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蛋白质综述


蛋白酶的研究与进展
The research and advance of protease

蛋白酶的研究与进展
摘要
蛋白酶是一类极为重要的工业生产和应用的酶类, 现今已广泛的应用于食品 行业、洗涤行业、皮革行业、医药卫生行业、饲料行业等。蛋白酶在国外的研究 已经较为深入, 而在我国关于蛋白酶的研究和发展还有很大的空间。本文主要关 于蛋白酶的性质、应用、菌种选育和分类等方面进行了综述,并且对于蛋白酶的 发展进行了展望。 关键词:蛋白酶 应用 菌种选育

The research and advance of protease
Abstract
protease is one of very important enzymes of industrial production and application,and it was be widely used in the food industry, washing industry, leather industry, medicine and health care industry, fodder industry and so on. protease has researched more thoroughly in abroad, however, it has a lot of space of protease’s research and advance in our own country. This paper mainly summarized that the protease’s nature, application, strain breeding, classification and so on, at the same time, it has looked into the distance of protease. Keywords: protease, application, strain breed

一、蛋白酶的基本信息
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蛋白酶是酶学研究最早的催化蛋白质水解的一类酶, 是水解蛋白质多肽链肽 解的一类酶的总称, 蛋白酶与生物体内的生理活动和疾病的发生密切相关,如食 物消化吸收,血液凝固,溶血,炎症,调节血压,细胞分化自溶,机体衰老、癌 症转移,生理活性肽的活化等[1]。蛋白酶在动物内脏、植物茎叶、果实和微生物 中广泛存在[2],但由于微生物具有生长快速、生长条件较为简单,代谢过程特殊 和分布广等特点,使得微生物成为蛋白酶的重要来源,最主要来源于细菌、放线 菌和真菌中[3]。目前所用蛋白酶一般都是中温蛋白酶,最适酶活温度一般都在 50℃左右,产酶菌的最适生长与产酶温度在 30℃以上。 1957 年我国开始对蛋白酶进行研究,经过 40 多年来几代人的努力,已具备 一定的规模和水平,无论是酶的品种、产量和发酵水平上都有很大提高,个别酶 制剂的发酵活力还达到国际领先水平。蛋白酶是一种用途广泛的酶制剂,各种蛋 白酶已广泛使用在我国工农业生产的各个方面,有力地促进了有关行业的发展, 但总体来说与国际先进水平相比各方面还有相当差距, 我国碱性蛋白酶研究总体 趋势发展较好, 主要集中在高温耐碱性蛋白酶和常温碱性蛋白酶的研究,而酶活 力不高仍是当前工业化工生产的一个最主要限制因素, 高产碱性蛋白酶基因的筛 选、克隆及表达方面的研究将为碱性蛋白酶活力的大大提高做出巨大的贡献[4]。 目前,国外蛋白酶由于运用于多个行业,因此市场出现了供不应求的现象,其高 产菌株的选育主要用基因工程技术和蛋白质工程手段进行工业微生物菌种的定 向选育,目的性强,而且酶的结构也研究的比较深入,相信随着对蛋白酶研究的 进一步深入,市场蛋白酶紧缺的现象将有所缓解[5,6]。

