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植物组织培养


植物组织培养 绪论 P1 第一章 植物组织培养的基本原理 P3

第二章 植物组织培养的基本原理 P6 第三章 植物器官和组织培养 P11

第四章 胚胎培养及离体授粉 P16 第五章 花药和花粉培养 P20

第六章 植物细胞培养 P24 第八章 第九章 原生质体培养 P27 植物离体繁殖 P30

第十章 无病毒苗木培育 P33 植物组织培养基本操作 P35

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绪论

植物组织培养的概念 植物组织培养是在无菌和人工控制的环境条件下,利用适当的培养基,对离体的植物器官、 组织、细胞及原生质体进行培养,使其再生成细胞或完整植株的技术。 由于培养的植物材料已脱离母体,又称为植物离体培养(Plant culture in vitro)。 广义:对植物的器官、组织、细胞及原生质体进行离体培养技术 植物组织培养 狭义:对植物的组织(分生组织、表皮组织、薄壁组织等)及培养 产生的愈伤组织进行离体培养。 1. 无菌:使培养器皿、器械、培养基和培养材料等处于无真菌、细菌、病毒等微生物的状 态,以保证培养材料在培养器皿中正常生长和发育。 2. 人工控制的环境条件:对光照、温度、湿度、气体等条件进行人工控制,以满足植物培 养材料在离体条件下的正常生长和发育。
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3. 外植体:由活体(in vivo)植物体上提取下来的,接种在培养基上的无菌细胞、组织、 器官等。 (植物组织培养中,使用的各种器官、组织和细胞统称为外植体。 ) 4. 愈伤组织:外植体因受伤或在离体培养时,其未分化的细胞和已分化的细胞进行活跃的 分裂增殖而形成的一种无特定结构和功能的组织。 (在人工培养基上由外植体上形成的一团 无序生长状态的薄壁细胞。 ) 植物组织培养的特点 植物组织培养的主要特点是采用微生物学的实验手段来操作植物离体的器官、组织和细胞。 具体特点表现在: 1)组织培养的整个过程都是在无菌条件下进行的,外植体、培养基、接种环境都须经 过无菌处理。 2)组织培养在多数情况下是利用成分完全确定的人工培养基进行的,除少数特殊情况 (进行营养缺陷型突变细胞的筛选) 外, 培养基中包含了植物生长所需的水分和一切大量元 素、微量元素、有机物和植物激素,培养基的 PH 和渗透压也是人为设定的。因此,在组织 培养中的植物材料不需依靠自身的光合作用制造养分,而是处于完全的异养状态。

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3)组织培养的起始材料可以是植物的器官、组织,也可以是单个的细胞(如小孢子) 和三倍体细胞(如胚乳)水平上,即使是去掉了细胞壁的细胞(原生质体)在组织培养条件 下也能再生完整植株。 4)组织培养物通过连续继代培养可以不断增殖,形成克隆(clone,也称无性繁殖系) , 或通过改变培养基成分,特别是其中的植物激素的种类和配比,而达到不同的实验目的,如 茎芽增殖或生根。 5)组织培养是在封闭的容器中进行的,容器内气体和环境条件可通过瓶塞或其他封口 材料进行交换。容器内的相对湿度在通常情况下几乎是 100%。因此,组培苗叶片表面一般 都无角质层或蜡质层,且气孔保卫细胞功能缺乏,气孔始终都是张开的。 6)组织培养的环境温度、光照强度和时间等都是人为设定的,找出这些物理因素的最 适参数对组培成功也很重要。 植物组织培养的类型 广义的组织培养依外植体不同,可分为: 1、器官培养(organ culture) :对植物体各部分器官及器官原基进行离体培养的方法。 常用的植物器官有:根、茎、叶、花、果实、种子 2、组织培养(tissue culture) :对植物体的各部分组织进行离体培养的方法。 常用的组织有:分生组织、形成层组织、薄壁组织、韧皮部组织等。 茎尖分生组织培养 愈伤组织培养
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3、细胞培养(cell culture)对植物单个细胞或较小细胞团进行离体培养的方法。 常用的细胞有:性细胞、叶肉细胞、根尖细胞、韧皮部细胞等。 4、胚胎培养:对植物成熟和未成熟胚以及具胚器官进行离体培养的方法。 常用的材料有:幼胚、成熟胚、胚乳、胚珠、子房等。 5、原生质体培养(protoplast culture): 植物组织培养的研究任务

植物组织培养的形成与发展 植物组织培养的研究历史可以追溯到 19 世纪中期,其开拓和发展的理论基础是植物细胞的 全能性,即植物的每个核细胞具有母体全部基因,在离体培养下,都有分化、发育成完整植 株的潜在能力。 该领域的发展历史可分为开创、奠基和建立三个阶段。

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植物组织培养的形成于发展—开创 1、 1838-1839 年,德国科学家 Schleide 和 Schwann 发表了细胞学说,奠定了组织培养的 理论基础。 该学说的基本内容是:一切生物都是由细胞构成的,细胞是生物体的基本单位,细胞只 能是由细胞分裂而来。 2、1902 年,德国植物学家 Haberlandt 根据细胞学说,提出单个细胞的植物细胞全能性 (totipotency)理论。 他提出:高等植物的器官和组织,可以不断分割,直至单个细胞,这种单个细胞是具有 潜在全能性的功能单位,即植物细胞具有全能性。他在论文中写道:虽然经常观察到细胞的 明显生长,但从未观察到细胞分裂。 这位先驱者失败的原因是:实验材料高度分化;培养基过于简单。 3、 1904 年, Hanning 最先成功地培养了萝卜和辣根菜的胚。 发现离体胚可以充分发育成熟, 并提早萌发形成小苗。 1922 年,美国学者 Knudson 采用胚培养法获得大量兰花幼苗。 4、1922 年,德国学者 Kotte 和美国学者 Robbins 进行了豌豆、玉米、棉花的茎尖和根尖离 体培养,发现离体培养只能进行有限的生长,未发现培养细胞有形态发生能力。
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5、1925 年,Laibach 培养亚麻种间杂交幼胚获得成功,证明了胚培养在植物远缘杂交中的 可能性。 植物组织培养的形成与发展—奠基 20 世纪 30-50 年代,影响立体培养材料生长和发育的一些重要物质,如天然提取物、B 族维 生素、 生长素(auxin)、 细胞分裂素(cytokinin)的发现, 促使植物组织培养的研究迅速发展, 特别是分裂素与生长素的比例控制器官分化( differentiation)的激素模式的建立,使植 物组织培养技术与理论体系得以形成。 Gautheret (1937,1938)在他培养的柳树形成层的培养基中加入这些物质, 使生长大大加快, 随后,他用胡萝卜的小外植体培养也获得成功。 1926 年, 植物生理学家 Went 首先发现了可以促进子叶鞘生长的物质, 1930 年证实了这种物 质是生长素——吲哚乙酸。 1937 年, White 又发现了 B 族维生素和 IAA 对植物根离体生长的作用, 并用 3 种 B 族维生素 ——VB6、VB1 及 VB5,取代椰汁获得成功,建立了第一个由已知化合物组成的培养基。 1933 年,中国学者李继侗和沈同首次报道了利用天然提取物进行组织培养的研究。他们利 用加有银杏胚乳提取物的培养基,成功培养了银杏的胚。

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1934 年,White 用番茄根尖经继代培养 400 余天(有的书上说,28 年培养了 1600 代),建立 起第一个活跃生长的无性繁殖系,从而使非胚器官的培养首先获得成功。 1941 年,Van Overbeek 等将椰乳加入到培养基中,使曼佗罗的心形期胚离体培养成熟,并 推测椰乳中含有促进细胞分裂和生长的生理活性物质。 法国的 Nobecoort(1937,1938)培养胡萝卜根和马铃薯的块茎薄壁组织,细胞增殖获得成功。 不久,White(1939)报到了烟草中间杂种(Nicotianaglauca×N.longsdorffi)幼茎切段原形 成层组织的培养,继代培养也获得成功。 在 White 和 Gautheret 工作中所确立的植物组织培养的基本方法, 成为以后进行各种植物组 织培养的基础技术,奠定了植物组织培养的基础。1943 年 White 发表了《植物组织培养手 册》(《A Hand Book of Plant Tissue Culture》)的专著,使植物组织培养开始形成一门 新兴的学科。 四十年代,Skoog 和崔徵(1948)在烟草茎切段和髓培养以及器官形成的研究中,发现腺嘌呤 或腺苷可以解除培养基中生长素对芽形成的抑制作用, 而诱导形成芽, 从而确定了腺嘌呤 / 生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一。这一比例高时产生芽,比例低时产生根, 相等时则不分化。
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1956 年 Miller 等发现了激动素,知道激动素可以代替腺嘌呤促进成芽,并且效果约可增加 3 万倍。确立了控制器官分化的激素模式为激动素/生长素的比例关系。这种器官发生的激 素调空模式的建立为植物组织培养中完整植株的再生奠定了理论基础。 1953 年,Muir 利用往复式摇床的振荡,在液体培养基中进行了万寿菊和烟草愈伤组织的培 养,获得了单细胞或密集细胞的悬浮液,并可继代增殖。这既是培养方法上的突破,也是 Haberlandt 培养单细胞设想的实现。 1958 年,英国学者 Steward 和 Reinert 几乎同时在胡萝卜根组织的韧皮部单细胞悬浮培养 中发现,体细胞在形态上可转变为与合子胚相似的结构,其发育过程也与合子胚类似。由于 它是从体细胞分化而来,因而称为体细胞胚或胚状体。这一实验证实了 Haberlandt 的细胞 全能性理论。 植物组织培养的形成于发展—建立 1958 年,Wickson 和 Thimann 发现,应用外源细胞分裂素可以打破顶端优势,促使休眠的侧 芽启动生长,从而形成微型的多枝多芽小灌木丛状结构。 1960 年,Morel 提出了利用茎尖离体快速无性繁殖兰花属的方法,该方法繁殖系数极高,并 能脱毒,国际上相继形成了“兰花工业” ,并实现了试管苗产业化。

