出现,这时就要把亲本去掉。注 意去掉亲本时一定要去除干净,否则 Fl 代羽化之后再与亲本回交,其后代的性状就无法正 确统计了。 5 F1 代果蝇性状观察与统计 再经过 4~5 天培养,Fl 代果蝇会陆续羽化出来。要认真观察和统计 Fl 代中雌、雄果蝇 各自的性状。从理论上讲,Fl 代果蝇中的雌性应该全部是红眼、长翅、直刚毛,表型都是野 生型,基因型是杂合的;Fl 代果蝇中的雄果蝇全部都是白眼、小翅、焦刚毛,表型都是突变 型。如果观察结果与理论相符,实验可以继续进行;假如不符合预期结果,实验不能盲目继 续进行,要认真分析原因,纠正试验中的错误。 6 测交 用 F1 代雌蝇和 F1 代雄蝇进行杂交,F1 代雌蝇是杂合体,表现为显性性状。Fl 代雄蝇 X 染色体上的三个基因全是隐性,Y 染色体上又没有相对的基因,所以又是纯合体,把这样两 种果蝇杂交又叫测交。 测交时从 F1 代果蝇中选 7~10 对果蝇放入一个新培养瓶中, (♀蝇无须是处女蝇), 贴好

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标签。为了得到更准确的实验结果,要求 F2 代果蝇群体数目多,因此在做测交实验时,选 用一个稍大一点的培养瓶,以保证果蝇的生活条件。 7 去掉亲本 果蝇培养 7~8 天以后,当培养瓶中有足够的幼虫和蛹后,去掉亲本。 8 F2 代果蝇观察 用于测交的雌果蝇是三个基因的杂合体,减数分裂形成配子时,同源染色体之间有发 生交换的可能,就任何二个基因之间都有可能发生交换,三个基因之间也能产生双交换。假 如这些理论上的交换是事实存在的话, 那么, 本试验中雌性亲本果蝇就可以产生 8 种不同的 雌配子;雄性果蝇只产生两种配子,一种是含有不带有任何基因的 Y 染色体的雄配子,一 种是带有三个隐性基因的 X 染色体的雄配子。因此,这两种配子只对 F2 代的果蝇有性别影 响,没有性状上的影响。理论上,F2 代的表型可以有 8 种类型,实际上它们是 8 种雌配子 基因型表达的结果,其中 6 种是重组合,只有二种是亲组合。 果蝇刚毛性状很小,需要借助显微镜观察。 9 实验观察结果的统计与计算分析 把观察到的果蝇性状种类和数量分别填入表表 11 内。根据遗传学统计分析方法,分别 计算本实验中的二个单交换率和一个双交换率。 依据计算和分析结果, 确定出这三个基因彼 此间的直线连锁关系及其基因间的图距,并会出三个基因的连锁图谱。另外,分析一下两个 单交换之间是否存在干涉现象。 表 11 果蝇三点测交试验性状观察结果统计表 测交后代表型 sn w m +++ +w+ sn + w sn + + +wm sn w + ++m 观察数 重组发生在 m ~ sn sn ~ w m~w

思考题 l 计算基因间的重组值。 2 绘制遗传学连锁图,把三个基因定位在染色体上。 3 计算并发率和干涉
并发率 ? 观察到的双交换频率 两个单交换频率的乘积

干涉=1-并发率

实验 4.2 链孢霉有性杂交的四分子分析
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目的要求 1 学习链孢霉培养基配制及菌种培养方法。 2 了解链孢霉杂交方法。 3 掌握有关四分子遗传学分析及其基因与着丝粒距离的计算和作图方法。 实验原理 链孢霉(Neurospora crassa)属真菌类,染色体为单倍体,繁殖方式可以是有性繁殖,也 可以是无性繁殖。 无性繁殖是由营养体菌丝或分生孢子经有丝分裂直接发育成菌丝体, 并产 生大量的分生孢子。 如果把两个不同品系链孢霉接种到杂交培养基上, 链孢霉又能进行有性 生殖。在有性生殖时,菌丝体顶端的分生孢子基部先长出一个原子囊果,类似高等植物的性 器官。 原子囊果能够接受来自不同品系菌丝体上的分生孢子, 使原来 n 倍的原子囊果就变成 了 2n 的子囊果。这个 2 倍体的合子经过减数分裂形成 4 个子细胞,每个子细胞又经过一次 有丝分裂, 使原来的 4 个细胞变成 8 个细胞, 8 个细胞进一步发育成 8 个子囊孢子并排列 这 在一个子囊中。它们是一次减数分裂和一次有丝分裂的产物。 链孢霉有性杂交试验是选用了性状不同的两个品系,即子囊孢子的颜色或黑或白,这 是由一对等位基因控制的一对相对性状。如果这两个不同品系链孢霉的孢子通过杂交结合, 其后代子囊中产生的 8 个子囊孢子应该是 4 黑 4 白。 但是, 由于减数分裂中同源染色体的非 姊妹染色体之间可以发生交换, 结果可能导致其后代子囊孢子 4 黑 4 白排列顺序的改变。 减 数分裂同源染色体配对时, 4 条染色单体间发生交换的概率是相同的,所以, 8 个子囊孢 子会有 4 种可能的排列顺序,统称之为交换型。另外,没有交换的属于亲组合型,或称非交 换型,共有 2 种排列顺序。因此,在显微镜下可以直接观察到 6 种排列顺序。由于链孢霉是 单倍体生物,所以,染色体上控制性状的基因是否存在或是否发生过交换,可以直接在子代 性状中表现出来。 由于链孢霉的染色体均为端部着丝点染色体,所以,如果基因位点距离着丝点越远,发 生交换的机会就越多,其交换值就越大。因此,可以根据杂交后代中交换型子囊数量与非交 换型子囊数量的比例关系,就可以计算出该基因位点与着丝点之间的距离,并且,绘制出基 因连锁图。 实验材料 (1)野生型粗糙链孢霉(Neurospora crassa, n=7),自身可以合成赖氨酸,用 lys+表示。 子囊孢子是黑色的。 (2)赖氨酸缺陷型粗糙链孢霉,自身失去合成赖氨酸的能力,必须在培养基中添加赖氨 酸才能生长,用 lys-表示。子囊孢子是白色的。 试剂和器材 1 试剂 琼脂、蔗糖、赖氨酸、玉米粒、次氯酸钠、土豆。 2 器材 恒温培养箱、高压灭菌锅、显微镜、解剖针、接种针、试管、载玻片、盖玻片、滤纸 片。 操作方法 1 配制菌种活化培养基 (1) 基本培养基(供 lys+活化用) 土豆去皮洗净切成 0.5cm3 小块, 分别装入试管中, 每个试管 5~7 块。 2%的琼脂条和 2% 蔗糖煮沸溶解后分装在有土豆块的试管中,经 121℃高压灭菌 15min 后,制作成斜面备用。 一 (2) 补充培养基(供 lys 活化用) 在基本培养基中按 5mg/100mL 量加入赖氨酸,即为补充培养基,其它相同。