二、蛋白酶的分类
蛋白酶有外肽酶和内肽酶两大类,外肽酶对第五的 C 端或 N 端的肽键有作 用,内肽酶只能水解大分子蛋白内部的肽键,是真正的蛋白酶。 2.1 蛋白酶按活性中心分类 2.1.1 丝氨酸蛋白酶:最适 PH 为 9.5-10.5,碱性蛋白酶,部分为中性。广泛存 在于动物胰脏 、细菌 、霉菌中,活性中心含丝氨酸残基,酶活性可受到二异丙 基磷酰氟( D F P),苯甲基磺酰氟 ( PMSF) 和马铃薯抑制剂( P I) 等的专一性抑 制。生产碱性丝氨酸蛋白酶的微生物有节杆菌、链霉菌、黄杆菌、芽孢杆菌等细 菌,在酵母、链孢霉、曲霉、担子菌等真菌中也存在碱性蛋白酶,丝氨酸蛋白酶 依其专一性还可分为胰蛋白酶型、 糜蛋白酶型、 粘细菌型和葡萄球菌型四种类型。 其中地衣芽孢杆菌生产的碱性蛋白酶因广泛使用在洗涤剂中,故知名度最高。
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2.1.2 金属蛋白酶:最适 PH7~8,主要为中性蛋白酶,活性中心大多数含 Zn2+等 二价金属,可受到金属螯合剂 EDTA 或菲绕呤( OP)的抑制。中性蛋白酶主要广 泛存在于曲霉、芽孢杆菌、链霉菌等中,许多曲霉除生产中性蛋白酶外还生产酸 性蛋白酶以及外肽酶,中性蛋白酶易自溶,使得酶的提取和应用都产生困难。 2.1.3 天门冬氨酸蛋白酶:最适 PH2.0~5.0,在酸性稳定,PH 高于 6 时迅速失活, 胃蛋白酶、真菌酸性蛋白酶都是活性中心含天门冬氨酸的酸性蛋白酶。 2.1.4 半胱氨酸蛋白酶:PH 除个别为酸性外其余为中性,也称为巯基蛋白酶,广 泛存在于原核生物和真核生物中,这类酶受到对氯汞苯甲酸( PCMB)的专一性抑 制,但 DFP、金属螯合剂对其无影响。 2.2 按其作用的最适 PH 分类 分为酸性蛋白酶,中性蛋白酶和碱性蛋白酶。

三、蛋白酶的性质
3.1 碱性蛋白酶的性质 碱性蛋白酶的分子量多数集中在 18~35Kda,少数达到 45Kda 或 82Kda,也 有部分只有 8Kda。大部分碱性蛋白酶的最适 PH 为 9~11,少数蛋白酶的 PH 可 达更高。部分二价金属离子如 Fe2+、Mg2+、Mn2+等都能显著提高蛋白酶的活性, 同时蛋白酶还具有强烈的底物特异性和自我剪切能力,并且受到温度、PH 等外 界环境的影响。 微生物碱性蛋白酶均为胞外酶,与动植物源碱性蛋白酶相比具有 下游技术处理相对简单、价格低廉、来源广、菌体易于培养、产量高、高产菌株 选育简单、快速、具有动植物碱性蛋白酶所具有的全部特性,并且相对中性蛋白 酶具有更强的水解能力和耐碱能力,有较大耐热性且有一定的酯酶活力,易于实 现工业化生产,使得碱性蛋白酶的研究成为研究的热点[7]。 3.2 中性蛋白酶的性质 微生物来源的中性蛋白酶分为细菌性中性蛋白酶、真菌性中性蛋白酶、以及 其它来源的中性蛋白酶。中性蛋白酶是最适作用 PH 介于 6.0~7.5 之间的一类蛋 白酶,作为一种生物催化剂,它具有催化的反应速度快,无工业污染等优点,而 且耐热性相对较低, 在食物蛋白水解物的生产过程中成为控制酶活力的关键,大 多数微生物中性蛋白酶中含有金属元素,部分酶蛋白含有一分子锌,起着酶同底 物之间的桥梁作用, 有些酶分子中尚含有若干原子的钙,钙离子能增加中性蛋白 酶的稳定性[8]。 3.3 酸性蛋白酶的特性
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在白酒酿造中已发现能分泌酸性蛋白酶的主要是各种霉菌,如曲霉、根霉、 青霉等,另外根据国外文献报道,在白酒及啤酒酿造过程中,所使用的酵母菌不 仅可产生孢内酸性蛋白酶,还可分泌孢外酸性蛋白酶。酸性蛋白酶作用的最适 PH 值一般在 PH2~4,但不同微生物的酶稍有差异。酸性蛋白酶一般在 50℃ 以下 可保持稳定, 但也随产酶微生物菌种不同而有所差异。一般来说酸性蛋白酶的抑 制剂主要是重氮酮化合物和十二烷基硫酸钠, 霉菌酸性蛋白酶通常不受胃蛋白酶 抑制剂对-溴苯的抑制,但对 N-溴氮琥珀酰亚胺和高锰酸钾敏感,且并非每种酸 性蛋白酶都会被胃蛋白酶抑制剂或链霉素胃蛋白酶抑制剂(S-PI)抑制[9]。