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1962 年,Murashinge 和 Skoog 在烟草培养中筛选出至今仍被广泛使用的 MS 培养基。 1960 年,英国学者 Cocking 用真菌纤维素酶酶解分离番茄根和烟草叶片,获得了原生质体, 开创了原生质体的培养。 1971 年,日本学者 Nagata 和 Takebe 首次将烟草叶肉原生质体培养的再生植株。 1985 年,Fujimura 获得了第一例禾谷类作物—水稻原生质体培养的再生植株。 1986 年,Spangenberg 获得了甘蓝型油菜单个原生质体培养的再生植株。 1972 年,Carlson 通过两个种的烟草原生质体融合培养,获得了第一个体细胞杂交的杂种 植株。 1974 年,Kao 利用聚乙二醇进行了大豆和烟草科间原生质体的融合。 1953 年,Tulecke 首先培养银杏成熟花粉获得了愈伤组织。 1964-1966 年,印度科学家 Guha 和 Maheswari 在曼陀罗花药培养中首次由花粉诱导得到了 单倍体植株。 1969 年,Kaul 发现三角叶薯蓣悬浮培养物可以生产薯蓣皂苷配基,其量为干重的 1.5%。 目前,利用组织培养途径生产的次生产物有皂苷类、生物碱、甾醇类、醌类、氨基酸和蛋 白质等。 植物组织培养的形成与发展—应用及展望 1、植物离体快繁 运用组织培养的途径,一个单株一年可以繁殖几万到几百万个植株。例如一株葡萄一年 繁殖到 3 万多株,一株兰花一年繁殖到 400 万株。 2、无病毒苗木培育 针对病毒对农作物造成的严重危害, 通过组织培养可以有效地培育出大量的无病毒种苗。 已经取得成功的有马铃薯、草莓、香蕉、葡萄等等。 3、次生代谢物的产生 有些极其昂贵的生物制品,如抗癌首选药物--紫杉醇等,可以用大规模培养植物细胞来 直接生产。 4、培育新品种或创制新品种 1)培育远缘品种:利用组织培养可以使难度很大的远缘杂交取得成功,从而育成一些罕 见的新物种。比如辽宁果树研究所利用这种方法获得苹果与梨的杂交种。 2)离体选择突变体:采用组织培养可以直接诱变和筛选出具抗病、抗盐、高赖氨酸、高 蛋白等优良性状的品种。 中国林科院用逐步加大培养基中盐的浓度, 直接获得耐盐的杨树株
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系。 3)单倍体育种 5、植物种质资源的离体保存 6、人工种子 意义: 1)结构完整、体积小、便于贮藏与运输,可直接播种和机械化操作。2)不受季 节和环境限制,利于工厂化生产。3)利于繁殖周期长、自交不亲和、珍贵稀有的植物,也 可大量繁殖无病毒材料 4)可在人工种子中加入抗生素、菌肥、农药等成分,提高种子品质 5)体细胞胚由无性繁殖体系产生,可固定杂种优势。 7、 基因工程的应用 (1)培育的优质、高产的转基因大豆新品种,蛋白质含量比标准品种提高 45%-48%,产 量提高 10%-20%。 (2)将鱼的抗冻基因导入番茄,获得了耐寒、高产的转基因番茄。转基 因抗盐马铃薯也获得成功.

第一章

植物组织培养的基本原理

第一节:植物组织培养实验室
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一、实验室要求 环境要求:理想的植物组织培养实验室应该建立在安静、清洁、远离污染源的地方,最 好在常年主风向的上风方向, 尽量减少污染。 规模化生产的实验室最好建在交通方便的地方, 便于产品的运送。 需考虑两个方面:一、所从事实验的性质 二、实验室规模

实验室设置的基本原则:科学、高效、经济和实用。 二、实验室组成 (一)基本实验室 基本实验室包括准备室、无菌操作室、培养室、缓冲间,是植物组织培养实验所必须具 备的基本条件。如进行工厂化生产,年产 4 万-20 万,需 3-4 间实验用房,总面积 60 平方 米。 实验室必须满足 3 个基本需要: 实验准备 (培养基制备、 器皿洗涤、 培养基和培养器皿灭菌) 、 无菌操作和控制培养。 1、准备室

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功能:进行一切与实验有关的准备工作:器皿洗涤、培养基配制与分装、培养基和培养 器皿的灭菌、培养材料的预处理等。 要求:20 平方米左右。要求宽敞明亮、以便于放置多个实验台和相关设备,方便多人同 时工作; 同时要求通风条件好, 便于气体交换; 实验室地面应便于清洁, 并应进行防滑处理。 设备:准备室应具备工作台、柜橱、水池、仪器、药品等。 分类: 分体式-研究性质实验室, 可将准备室分解为药品贮藏室、 培养基配制与洗涤室和灭菌室等, 功能明确,便于管理,不适于大规模生产。 通间式-规模化实验室,设计成大的通间,试验操作的各个环节在同一房间内按程序完成。 便于程序化操作与管理,减少各环节间的衔接时间,提高工作效率。还便于培养基配制、分 装和灭菌的自动化操作程序设计, 减少规模化生产的人工劳动, 更便于无菌条件的控制和标 准化操作体系的建立。 2、无菌操作室 功能:也叫接种室,进行材料的离体无菌操作,是植物离体培养研究或生产中最关键的一 步。
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要求:房间一般不宜过大,10-20 平方米即可。要求封闭性好,干燥清洁,能较长时间保 持无菌,因此不宜设在容易受潮的地方;为便于消毒处理,地面及内墙壁都应采用防水和耐 腐蚀材料;地面要求平坦无缝,便于清洁;为了保持清洁,无菌室应防止空气对流。 一般新建实验室的无菌室在使用之前应进行灭菌处理, 处理方法是甲醛和高锰酸钾熏蒸, 并 需定期灭菌处理,还可用紫外线照射 1-2h/周,或每次使用前照射 10-30min。 设备:无菌操作室安装有紫外灯和空调,工作台和搁架,还有超净工作台和整套灭菌接种 仪器、药品等。 3、培养室 功能:对接种到培养瓶等器皿中的植物离体材料进行控制条件下的培养,实验材料进行 培养的场所。 要求:10-20 平方米左右。要求能够控制光照和温度,并保持相对的无菌环境。因此, 培养室应保持清洁和适度干燥; 为满足植物培养材料生长对气体的需要, 还应安装排风窗和 换气扇等换气装置;为节省能源和空间,应配置适宜的培养架,并应安装日光灯照明。 研究用实验室,通常可根据光照时间设置成长日照、中日照、短日照培养室,也可以根据温 度设置成高温和低温培养室,每一个培养室的空间不宜过大,便于对条件的均匀控制。进行

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精细培养类型如细胞培养和原生质体培养,可采用光照培养箱或人工气候箱代替培养室。 设备:培养架、光照培养箱或人工气候箱、边台用于拍摄培养物生长状况,除湿机、显 微镜、温湿度计、空调等。 4、缓冲间 功能:进入无菌室前的缓冲场地,减少人体从外界带入的尘埃等污染物。人员在此换上工 作服、拖鞋、口罩,才能进入无菌室和培养室。 要求:3-5 平方米,在准备室外或无菌操作室外,应保持清洁无菌;备有鞋架和衣帽挂钩。 设备:1-2 盏紫外灯对衣物进行灭菌、灭菌工作服、拖鞋、口罩。 (二)辅助实验室 根据研究或生产的需要而配套设置的专门实验室, 主要用于细胞学观察和生理生化分析 等。 1、细胞学实验室 功能:对培养材料进行细胞学鉴定和研究, 分为制片室和显微观察室。 制片是获取显微观察数据的基础,制片室配备有切片机、磨刀机、温箱及样品处理和切片 染色设备,通风橱和废液处理设施。 显微观察室主要有显微镜和图像拍摄、处理设备。 要求:明亮、清洁、干燥、防止潮湿和灰尘污染。 2、生化分析实验室 培养细胞产物为主要目的实验室,应建立相应的分析化验实验室,随时对培养物成分进 行取样检查。大型次生代谢物生产,还需有效分离实验室。
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第二节 仪器设备和器皿用具

一、基本设备配置

(一)常规设备

1、天平 植物组织培养实验室需要不同精度的天平。 感量 0.001g 的天平(分析天平)和感量 0.0001g 的天平(电子天平)用于称量微量元素

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和一些较高精确度的实验用品。 感量 0.01g 和 0.1g 的天平,用于大量元素母液配制和一些用量较大的药品的称量。 2、冰箱 各种维生素和激素类药品以及培养基母液均需低温报存, 某些试验还需植物材料进行低温 处理,普通冰箱即可。 3、酸度计 用于测定培养基及其它溶液的 pH,一般要求可测定 pH 范围 1-14 之间,精度 0.01 即可。 4、离心机 用于细胞、原生质体等活细胞分离,亦用于培养细胞的细胞器、核酸以及蛋白质的分离 提取。根据分离物质不同配置不同类型的离心机。 细胞、原生质体等活细胞的分离用低速离心机;核酸、蛋白质分离用高速冷冻离心机; 规模化生产次生产物,还需选择大型离心分离系统。 5、加热器 用于培养基的配制。 研究性实验室一般选用带磁力搅拌功能的加热器, 规模化大型实验室 用大功率加热和电动搅拌系统。 6、其它 纯水器、分装设备
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(二)灭菌设备