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(3)杂交培养基 将玉米粒浸泡 24h 后洗净,每支试管装 3 粒。将 2%的琼脂条和 2%的蔗糖煮沸溶解后, 分装含有玉米粒的试管中,经过 12l℃、15min 高压灭菌,最后,摆放制作成斜面备用。 2 菌种活化 从冰箱中取出低温保存的 lys+和 lys-菌种,在无菌条件下把 lys+接种在活化基本培养基 上;把接 lys-接种在补充培养基上。接种后将试管放在 25℃条件下培养 5~6 天,直至试管 中长出许多菌丝,并且有大量的分生孢子产生时表明菌种已经活化成功。 菌种活化不要时间过长,否则,菌丝和分生孢子老化,影响杂交成功率。 3 杂交与培养 将活化的两种菌种(lys+和 lys-)同时接种到杂交培养基上,接种菌丝体和分生孢子都 可以。然后,在培养基表面放一小块多次折叠的滤纸片,塞上试管棉塞,接种后的试管放 25℃恒温培养箱中培养。培养二周后,便有黑色颗粒状子囊果出现,但还没有完全成熟。培 养到三周左右时,子囊果基本成熟,可以在显微镜下观察。镜检观察的最佳时间是杂交后第 23~25 天。 4 显微镜观察与分析 (1)先在长有子囊果的试管中加入少量无菌水充分摇动,将分生孢子混合在水中。把水 倒入烧杯中加热煮沸,防止分生孢子飞扬。 (2)用接种针挑选个大、饱满的子囊果放在载玻片上,滴加一滴 5%次氯酸钠溶液浸泡 2min 左右。次氯酸钠的作用主要是对子囊果壁起腐蚀作用,以便将子囊果压破。压片时用 力不宜过大, 因为一次分裂产生的 8 个子囊孢子顺序地排列在一个子囊中, 观察时要以子囊 为单位进行统计。若用力过大,8 个子囊孢子被压出子囊都分散开了,不利于观察。 (3)试验结果的统计与分析 借助显微镜观察 8 核子囊中黑、白子囊孢子的排列顺序。根据子囊孢子的 6 种类型排 列顺序进行观察、 分类和统计。 将观察到的子囊类型和数目填表 12 中 (观察总数不少于 100 个) 。应用着丝点作图原理,对统计结果进行计算分析,求得交换值和图距,绘制染色体连 锁图。 表 12 链孢霉杂交子囊类型与数量统计表 子囊类型 ++++-------++++ ++--++---++--++ ++----++ --++++-总计 思考题 1 掌握单倍体细胞基因定位原理和分析方法。 2 掌握计算图距方法 把观察到的数字代入公式,计算出交换值
交换值 ? 交换子囊数(即 M 2 分离子囊数

观察数



子囊总数

? 100 % ?

1 2

交换值除去%,即作为图距。绘制遗传学图谱, 3 图示 6 种子囊类型的形成过程。
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主要参考资料 1 刘祖洞、江绍慧: 《遗传学实验》 ,高等教育出版社,1991 2 吴鹤龄等: 《遗传学实验方法和技术》 ,高等教育出版社,1983 3 滕利荣: 《生物学基础实验教程》 ,吉林科学技术出版社,2003 4 沙利文等: 《果蝇实验指南》 (影印版) ,科学出版社,2004 5 Gerald karp: cell and Molecular Biology concepts and Experiments 《 印版) ,高等教育出版社. 2002

3rd edition》 影 (

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