四、蛋白酶高产菌株的选育
对产酶菌株的产酶能力进行定向或非定向的改造时,可以利用传统的物理、 化学因子单独或复合诱变选育高活力菌株, 或利用原生质体技术选育蛋白酶高产 菌株,还可以利用基因工程技术进行高产菌株的构建和选育。 陈向东等人 [6] 以利福平抗性及牛奶平板上产生的透明水解圈的大小作为选 择标记,用钴 60 对实验室筛选获得的碱性蛋白酶高产菌株地衣芽孢杆菌 C6 进 行诱变处理,筛选获得了一株酶产量大幅度提高的菌株 I.106,经发酵条件优化, 其产酶活性稳定在 19000U/ml 左右,是出发茼株的 1.9 倍,与出发菌株相比, 该菌的发酵周期也有所缩短,而产酶的最适温度和最适 pH 保持小变,并保持了 芽孢形成较少的优良特性,具有良好的实际应用潜力[10][11]。薛林贵[7]等人使用一 株从土壤中分离出的碱性蛋白酶产生菌,对其进行重离子辐照诱变处理,获得的 突变株再次经重离子诱变, 从大量突变株中筛选出两株碱性蛋白酶高产菌株,与 出发菌株相比较,两株突变株的活力分别提高了 1.58 倍和 2.65 倍,当对突变株 的发酵条件进行优化以后,该菌株的酶活力有了进一步的提高[12]。张秀江等人[8] 采用紫外线和亚硝酸基胍联合的技术对一株具有产酸性蛋白酶能力的黑曲霉菌 株进行诱变,结果表明突变后的菌株产酶能力与出发菌株相比提高了 46 倍[13]。 袁艳玲等人[9]利用紫外线和化学诱变剂硫酸二乙酯联合的技术对一株产中性蛋 白酶的米曲霉菌株进行诱变,突变后的菌株与对照菌株相比产酶能力提高了 108.5%[14]。

五、蛋白酶的生产
蛋白酶是用途最广泛的酶制剂之一, 其广泛使用不不仅简化了有关行业的生 产工艺,节约了投资,降低了原材料消耗,提高了产品得率与产量,对改善环保
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减少二氧化碳的排放也作出了积极贡献[15][16]。 影响微生物蛋白酶生产的因素十分复杂, 同一种微生物因培养条件不同可生 产多种蛋白酶,芽孢杆菌大多数是好气性不产毒素和非致病性的,培养容易,广 泛用于中性蛋白酶和碱性蛋白酶的生产,真菌主要是曲霉(米曲霉、黑曲霉) , 根霉、毛霉和栗疫霉,也是生产中性和酸性蛋白酶的菌种。微生物蛋白酶系组成 至为复杂,同一种酶用电泳、层析等分离技术还可以分离出若干分子量、氨基酸 组成、最适 PH、温度及等电点等不同的组成,用免疫学抗原抗体反应也可以看 出酶的氨基酸序列和构象上的异同。 细菌的中性、 碱性蛋白酶通常是用液体深层培养法生产的,而霉菌蛋白酶则 更适于采用固体培养法生产,固体培养不易污染,管理容易,节省能源,单位容 器产量高,日本和欧洲不少工厂广为采用。但需要注意,在两种培养方式下,同 一菌种所产蛋白酶即使在相同活性水平下,有时固体培养的实用效果更好。固体 培养物经过辐照或环氧乙烷灭菌处理, 视用途不同而可直接作为粗酶来使用以降 低成本,例如用于饲料添加剂、制革工业或其它。 微生物生产蛋白酶与生长有关, 芽孢杆菌中性蛋白酶在对数生长期与细胞生 长同步产生, 而碱性蛋白酶则在对数生长期末芽孢形成时大量生成,芽孢形成起 到产酶的触发作用。 不能形成芽孢的突变株一般不能大量合成碱性蛋白酶,丧失 蛋白酶合成能力的突变株不能形成芽孢。曲霉固体培养时,蛋白酶活性在分生孢 子老熟时达到最大值,液体培养中当菌体衰老自溶时,蛋白酶活性达到高峰。菌 种突变或培养条件变化能使产酶期或酶系组成发生变动。