维持相对的无菌环境是植物组织培养实验室的基本要求。 1、高压灭菌锅 用于培养基、玻璃器皿以及其它可高温灭菌用品的灭菌,根据规模大小有手提式、立式、 卧式等不同规格。 2、干热消毒柜 用于金属工具如镊子、剪刀、解剖刀,以及玻璃器皿的灭菌。一般选用 200℃左右的普通 或远红外消毒柜。 3、过滤灭菌器 用于一些酶制剂、激素以及某些维生素等不能高压灭菌试剂的灭菌,主要有真空抽滤式 和注射器式。 4、紫外灯

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方便经济的控制无菌环境的装置,缓冲间、接种室和培养室必备。

(三)无菌操作设备

1、接种箱 使用较早的最简单的无菌装置,主体为玻璃箱罩、入口有袖罩,内装紫外灯和日光灯,使 用时对无菌室要求较高。 2、净化工作台 其操作台面是半开放区,具方便、操作舒适优点,通过过滤的空气连续不断吹出,大于 0.03um 直径的微生物很难在工作台的操作空间停留,保持了较好的无菌环境。由于过滤器 吸附微生物,使用一段时间后过滤网易堵塞,因此应定期更换。

(四)培养设备

指根据需要所选用的不同规格和控制精度的用于植物细胞、组织和器官培养的设施和设 备。 1、培养架

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目前植物组织培养实验室植株繁殖培养的通用设施。成本低、设计灵活、充分利用培养空 间。一般有 4-5 层,层间间隔 40-50cm,光照强度可根据培养植物特性来确定,一般每架上 配备 2-4 盏日光灯。 2、培养箱 细胞培养、原生质体培养等要求精确培养的实验,可用光照培养箱、CO2 培养箱、湿度 控制培养箱等培养。 3、摇床:进行液体培养时,为改善通气状况,可用振荡培养箱或摇床。 4、生物反应器:进行植物细胞生产次生产物的实验室,还需生物反应器。

(五)其他设备

时间程序控制器、温度控制系统或空调、实体显微镜、倒置式生物显微镜及配套的摄影、 录像和图像处理设备、电泳仪、萃取和层析设备、紫外分光光度计、高效液相色谱仪、气相

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色谱仪、酶联免疫测定系统。

二、培养容器与用具

(一)培养容器:包括各种规格的培养皿、三角瓶、试管、培养瓶。一般分为: 玻璃容器—一般用无色并不产生颜色折射的硼硅酸盐玻璃材质。 塑料容器—材质轻、不易破碎、制作方便,广泛使用。一般为聚丙烯、聚碳酸酯材料的 培养容器

(二)金属用具 1、镊子:植物组织解剖用小的尖头镊子,分株转移繁殖转接用枪型镊子,16-22cm 长。 2、剪刀:不锈钢医用弯头剪,做取材和切段转移繁殖,14-22cm 长。 3、解剖刀:进行组织切段,多用短柄可换刀片的医用不锈钢解剖刀。 4、其他用具:接种铲、接种针在花药培养、花粉培养中有用。
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三)塑料用具:各种封口膜、盖、塑料盘及其它实验用具。

第三节:基本操作

一、洗涤

(一)重铬酸钾洗涤法 饱和重铬酸钾洗液的配制方法是:将 43g 重铬酸钾溶与 1000ml 蒸馏水(20℃可以达到饱和 状态) ,制成重铬酸钾饱和水溶液。然后缓慢加入浓硫酸,最后使重铬酸钾饱和水溶液以浓 硫酸比例达到 1:1。在配制过程中,只能把浓硫酸缓慢加入进去,决不可把重铬酸钾水溶 液加入浓硫酸中,因会产生大量热量而来不及扩散,从而引起浓硫酸溅出。 洗涤方法: 一般用具:用水洗净玻璃器皿,晾干后放入重铬酸钾洗涤液中,浸泡 1 夜,第二天取出,用 自来水冲洗,然后用蒸馏水洗两次。干燥后备用。 小的玻璃制品法:

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吸管:先用自来水冲洗,放在特制的防腐不锈钢网筒内,用重铬酸钾浸泡一夜,再将网筒放 入虹吸式自动冲洗装置中,用自来水冲洗数十次,最后用蒸馏水冲洗,干燥后备用。 (二)洗涤剂洗净法 重铬酸钾洗液的最大缺点是铬离子会造成环境污染,因此,应尽量避免使用。 普通无磷中性洗涤剂,是理想的选择。 (三)超声波洗净法 这是一种物理的洗净法,对环境无任何污染,而且对比较顽固的污垢也十分有效,但超声波 发生器容量有限,因此,常用来清洗较小的玻璃仪器和器械。 方法:将玻璃制品放入超声波洗净器中,注入自来水,设定时间,然后进行处理,拿出用自 来水冲净,蒸馏水冲洗。 (四)玻璃器皿的清洗 新购置的玻璃器皿:带有游离的碱性物质,先用 1%的稀盐酸浸泡 1 夜,再用肥皂水洗净, 清水冲洗,蒸馏水冲淋,烘干。 已用过的培养器皿:去掉培养基,洗涤剂溶液浸泡,刷子刷洗,自来水冲洗,蒸馏水冲洗。 较脏的玻璃器皿:洗衣粉或洗洁精刷洗,冲净,浸入洗涤液中,按 上面方法洗涤,浸泡时 间根据脏的程度定。 被污染的玻璃器皿:121 高压蒸汽灭菌后,用洗涤剂刷掉污染物,冲洗,重铬酸钾洗涤液浸 泡,2h 后取出,自来水冲洗,蒸馏水冲淋。 用过的吸管或滴管:在洗涤液中浸泡 2h 以上,取出冲洗干净。 洗净后的玻璃器皿应透明发亮,内外壁水膜均匀,不挂水珠。
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第二章 植物组织培养的基本原理

植物细胞全能性理论是植物组织培养的核心理论。 离体细胞具有生命的特征属性,在全能性的基础上,提供合适的营养和环境条件,离体细胞 经历脱分化和再分化过程

第一节:植物细胞全能性和细胞分化

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植物细胞的全能性(totipotent):植物细胞具有该植物体全部遗传的可能性,在一定条件 下具有发育成完整植物体的潜在能力。 原理: 生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质, 都有发育成为完整个体 所必需的全部基因,从理论上讲,生物体的每一个活细胞都应该具有全能性。 差异: (1) 受精卵的全能性最高 (2) 受精卵分化后的细胞中,体细胞的全能性比生殖细 胞的低。 潜在全能性的原因:基因表达的选择性 科学研究表明,处于离体状态的植物活细胞,在一定的营养物质、激素和其他外界条件的作 用下,就可能表现出全能性,发育成完整的植株。 人工条件下实现的这一过程,就是植物组织培养。 分化:植物体各个部分出现异质性的现象,可以在细胞水平、组织水平或器官水平上表现出 来。 细胞分化:导致细胞形成不同结构,引起功能改变或潜在的发育方式改变的过程。 细胞分化是组织分化和器官分化的基础,是离体培养再分化和植株再生得以实现的基础。
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第二节:离体条件下植物器官的发生

脱分化 (dedifferentiation): 将来自已分化组织的已停止分裂的细胞从植物体部分的抑制 性影响下解脱出来,恢复细胞的分裂活性。 再分化 (redifferentiation):离体培养的植物细胞和组织可以由脱分化状态重新进行分化, 形成另一种或几种类型的细胞、组织、器官,甚至形成完整植株,这个过程称为再分化。 一、脱分化和再分化 类型: (1)细胞水平的再分化 (2)组织水平的再分化(3)器官水平的再分化:器官型和 器官发生型(4)植株再生:先芽后根、先根后芽、芽根同时 二、影响细胞脱分化和再分化的因素 (一)影响细胞脱分化的因素 1、损伤 2、生长调节剂 3、光照 4、细胞位置 5、外植体的生理状态 6、植物种类差异 (二)影响细胞再分化的因素 因素: (同上) 原因:1、不同植物种类再分化能力差异很大 2、对某些植物的植物再生条件还没有完

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全掌握 三 愈伤组织培养 (一)愈伤组织形成、生长和保持 1、愈伤组织的形成 在脱分化过程中,大多数情况下形成愈伤组织。愈伤组织的结构往往是异质的,无明显 极性,其形成过程可分为诱导期、分裂期和分化期。 1)诱导期(启动期) :是愈伤组织形成的起点。 是指细胞准备进行分裂的时期。 2)分裂期:外植体的外层细胞出现了分裂,中间细胞常不分裂,故形成一个小芯。由于外 层细胞迅速分裂使得这些细胞的体积缩小并逐渐恢复到分生组织状态,细胞进行脱分化。 特征:细胞分裂快,结构疏松,缺少有组织的结构,颜色浅而透明。 3)分化期:停止分裂的细胞发生生理代谢变化而形成由不同形态和功能的细胞组成的愈伤 组织,在细胞分裂末期,细胞内开始发生一系列形态和生理变化,导致细胞在形态和生理功 能上的分化,出现形态和功能各异的细胞。 2、愈伤组织的生长 诱导期后,外植体外层细胞开始出现分裂,在组织受伤表面形成一种创伤形成层,愈伤组织 的细胞数目迅速增多。 愈伤组织在生长过程中的生理生化变化: 1)在诱导期和分裂始期,每个分裂细胞中的 RNA 含量迅速增加,并达到一个高峰,但在继 续分裂的过程中,RNA 的含量减少。2)同工酶谱发生变化。3)连续继代培养可能改变次生 物质的积累水平或能力。4)延长培养期可能使愈伤组织对生长素的需求发生变化,导致生 长素的自给和自养,出现驯化现象. 愈伤组织的质地明显不同,有松脆和致密两种类型,但它们之间是可以相互转变的。 一般加入较高浓度生长素,可使致密的愈伤组织变的松脆;而降低或去除生长素或加入高 浓度的细胞分裂素,往往使愈伤组织变的致密。 3、愈伤组织的保持 大多数情况下,随继代培养代数的增加和培养时间的延长,愈伤组织表现出生长势下降、褐 变、分化和形态发生能力逐渐降低甚至死亡或形态发生能力完全丧失。 这种情况的发生主要是遗传和生理因素所致。前者包括染色体畸变、基因突变等;后者是细 胞或组织内激素平衡的改变或细胞对外源生长物质的敏感性的改变。 因生理因素导致的形态 发生能力下降可通过改变培养条件而得以改善。
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由愈伤组织再分化的形态发生方式也有体细胞胚胎发生和器官发生两种,后者具体包括:先 芽后根;先根后芽;在愈伤组织不同部位形成芽和根,然后芽、根的维管束接通形成完整植 株;仅形成芽或根。

第三节 植物体细胞胚胎发生

体细胞胚胎发生:植物离体培养细胞产生胚状体的过程。

一、植物体细胞胚胎发生过程

(一)体细胞胚胎发生过程 不同种类的植物体细胞胚胎发生的主要发育阶段的划分是不一致的, 但一般可分为胚性 愈伤组织诱导、体细胞胚胎诱导、体细胞胚胎早期分化发育、体细胞胚胎成熟、体细胞胚胎 萌发和成苗五个阶段。 在双子叶植物上, 体细胞胚胎发生经过原胚、 球形胚、 心形胚、 鱼雷形胚和成熟胚阶段。 在禾本科植物的成熟体细胞胚上,可以清楚看到胚特有的结构,即盾片、胚芽鞘和胚根 等。 (二)胚性和非胚性细胞或愈伤组织生理状态的差异 胚性细胞与分生组织类似,通常较小,近圆形,具有较大的核和核仁并能高度染色,胞质 浓厚。 典型的胚性愈伤组织外表呈松脆颗粒状。与非胚性细胞或愈伤组织组织相比,DNA、RNA 以 及蛋白质的合成更为活跃,表现为含量和种类的增加、淀粉和可溶性糖含量增加、内源多胺 含量升高、活性氧水平提高、同工酶谱和内源激素合成有明显变化等。 (三)体细胞胚胎发生的基因表达机理(略)
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二、植物体细胞胚胎发生途径

(一)体细胞胚胎发生的方式 由外植体诱导体细胞胚胎发生的途径有两种:直接途径和间接途径。 直接途径:从外植体某些部位的胚性细胞直接诱导分化出体细胞胚胎。这种“胚性细胞”

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是在胚胎发生之前就已决定了的。 间接途径:外植体先脱分化形成愈伤组织,在从愈伤组织的某些细胞,即重新决定为胚性 细胞的细胞分化出体细胞胚胎,多数体细胞胚胎的形成是通过间接途径产生的。 分两个阶段完成: 1)胚胎发生丛(EC)的形成:愈伤组织中常含有两种类型的细胞,一种具有大液泡的细胞, 通常失去胚胎发生潜能,在培养基中易散开;另一种液泡小、细胞质浓的小细胞,这种小细 胞聚集为丛状。被称为 EC。EC 表面是高度分生组织化的细胞,一个 EC 表面可产生大量的胚 状体。 2)胚状体的发育:EC 通常在原培养基上不能使其表面的胚状体发育,但 EC 可以增殖、崩 溃而不衰。EC 崩溃是由于 EC 中心的细胞增加,并膨胀使 EC 崩溃,崩溃后分生性的表面细 胞结合成群,又形成新的 EC。EC 在转入降低或去除生长素、降低还原氮的培养基后,才能 完成胚状体发育。 (二)体细胞胚胎的起源(略)

三、植物体细胞胚胎发生的极性和生理隔离

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体细胞胚胎具有两个明显特点: 1、双极性 2、与母体组织或外植体的维管束系统无直接联系,处于较为孤立的状态,即存在生理隔离。 (一)体细胞胚胎发生的极性 单个胚性细胞与合子胚一样,具有明显的极性,第一次分裂多为不均等分裂,顶细胞 继续分裂形成多细胞原胚,基细胞进行少数几次分裂形成胚柄。 (二)体细胞胚胎发生的生理隔离 被子植物的胚囊减数分裂后, 形成的大孢子与周围细胞处于分开的状态。 在小孢子发 生时,小孢子母细胞在减数分裂前期也与绒毡层的细胞间没有联系。 在多数植物中都观察到, 早期的胚性细胞与周围细胞还存在胞间连丝, 但随着胚性细 胞的发育,细胞壁加厚,胞间连丝消失或被堵塞。胚性细胞开始分裂,从二细胞原胚到多细 胞原胚始终被厚壁包围,与周围细胞形成明显的界限。

第四节、影响植物离体形态发生的因素

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植物离体培养中,外植体的基因型和生理状态、培养基、培养条件等是影响离体形态发生的 主要因素。

一、植物种类和基因型

不同物种和同一物种不同基因型,其形态发生能力往往有巨大差异。

二、培养材料的生理状态

1、植物的发育年龄 2、培养器官或组织类型: 1)种子、幼胚和下胚轴易形成胚状体,茎段、叶片比较困难;双子叶植物形态发生常用 的外植体依次为叶、茎、胚轴、子叶等;单子叶植物特别是禾本科植物,细胞分裂旺盛的分 生组织或器官,如叶基部、茎尖、幼胚、胚珠、幼花序轴等是极好的外植体。
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2)同一器官不同部位的组织,其再生器官能力也不同。3)外 植体的大小对器官再生有 影响。4)不同季节来源的外植体,其形态发生的能力也有差异。 5)供体植物的生长环境 也影响外植体的生理状态。 3、培养时间和细胞倍性: 愈伤组织培养时间过长或继代培养次数太多,往往会推迟或降低形态发生的能力,所以 一般均取处于旺盛生长期的愈伤组织材料来诱导器官的形成。 但是对于某些植物的胚状体发 生,往往需要愈伤组织培养较长时间或多次继代培养。 细胞倍性也影响形态发生能力。高渗透压条件下,容易启动花粉粒单倍性细胞生长和分 化,容易得到花粉胚状体,而花药壁来源的二倍体细胞的生长和分化都受到明显抑制。

三、培养基

1、植物营养 1)一般认为,培养基中的铵态氮和 K+有利于胚状体形成,提高无机磷的含量可促进器官发 生,不加还原氮有利于根的形成等。

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用于茎尖培养和芽诱导的培养基主要是 MS 及其修改的配方和 B5 培养基。 2)碳水化合物种类及浓度对体胚发育有重要作用,缺糖或低糖常无法形成胚状体。 3)其他物质如氨基酸、天然复合物常不同程度地促进器官和胚状体发生。 2、 物理性质: 固态或液态、 渗透压以及 PH 等, 对器官或胚状体的形成及发育也有明显影响。 3、植物生长调节剂 植物生长调节剂是影响植物离体形态发生的最关键因素。 1)生长素:植物离体形态发生过程中,生长素促进外植体生长、生根,并与细胞分裂素共 同作用诱导不定芽分化及侧芽的萌发与生长。 由于植物外植体中原来有的内源激素种类和浓度不同,需添加的激素种类及浓度也就不 同。有些外植体诱导芽或无根苗形成时,需补加一定量的生长素,或与分裂素一起补加才显 出作用。 3、植物生长调节剂 2)细胞分裂素:促进分化和芽形成,抑制根发育与衰老。分裂素可促进也可抑制体胚发生, 这主要取决于植物的种类及基因型。 3)赤霉素:促进茎的伸长,打破休眠,对芽的诱导和形成有促进作用。 4)乙烯:对芽的诱导和形成有促进或抑制作用,这与植物种类及处理时间有关。 5)脱落酸:增强胚性愈伤组织的形成和体胚发生,防止畸形胚形成,抑制体胚过早萌发, 促进胚中贮藏成分。
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四、培养条件

1、光 1)光照强度:不同植物及不同材料对光照强度要求不同。一般情况下,植物所需的光照强 度为 1000-5000lx。光照强度对培养物的增殖、器官分化、胚状体形成都有重大影响。 2)光照长度:一般情况下,植物每日所需的光照时间为 10-16 小时。 3)光质:不同波长的光对细胞分裂和器官分化有影响。对苗再生最有利的光谱是蓝光区, 根的发生则是红光区较有利。 2、温度 不同植物要求的最适温度不同。一般园艺植物的生长适温为:文竹 17℃,百合 20℃, 杜鹃 25℃,石刁柏 26℃,月季 25-27℃,葡萄 28℃,番茄 28℃。

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植物愈伤组织的培养 愈伤组织培养是指将母体植株上的各个部分切下,形成外植体,接种到无菌的培养基上,进 行愈伤组织诱导、生长和发育的一门技术。 一般情况下,植物组织均能诱发形成愈伤组织,由外植体形成愈伤组织,标志着植物离体培 养的开始。