六、蛋白酶的应用
蛋白酶最多的应用于洗涤剂,其次是饲料、食品工业、酿酒制造,以及制革 工业和医药, 近年来随着人们环境保护意识的增强,工业上提倡使用环境友好型 生产工艺,为进一步推广蛋白酶的应用创造了有利条件。 蛋白酶在食品领域的应用极为广泛,主要为简化和改进食品加工工艺,反应 在常温下进行,可节省能源和设备投资,亦可缩短生产周期,同时由于食品中的 蛋白质成分在蛋白酶的作用下分解成小分子肽, 可以提高或改善食品的营养价值 和膳食功能,以此提高食品的品质,蛋白酶还可驱除食品中的不良风味、有毒物 质和过敏物质。 蛋白酶在医药领域的应用也极为广泛, 主要是在一些对某些疾病具有特殊治 疗效果的新型蛋白类药物的开发中, 蛋白酶类药物在治疗一些顽固性疾病中具有
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显著疗效。酶疗法是用酶作为药品治疗疾病的手段,在治疗用酶中,蛋白酶几乎 占了一半以上, 蛋白酶在临床治疗上是作为消化剂、 消炎剂以及外科的清创剂和 其它。 研究表明, 由 2~3 个氨基酸构成的小肽, 在肠道的吸收性甚至比氨基酸还 要好, 一些矿物元素通过与小肽的结合更容易被机体所吸收。由酪蛋白用胰酶水 解得到的一种 10 肽,叫酪蛋白磷酸肽( CCP),具有促进钙铁吸收的作用;由大 豆蛋白、 鱼肉蛋白、 酪蛋白酶水解得到的一种可有 2~12 个氨基酸组成的抑制血 管紧张素的小肽( A2CE I P),可控制血压,因不像化学合成的血管紧张素抑制剂 ( ACE I)之会对肾脏有损害而备受人们关注。 蛋白酶在资源环境方面的应用也非常广泛, 在废弃资源的利用和新型资源的 开发方面发挥着重要作用,而且在环境保护方面也发挥着非常有效的作用。

七、蛋白酶的发展前景
目前有关蛋白酶的研究主要集中在不同材料中蛋白酶的分离纯化与性质、 蛋 白酶的应用以及新型蛋白酶源的开发等方面。 蛋白酶在生物化工技术生产中是应 用比较成熟的工艺之一,在生产实践中的应用极大的带动了社会生产力的发展, 为人类的进步作出了巨大贡献。蛋白酶现已应用到食品、医学、工业生产等多个 领域之中, 如何通过现今的技术如基因工程技术、酶技术和微生物技术等将蛋白 酶的生产工艺简化扩大生产,使其原料来源更廉价更广泛,蛋白酶的产量更高, 获得纯度更高, 酶活力更强的蛋白酶, 并将产品蛋白酶应用到更广泛的领域中去, 即拓宽酶的应用范围, 利用酶蛋白开发出更多优质有益的产品是现今主要的研究 目标。其中碱性蛋白酶的最适 PH 较高,且多具有良好的 PH 稳定性,生产的使 用条件简单,酸性和中性蛋白酶应用广泛,在多种行业都有潜在的应用价值。

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