一 愈伤组织的诱导

(一)诱导原理

1、细胞全能性 植物每一细胞具有全套遗传信息, 在特定环境下能进行表达, 而产生一个独立完整的个体。 只要有一个完整的膜系统和一个有生命力的核, 即使已经是高度分化的植物细胞, 也还保持 恢复到分生状态的能力。其恢复能力取决于该细胞原来所处的部位和生理状态。 2、脱分化现象 一个已经停止分裂的成熟细胞转变为分生状态,并形成未分化的愈伤组织的现象。 植物离体培养中的脱分化过程:植物离体培养利用特定的条件, 促进细胞脱分化, 使原已 分化并具有一定功能的细胞脱离原轨道, 失去其原有状态和功能, 而恢复到未分化的愈伤组 织状态。 3、诱导程度 双子叶植物比单子叶植物容易 细胞容易 幼年细胞组织比成年细胞组织容易 二倍体细胞比单倍体
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(二)诱导方法 1、根据不同的培养目的,获取不同的外植体。 植株茎的切段、叶、根、花和种子,或某些组织切成片或块状,均可接种到培养基上。 接种时需考虑材料的一致性,来源、产地、大小、形状、生理部位。常选组织块较大的 材料。 2、操作程序 获取外植体材料-消毒处理-修整除去坏死组织-切成 5mm 的圆柱形或方形小块-直放或

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倒放到培养基上-每 9cm 培养基接种 5-6 块外植体-培养。 采用圆形的原因: 能得到外形简单结构相同的材料 圆形的表面积大 圆柱形的外植体有利于组织块与外界进行物质和气体交换;也使外植体表面促进愈伤组 织形成的分泌物较多,诱导率增高。 培养基 MS 培养基;激素 IAA、NAA、2,4-D、BA;椰子汁、番茄汁、酵母提取物。

二、愈伤组织细胞的分化 (一)诱导期 诱导期是细胞正在准备分裂的时期。 1、诱导期特征 细胞质增加,出现活跃的原生质流动,贮藏物质淀粉等消失;随着组织的活化,细胞内 核糖体增加并形成大量多聚核糖体;RNA 迅速合成和累积;但细胞大小无多大变化。 2、影响愈伤组织诱导的因素 (1)植物种类、生理状况、外部因素不同,诱导期不同。 (2)弱光下植株比强光下的 植株外植体易于诱导分裂 (3) 二氧化碳抑制诱导分化 (4) 生长调节剂诱导细胞开始分裂 (5) 损伤剌激能加速脱分化进行,有时还是某些材料能否脱分化的决定条件。 (6)离体培养后细 胞变化: (7)气体交换迅速增加;RNA 出现; (8)蛋白质发生周期性变化; (9)酶水平变化。 (二)分裂期 分裂期是指细胞脱分化,细胞通过分裂不断增生子细胞而形成愈伤组织的过程。 植物分裂期脱分化规律: 胡萝卜等脱分化较禾谷类容易 茎叶较花器脱分化 幼嫩茎组织比老组织较容易 2、分裂期愈伤组织特征: 细胞数目增加、体积变小、核和核仁变大、RNA 含量持续上升。从培养外植体的形态 变化来看,表现为外层细胞迅速分裂。当细胞体积最小,细胞核和核仁最大,RNA 含量最高 时,标志着细胞处于分裂高峰时期。
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分化期主要变化为 1、细胞分裂部位和方向发生改变 2、分生组织瘤状结构和维管组织形成 3、细胞体积不再 减小 4、出现各种类型细胞 5、颜色变化

三、愈伤组织的继代培养

(一)培养基和培养条件 1、培养基 1)常用于愈伤组织继代培养的培养基有 MS、N6。 2)细胞分裂素/生长素比例控制器官发生的模式: IAA/KT 高,利于根形成;IAA/KT 低,利于芽的分化;IAA/KT 适中,则产生愈伤组织 天然提取物: 椰乳,浓度 10%;番茄汁,浓度 5-10%;香蕉汁 5,浓度-10% 注意: -植物离体培养中,及时更换植物生长物质的种类和浓度,才能有效控制器官的分化。 -生长物质用量影响器官分化。IAA、IBA 处理根比较壮,2,4-D 对生根不利。BA 比 KT 诱 导芽效果强,ZT 作用窄。 3)有机成分 酪氨酸明显增强烟草组织的器官形成 酰胺类促进器官形成 水解酪蛋白、水解乳蛋白为多种氨基酸混合物 腺嘌呤促进茎切段培养中芽的形成 糖提供外植体能量,维持一定水势 4)物理性质 ⑴培养基形式、水势,对形态发生有明显影响 诱导愈伤组织-固态培养基; 细胞和体细胞胚增值-液态培养基, 胚状体发育成苗-固态培养 基 ⑵培养基 PH 值对芽分化有影响 :5.5-6.0 2、培养条件 1)光照 愈伤组织培养中,某些植物诱导要求在黑暗中生长,大多数都需要光。
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有的葡萄品种对短日照敏感,烟草愈伤组织需要蓝光。 2)温度:一般 24—28℃,有些植物需要一定昼夜温差。

(二)继代培养物的分化潜力 1、生理因素 多次继代后不加 IAA 也可达到同样生长量。 不同培养物保持分化潜力不同。 丧失分化能力的组织,加入腺嘌呤、酪蛋白、酵母汁后,可恢复一定分化能力。 2、遗传因素 继代培养中易出现染色体紊乱,分化能力丧失与倍性不稳定有关。

(三)继代培养物的体细胞变异 后生遗传变异: 即离体培养组织在培养中获得激素的自主性 (有外源激素才能生长的组织, 后期自身产生 激素) 。 影响后生遗传变异产生的因素主要有: 1、组织自然倾向 2、培养基化学成分和物理状态
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四、 愈伤组织的形态发生

概念: 极性—植物细胞分化中的一个基本现象,指植物的器官、组织、甚至单个细胞在不同轴向上 存在的某种形态结构以及生理生化上的梯度差异。 细胞无性系—植物离体培养中,任何形式的细胞培养所产生的植株,即称细胞无性系。 植物愈伤组织离体培养中,脱分化形成无极性或无明显形态的愈伤组织块。当条件适合时, 愈伤组织发生再分化而产生芽或根的分生组织,甚至体细胞胚,进而发育成苗或完整植株。 愈伤组织的形态发生有以下两种情况:

一、不定芽和根的发生(器官发生) 是愈伤组织培养物或细胞培养中常见的器官发生方式。

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(一)愈伤组织通过不定芽和根形成器官的阶段 1、外植体脱分化-愈伤组织 2、愈伤组织-瘤状结构 3、瘤状结构-器官原基 (二)愈伤组织的器官发生顺序 1、无芽的根或无根的芽:愈伤组织仅有芽或根器官的分别形成,不能形成完整植株。 2、先芽后根 愈伤组织先形成芽,芽生长后,其基部发出根,进而形成小植株,是大多数植物的器官发 生方式。如苹果、葡萄、柑橘、番茄、菊花、小麦、水稻 3、先根后芽:先形成根,再从根的基部分化出芽形成小植株,双子叶植物中普遍。如颠茄、 枸杞、苜蓿 4、分别形成芽和根 愈伤组织邻近不同部位分别形成芽和根,两者结合起来形成一株小植株,类似根芽的天 然嫁接。如胡萝卜、石刁柏

二、体细胞胚的发生 (一)胚状体的概念
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胚状体-离体培养下没有经过受精过程, 但经历了胚胎发育过程所形成的胚的类似物, 统 称为体细胞胚或胚状体。 胚状体可以从花药或花粉培养、愈伤组织培养、离体器官培养、单细胞悬浮培养中产生。 (二)胚状体的发育过程 细胞分化——持续细胞分裂增殖——原胚期——球形胚——心形胚——鱼雷形胚——子 叶期 (三)胚状体的类别 1、体细胞胚 来源于根、茎、叶和它们的组织和细胞,经离体培养而发生的类胚结构,染色体组为两 套,可发育成为正常植物体。 2、生殖细胞胚 来源于大小孢子细胞,经离体培养而形成的类胚结构,染色体为单套,可发育成单倍体 植物体,经染色体加倍成为可育植物。 3、三倍体胚 来源于胚乳细胞的胚状体,具三套染色体组。三倍体植物具不育性。

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(四)胚状体形成植株的特征 1、具有两极性 细胞发育早期阶段, 从其相反的两端分化出芽端与根端, 而不定芽和不定根都是单向极性。 2、胚状体的维管组织与外植体的维管组织无解剖结构上的联系,而不定芽和不定根往往总 是与愈伤组织的维管组织相联系 3、胚状体的维管组织的分布是独立的“Y”形,而不定芽和不定根的维管组织无此现象。 (五)胚状体发生影响因素: 铵态氮对胚状体的发生有利,也可同时使用铵态氮和硝态氮 赤霉素、细胞分裂素抑制胚状体发生 生长素类对胚状体的发生有重要作用 (六)胚状体形成植株的优点 1、胚状体的数量比不定芽多 2、胚状体可制成人工种子,便于运输和贮藏 3、胚状体的有性 后代遗传性更接近母体植株。

四、 愈伤组织培养的应用

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除茎尖分生组织培养和部分器官培养外, 所有培养形式最终都要经历愈伤组织才能产生再生 植株,愈伤组织也常是悬浮培养的细胞和原生质体的来源。 外植体不经愈伤组织发育成器官两种情况: 1、外植体中已存在器官原基,进一步形成相应的组织器官进而再生植株,如茎尖、根尖 分生组织培养。2、外植体某些部位的细胞,在重新分裂后,直接形成分生细胞团,然后由 分生细胞团形成器官原基。

(一)愈伤组织培养多种用途: 1、研究植物生长发育与分化的机制、遗传变异规律,对植物遗传育种有特殊意义 2、大规模工厂化生产有用化合物,或用于细胞培养筛选工业、农业、医药生产上有用的 无性系,或用于原生质体来源。 实践证明,愈伤组织不仅是一种植物快繁的新手段,同时也是品种改良,种质资源保存 和有用化合物生产的理想途径 。

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(二)在园艺植物育种中的应用: 1、加快园艺植物新品种和良种繁育速度,迅速高效低成本 2、培养无病毒苗木 3、获得倍 性不同植株,易染色体核内加倍育种有利用价值 4、克服远缘杂交困难 5、利于种质资源长 期保存 6、提供育种中间材料 7、诱发和离体筛选突变体 8、制造人工种子 植物离体培养中的器官发生类型: 不定芽型—诱导顶端分生组织产生不定芽,再生成植株的方式。顶芽、腋芽培养。多数 植物培养采用。 特点:繁殖率高、遗传稳定性好 器官型—从器官外植体诱导不定芽,再生成植株的方式。茎、叶、花器、鳞片培养。 特点:繁殖速度慢,遗传性状较稳 器官发生型—从器官外植体诱导愈伤组织, 经愈伤组织细胞的分化再生成植株的方式。 点:繁殖速度快、遗传性状不稳定 类胚体发生—由植物体器官、 组织和细胞培养而直接发生类胚结构, 最后以胚状体成苗的方 式。 特点:遗传性一致,体细胞发生数量大 原球茎型—兰属特有的器官发生方式,种子培养发生原球茎,原球茎直接长成植株。 特点:遗传较稳、繁殖率不高
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第三章

植物器官和组织培养

第一节 植物器官和组织培养的基本程序

1、无菌外植体的获得: (一)茎尖、茎段、叶片的灭菌 清水冲洗,吸干—0.1-0.2%氯化汞浸泡 2-10min, (70%酒精浸泡数秒,10%次氯酸钙浸泡 10-20min 或 2%次氯酸钠浸泡 15-30min) —灭菌水冲洗 3-5 次—无菌滤纸吸干—分割—接种。 (二)根、块茎、鳞茎的灭菌 生长在土中,灭菌困难,以受损伤。 灭菌前仔细清洗,加大灭菌剂浓度或延长灭菌时间。 (三)花蕾的灭菌

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未开放的花蕾中的花药为花被包裹,处于无菌状态,采摘后可直接灭菌。 70%酒精浸 泡 10-30s—0.1-0.2%氯化汞浸泡 3-10min, (或 1%次氯酸钠浸泡 10-20min)—灭菌水冲洗 3-5 次—无菌滤纸吸干—分割—接种。 (四)果实和种子的灭菌 表皮有茸毛或蜡质,需在灭菌剂中加入几滴土温 -80 。果实 70% 酒精浸泡数秒— 0.1-0.2%氯化汞浸泡 3-10min, (或 1%次氯酸钠浸泡 10-20min)—灭菌水冲洗 3-5 次—无菌 滤纸吸干—分割—接种。

2、初代培养物的建立 (一)无菌环境 培养基、接种器械、超净工作台、 接种室环境、抗生素物质(去除侵入组织内部的病菌。 见表) (二)规范操作:操作技术熟练、工作经验、操作者、进入超净工作台的物品表面。 (三)条件合适:培养基种类、激素种类和浓度、其他添加物、外植体来源、生长发育状态、 培养条件。
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3、形态发生和植株再生 建立的无菌培养物在适宜的离体环境中,生长发育(形态发生)形成完整的小植株。 离体材料的形态发生的途径:器官发生,体细胞胚胎发生 器官发生:芽或芽原基起源于培养组织中比较表层的细胞,即外起源。根原基发生在组织较 深处,即内起源。两者之间一般没有什么联系,呈现单向极性。 胚状体发生:极大多数体细胞胚起源于单细胞,形成的胚状体具有双极性,在其发育的早期 阶段, 在方向相反的两端分化出茎端和根端, 其维管组织与母体植物或外植体的维管组织通 常没有联系。胚状体维管组织呈独立的 Y 形。

4、外植体形态发生形成完整植株的途径 (一)外植体-愈伤组织-完整植株。 具体又可分为三种: 1、愈伤组织-同时长芽和根-植株。2、愈伤组织-茎-根-植株。3、愈伤组织-根-芽-植株。4、 愈伤组织-体细胞胚-植株

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(二)外植体-胚状体-植株。可从以下几种培养物中产生: 1、器官上发生。2、愈伤组织上发生。3、游离单细胞发生。4、小孢子发生。 诱导胚状体比诱导芽数量多、速度快、结构完整。 5、培养产物的观察与记载 (一)愈伤组织 诱导率=产生愈伤组织的外植体数/外植体总数×100% 生长量=培养一段时间后愈伤组织干重或鲜重-接种时愈伤组织的干重或鲜重 (二)胚状体:胚状体诱导率=产生胚状体的外植体数/外植体总数×100% (三)芽:芽分化数=产生芽的外植体数/外植体总数×100% (四)根:发根率=发根芽数/培养芽数每个材料平均发根数

第二节 植物营养器官培养

一、离体根的培养 植物根段培养是指以植物的根切段为外植体进行培养的技术。 (一)根无性系的建立
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来自无菌种子发芽产生的幼根切段或植物根系经灭菌处理后的切段, 可以以两种方式进行培 养,建立根的无性繁殖系。 1、根的直接增殖 1)根无性繁殖系的建立 将种子进行表面消毒, 在无菌条件下进行无菌萌发, 待根伸长后从根尖一段切取长 1.0cm 的根尖,接种培养基中。 这些根的培养生长很快,番茄根每天约生长 10mm,几天后发育出侧根。待侧根生长约一 周后,即可切取侧根的根尖进行扩大培养,它们又迅速生长出侧根,又可切下进行培养,如 此反复,就可得到从单个根尖衍生而来的离体根的无性系。 2)培养条件:黑暗培养,温度为 25—27℃ 3)培养基 离体根培养所用的培养基很多, 多为无机离子浓度低的 White 培养基, 其他培养基如 MS、 B5 培养基等也可采用,但必须将其离子浓度稀释到 2/3 或 1/2。 4)培养方式 离体根的培养方式有三种类型

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第一种固体培养法, 即将根尖接种在固体培养基上, 根依靠培养基中的养分和生长物 质而不断生长。 第二种是液体培养法, 把根尖接种在无琼脂的液体培养基中, 经常振荡使根获得充足 的氧气。 第三种是固体-液体培养法,就是把根基部插入固体琼脂培养基中,根尖浸在液体培 养基中,根尖生长而根不断的伸长和分枝。 2、根的间接增殖 ? 第一步在脱分化培养基上诱导形成愈伤组织,如胡杨的根段培养,可诱导形成白色 愈伤组织。 ? 第二步在再分化培养基上诱导形成芽的分化, 如胡杨从绿色愈伤组织分化出小植株。 (二) 离体根生长的营养要求 1、无机成分 要求培养基中有全部必要元素,因为它是离体生长所需要的,一般的为 MS、 B5 培养基。 2、氮源 氮源有铵态氮、硝态氮和可溶性有机氮如氨基酸或酰胺等,其中以硝态氮的效果 最好。加入含各种氨基酸的水解酪蛋白,能促进离体根的生长。 3、碳源 以蔗糖的效果最佳,几乎为葡萄糖的 10 倍。蔗糖的浓度为 2—3%。 4、维生素 维生素以 B1 和 B6 最为重要,缺少它根的生长受到阻碍,而加入它可使根的生 长成倍的加快。B1 的使用浓度为 0.1-1.0mg/L 为宜。 5、生长物质 对离体根的生长而言,生长素的效应最为明显,在一般情况,加入适量的生 长素能促进根的生长,其反应和需要量因植物种而异: 6、温度和光照 黑暗有利于根的形成,温度一般在 16-25℃ 7、PH 根发生和生长所需的 PH 范围一般为 5.0-6.0
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二、茎段培养 茎段培养是指对植物的带有一个以上定芽或不定芽的外植体(包括块茎、球茎、鳞茎等在内 的幼茎切段)的无菌培养。 目的:1、快速繁殖,2、探讨茎细胞的分裂潜力和全能性,以及诱发细胞变异,筛选突变体。 茎段培养用于快速繁殖的优点: 培养技术简单易行,繁殖速度较快,每年可增殖 105-1012 株苗; 加速良种和珍贵植物的繁殖,芽生芽方式增殖的苗木质量好,且无病,性状均一;

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解决不能用种子繁殖的无性繁殖植物的快速繁殖的问题,且可节省种株; 试管苗便于运输和防止种苗带菌传播,有利于国际种质交流; 试管苗可用于保存某些难以用种子保存的种质资源。 1、无菌苗的建立 目的:从所取用的外植体诱发芽的形成,以获得无菌苗。 可能有四种不同结果: 一是得到单生芽,二是得到丛生芽:细胞分裂素水平高时三是得到长根的完整植株。四是得 到愈伤组织:生长素水平较高时作为快速繁殖而言,我们希望属于第一、第二结果,它有利 于提高繁殖系数,加速繁殖速度。 2、无菌苗的增殖 ⑴增殖的途径 一是诱导形成大量的胚状体二是诱导形成大量的不定芽三是促进腋芽的快速形成。 优缺点: 第一、二种途径的好处是增殖速度快,但会产生变异,第三种途径的好处是不会产生变异, 能保持品种优良特性,且方法简便,可在各种植物上使用,但增殖速度不如前二者。若用于
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育种,以第一、第二种途径有利,而用于良种快速增殖,以第三种途径有利,主要是要保证 良种的优良品性,不产生变异。目前已广泛采用,每年每个芽可增殖 10 万株乃至上百万株。 腋芽增殖的原理: 高等植物的每个叶腋中都有腋芽存在,通常由于顶芽的存在,顶端优势阻止腋芽的生长,但 在一定的条件下可以使它生长,如除去顶芽或使用生长激素,可以解除顶端优势,腋芽便不 断分化和生长,逐渐形成芽丛。 若反复切割这些腋芽和移植到新的培养基中继代培养,就可在短期内得到大量的芽。 影响增殖成功的关键因素 A、细胞分裂素 在腋芽增殖上的主要措施是用细胞分裂素抑制顶端优势,促进腋芽生长发育,所以在这 一阶段培养基中添加细胞分裂素是必须的。 实践证实,除个别的例子外,加入细胞分裂素是行之有效的。6-BA 对促进腋芽增殖是最 有效,依次为 KIN 和 2ip。一般浓度在 0.25mg/l 以上,少数用 1.0mg/L,个别的用 5mg/L。 B、生长素 生长素虽不能促进腋芽增殖,但可改善苗的生长,因此,许多种植物也都加入一定的生

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长素类物质。 其中使用最多的是 NAA, 依次为 IBA、 IAA 和 2, 4-D, 它们的使用浓度多为 0.5mg/L 以下。 C、GA:GA 对芽的伸长有促进作用,故常加入少量的 GA,使用浓度为 0.5mg/L。 D、光照 光 照 条 件 也 十 分 重 要 , 这 一 阶 段 必 须 保 持 适 当 的 光 周 期 (16 小 时 光 照 ) 和 光 强 (2000-3000Lux),以利芽的再生和生长。 3、无菌苗的生根 ? 这个阶段的目的是使再生的大量试管苗形成根系,获得完整的植株,在前两阶段以 长苗为目的,使用的生长激素往往不利于生根的发生和生长,因此在这个阶段,必 须创造一个适于根的发生和生长的条件。 ? 主要是降低或除去细胞分裂素,而加入或增加生长素。 影响生根成功的关键因素 ①培养基的盐浓度 试管苗的生根,对基本培养基的种类要求不严,一般的培养基都可用于诱导生根,但对其 含盐浓度要适量加以稀释。前面的几种培养基中,除 White 培养基外,都富含 N、P、K 盐, 它们都抑制根的发生。因此,应将它们降低到 1/2、1/3 或 1/4,甚至更低的水平。就可得 到理想的生根结果。 ②生长素的浓度 细胞分裂素同生长素的比值大于 1 时,有利于芽的产生和生长;比值小于 1 时,则有 利于根的产生和生长。 由于在苗增殖时施用了较高浓度的细胞分裂素, 其苗中尚保持着一定的量, 因此在生 根培养时一般不需要添加细胞分裂素,或者仍使用较低浓度的细胞分裂素,如降低到 0.02mg/L 以下。 生长素是必须的, 且需要较高的浓度。 使用的生长素类物质最多的是 NAA, 依次为 IBA、 IAA、2,4-D。生长素的浓度,NAA 一般是 0.1-1.0mg/l 不等。IBA 和 IAA 可稍高些 。 ③光照和温度条件 增强光照有利于发根, 且对成功地移栽到盆钵中有良好作用, 故在生根培养时应增加 光照时间和光照强度。 但强光直接照射根部会抑制根的生长, 所以在生根培养基时最好在培 养基中加入 0.3%的活性碳,可促进生长。 4、试管苗的移植
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1)盆土的准备 土最好是经过干热灭菌、高温高压灭菌,或者用福尔马林(5%)或(0.3%)硫酸铜稀释 液喷洒在土壤中,然后用塑料布覆盖一周,在翻动土,让其溶液气味挥发掉。 为了有利于试管苗根系的发育,要求移栽土疏松,因此与 1/2—1/3 的草木灰混合起来 作为移植的介质。也可以用山土和腐熟过的木屑或其它通气良好的介质。 2)遮荫和加热设备的准备 试管苗在冬天或夏天移栽时,最初的几天里要注意温度与日照的变化不能有急剧的变 化,温度最好与培养室的温度一致或接近。 光也不能直射, 主要因为植株的根系还未得到重新发育。 夏天温度过高, 造成植株萎蔫, 冬天温度太低导致植株死亡。 3)炼苗 将试管苗容器口的塞子或纸去掉,并在培养室中放置 1 天。从培养室移至常温条件下放 置几天,要注意不要染菌。 4)移栽 将试管苗从培养瓶中取出,小心操作,勿把根系损坏。然后洗净根部的培养基。在盆土
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中开一穴, 将植株栽下,最好将根铺展开, 种植不要过深, 也不能过浅,不要用手用力压土, 以免造成根系的损伤。 5、移栽后管理 ① 土壤要保持疏松,通气要好,这样有利于根系的发育。 ② 水分的控制要得当,移栽后第一次浇水要浇透,且勿出现上湿下干现象。第一次浇水最 好采用渗水的方式,即将刚移栽的盆放在装有水的盆中,让水从盆底逐渐渗上来,水在盆面 出现既可。平时要勤观察,保持土壤湿润。 ③ 湿度控制要适当大一些,对试管苗的恢复发育和根系的形成有好处。因而要在盆口用玻 璃器皿或塑料布罩上。这样有利于保证湿度,但是也要注意通风,防止发霉而事得其反 ④ 温度 夏天要让试管苗在阴凉的地方进行过渡, 冬天要在温室中过渡一段时间, 以免温度 过高或过低导致试管苗的死亡。 ⑤ 光照 刚移栽的试管苗且勿在阳光下。 ⑥ 注意天气变化,试管苗应移栽在无风的地方,移栽初期应避免大的风雨的袭击。

三、离体叶的培养

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离体叶培养是指包括叶原基、叶柄、叶鞘、叶片、子叶在内的叶组织的无菌培养 。 再生植株的方式有两种:一种是直接诱导形成芽或胚状体,另一种是先诱导形成愈伤组织, 再经愈伤组织分化成植株。 叶培养的结果:芽或胚状体;愈伤组织;成熟叶 叶的离体培养技术 1、材料灭菌 取干净幼嫩的叶,用 70%酒精漂洗 10 秒钟,再在饱和漂白粉中浸 8—15 分钟,用无 菌水冲洗数次,再把叶子夹放在无菌干滤纸上吸干水份,供接种用。 注意粗糙的或带绒毛的叶较难除菌,应在消毒液中加入一滴吐温(一种表面活化剂), 时间应适当的延长。 2、接种 把消毒过的叶组织切成约 0.2cm2 小块或薄片, 接种在 MS 培养基或其它常用的培养基 中,附加足够量的生长素(如 2,4-D2mg/L)或细胞分裂素(如 0.2mg/L6-BA)。 3、培养 叶接种物应放在 25℃,每天 10 小时的光照,光强约 1500—2000LUX 的培养室中培养。 培养约经两周至月余,叶切口乃至切块开始增厚肿大,进而形成愈伤组织。 这时应转移到含细胞分裂素约 2mg/L 的再分化培养基上进行分化培养,约经 10 天愈伤 组织开始转绿,因而出现绿色芽点,它们将发育成苗。 若在分化培养基上不长根,还需将苗移至 NAA0.5mg/L 的生根培养基上诱导生根,从而 发育成完整的植株。 4、培养中应注意的问题 首先要选用易培养成功的叶组织,如幼嫩叶比成熟叶易培养,子叶比叶片易于培养。 其次要添加适当种类和数量的生长激素,叶的培养比胚、茎尖、茎段培养难度大,因此生长 激素的选用是十分重要的, 往往以多种生长素或多种细胞分裂素的配合使用, 较有利于叶组 织的脱分化和再分化。如水稻叶片单用 2,4-D 效果差,而 2,4-D、NAA、IAA 等三种生长素 以 4:2:1(mg/L)的比例配合使用,有利于愈伤组织形成。
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第三节 植物繁殖器官培养

1、植物花器官培养

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? 植物的花器官培养:对植物的整朵花或花的组成部分(花托、花柄、花瓣、花丝、 子房、花药、胚珠等)进行离体培养的技术。 ? 将未开放的花蕾、花柄、花瓣、花托等组织经过灭菌处理或适当切割后,在适宜条 件下进行培养。 ? 培养结果可能有:成熟果实、不定芽或丛生芽、愈伤组织 2、植物幼果培养 ? 植物幼果培养:对植物不同发育时期的幼小果实进行离体培养的技术。 ? 经过灭菌处理后,在适宜条件下进行培养。 ? 培养结果可能有:成熟果实、愈伤组织 3、植物种子培养 ? 植物种子培养:对受精后发育不全的未成熟种子和发育完全的成熟种子实进行离体 培养的技术。 ? 经过灭菌处理后,在适宜条件下进行培养。 ? 培养结果可能有:小植株、愈伤组织、丛生芽或不定芽。 ? 对糖浓度要求一般较低,为 1-3%。
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第四节 植物组织培养

1、植物分生组织的培养 植物分生组织培养是指对植物的分生组织进行离体培养的技术, 包括植物根尖、 茎尖等顶端 分生组织和形成层组织的培养。 茎尖培养:对植物顶端的原分生组织和它衍生的分生组织的培养。 茎尖组织经过适当培养后,可能发育的方向为:芽萌发、产生胚状体、产生不定器官、形成 愈伤组织。

2、植物愈伤组织培养 植物愈伤组织培养:诱导植物外植体产生无序生长的薄壁细胞及对其培养的技术。 植物的各种器官及组织,经培养都可产生愈伤组织,并能不断继代繁殖。 一般薄壁细胞和形成层容易形成愈伤组织,愈伤组织的质地差异很大,有的紧密坚实,有的 疏松柔软。

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致密坚实的愈伤组织内无大的细胞间隙,由管状分子组成维管组织; 疏松柔软的愈伤组织有大量的大细胞间隙,细胞排列无序。 两种质地的愈伤组织可以利用生长素进行转换, 即高浓度生长素变致密坚实愈伤组织为疏松 柔软。 愈伤组织通常在黑暗或弱光下进行,温度为 25℃

3、茎尖分生组织培养 茎尖分生组织培养仅指长度不超过 0.1mm 茎尖的顶端圆锥区的培养, 这么小的外植体是不易 培养成功的, 因此只有在用于某些植物获得无病原体的植物才采用, 而一般都采用较大的带 一个和几个叶原基的茎尖培养。

能得到无病毒的植株的主要原因是: (1)病毒侵染植株后,通过胞间连丝转移到其他细胞中,或依靠筛管进行转移。因此,病 毒在患病植株上的分布是不均匀的, 即老的成熟器官中病毒含量高, 幼嫩未成熟的器官中病 毒含量较低而茎尖分生组织,在细胞没有充分分化以前不受侵染,故几乎不带病毒。 1、培养技术 ①茎尖组织的分离 从未发病植株上,取正在生长的顶芽、萌发芽和球茎的中心芽。材料用 70%的酒精浸没几秒 到数十秒钟,再在稀释 20 倍的次氯酸钠中浸 5—10 分钟,用无菌水冲洗数次后,供组织分 离用。 (2)在无菌条件下进行无菌操作,把芽放在解剖镜下,用镊子、刀子、解剖针等工具,逐 层把芽外面的幼叶和叶原基除去,使生长点露出,这时要细心,不要弄伤顶端圆锥体,用利 刃切下含有 1—2 个叶原基的 0.1-0.2mm 长的生长点,然后接种到琼脂培养基上,切取生长 点的大小,是培养能否取得成功的关键,原则是在生长点不带病毒的情况下,尽量取稍大些 的生长点,这样易于培养成功。 ②培养: ? 常用的培养基有 White(1943),Morel(1995),MS 培养基等等。 ? 2,4-D,IAA,NAA 等生长素是必须的,它们能有效地促进芽的生长发育,但是浓度 并能太高,一般用 0.1mg/l 左右即可,高于 1.0mg/L,往往产生畸变芽或形成愈伤 组织。
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? 接种后的生长点,在培养基上生长很慢,再生植株往往需要几个月甚至一年以上。 因此,注意满足其培养条件是十分重要的。生长点培养要求 24—27℃的温度,最好 给以日夜温差,适当的光周期和光。由于培养时间长,应注意培养基保湿,一般可 用防湿的铝箔或塑料薄膜包裹解决。 茎尖经过适当培养后,可能发育的方向为: ? 芽萌发; ? 产生胚状体; ? 产生不定器官; ? 形成愈伤组织 ③脱毒试管苗植物的移植 Ⅰ嫁接—扦插法 把试管苗剪下,先嫁接在砧(zhen)木上,然后再扦插成活,最后长成植株。 Ⅱ移植法 当试管苗长到数厘米和形成较多的根系时,打开试管盖,放在室内窗口处炼苗 2 —3 天。然后小心取出苗,洗去根上的琼脂以免滋生细菌,再移栽至小花盆中。 病毒植物的鉴定 (一)指示植物(indmatingplant)法 ? 利用病毒在其他植物上产生的枯斑作为鉴别病毒种类的方法,就是枯斑和空斑的测 定法。这种专门选用以产生局部病斑的寄主即为指示植物,又称鉴别寄主。它只能 鉴定靠汁液传染的病毒。 ? 最早是美国的病毒学家 Holmes 1929 年发现的。他用感染 TMV 的昔通烟叶的粗汁液 和少许金刚砂相混合,然后在烟叶子上摩擦 2—3d 后叶片止出现了局部坏死斑。在 一定范围内,枯斑与侵染性病毒的浓度成正比。这种方法条件简单,操作方便,故 一直沿用至今,仍为一种经济而有效的鉴定方法。枯斑法不能测出病毒总的核蛋白 浓度,而只能测出病毒的相对感染力。 (二)抗血清(antisemm)鉴定法 用已知抗血清可以鉴定未知病毒的种类。 这种抗血清就是高度专一性的试剂, 这种方法特异 性高,测定速度快,一般几小时甚至几分钟就可以完成。所以抗血清法成为植物病毒鉴定中 最有用的方法之一。 (三)电子显微镜(elecmc microscope)检查法 由于人的眼睛难以观察小于 0.1mm 的微粒, 而借助于普通光学显微镜也只能看到小至 200bm
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的微粒,所以只有通过电子显微镜才能分辨 0.5μ m 大小的病毒颗粒。这样采用电子显微镜 既可以直接观察病毒,检查出有无病毒存在,了解病毒颗粒的大小、形状和结构,又可以鉴 定病毒的种类。这是一种较为先进的方法,但需一定的设备和技术。 这一方法的优点是灵敏度高和能在植物粗提取液中定量测定病毒。 (四)酶联免疫鉴定法 酶联免疫法是指采用酶标记抗原或抗体的定量测定法。 将抗原固定在支持物上, 加入待检血 清, 然后加入酶(过氧化物酶或碱性磷酸酶)标记的抗体, 使待检血清中与对应抗原的特异性 抗体结合,最后用特殊分光光度计测定。此法是现在灵敏度较高和常使用的方法。 无病毒植物的利用 一、无病毒苗的保存繁殖 无病毒植株并不是有额外的抗病性, 它们有可能很快又被重新感染。 所以一旦培育得到 无病毒苗,就应很好地隔离与保存。 二、无病毒苗的利用 无病毒苗在生产中的利用也要防止病毒的再感染。 生产场所应隔离病毒感染途径, 做好 土壤消毒或防蚜等工作。在此种植区及种植规模小的地方,要较长时间才会感染。而在种植 时间长、轮作及种植规模大的产地则在短期内就可以感染。一旦感染,便会影响产量和质量 的保证。因此,应重新采用无病毒苗,以保证生产的质量。 三、无病毒苗的效果 无病毒苗可以表现出明显的优良效果。如草莓可增产 20%—50%,植株结果多,单果重增 加,上等果比例提高。菊花切花品种的脱毒株,表现出株高增加,切花数增多,花朵大,切 花较重等特点。
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第四章 胚胎培养及离体授粉
一、胚胎培养概念 胚胎培养是将植物的胚胎与母体分离,培养在已知化学成分的培养基上。 二、胚胎培养应用: 1、解决育种中实践中遇到的问题;2、研究胚胎发育过程中与胚发育有关的内外因素。 三、胚胎培养类型

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幼胚培养、成熟胚培养、胚乳培养、胚珠培养、子房培养

第一节 胚培养

一、培养类型 所谓胚培养就是采用人工方法把胚从种子、子房、胚珠中分离出来,放在无菌条件下让其 进一步生长发育、以至形成幼苗的过程。 1、离体胚培养时期 自养期:能在基本的无机盐和蔗糖培养基上生长。 异养期:幼胚由胚乳及周围的组织提供养分。 2、离体胚培养类型 ⑴成熟胚培养(子叶形成以后)⑵幼胚培养(子叶形成之前)

二、培养过程 1、幼胚培养过程
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Hanning 早在 1904 年就培养了萝卜和辣根菜的胚,发现离体胚可以充分发育,并且提前萌 发形成小苗,这是世界上胚培养最早获得成功的一例。 幼胚培养的关键技术:取材时期、幼胚剥离、培养条件的控制(是否需要特殊处理) 成熟或未成熟子房——70%酒精浸数 S——0.1%升汞或饱和漂白粉浸 10-30min——无菌水冲 洗——剖出胚珠——取出完整胚——接种在培养基上。 一般采用固体培养法。 (同时配制两种培养基) 培养条件: 20-30℃,2000Lx。10-14h 幼胚离体培养的生长发育方式; (1)胚性发育:胚只是在体积上增大甚至超过正常胚大小而不能萌发成苗。 (2)早熟萌发:幼胚不再发育,迅速萌发成幼苗。多数情况一个幼胚萌发成一个植株,有时 因细胞分裂形成许多胚状体,进而形成许多植株,即丛生胚现象。 (3)愈伤组织:多数植物幼胚形成愈伤组织。再分化成胚状体或形成芽苗。 2、成熟胚培养过程 种子——95%酒精消毒——选取完好种子——70%酒精浸数 S——0.1%升汞或 10%次氯酸 钠浸泡——无菌水冲洗——种子培养几天——剥离种胚——接种在培养基上。

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培养条件:

黑暗培养、25℃

三、影响因素 (一)培养基 1、无机盐 成熟胚是含有根原基和茎原基以及一个或两个次生附属子叶。培养时进一步发育产生根 和茎,此时在营养上相对独立,只需要提供简单的营养条件,在含有大量元素的无机盐和糖 的培养基上即能生长。 幼胚则是异样的,要求更复杂的培养基。除了一般的无机盐成分外,还要加入微量元素 和生长辅助物质, 不同发育时期的幼胚对培养基成份要求不同, 胚龄越小培养及成份越复杂。 2、糖类 幼胚需要蔗糖浓度较高 作用:调节培养基渗透压,作为碳源和能源,防止幼胚早熟萌发。 成熟胚 2%,幼胚 8-12%。 培养过程中,转移到蔗糖水平低的培养基上。 3、氨基酸和维生素 加入氨基酸,能刺激胚的生长。加单一氨基酸时,以谷氨酰胺最好。 维生素对幼胚是必须的,对已萌发的胚,可能有抑制作用。 4、植物生长调节物质 成熟胚一般不需要外源激素就可萌发, 但加入激素可显著增加培养物的生长, 尤其对打破休 眠。 幼胚培养的关键是使加入的生长调节剂和植物内源激素间保持某中平衡,以维持其胚性生 长。 5、天然有机物 加入一些天然的胚乳或种子提取物,对离体胚生长有促进作用。 (二)培养条件 1、PH 5.2-6.0,水稻 5.0,柑橘 5.8 2、温度 25 -30 ℃左右 3、光照 黑暗或弱光 4、培养基形态 液体适合幼胚培养,固体适合成熟胚培养 (三)胚柄 胚柄是一个短命的结构,长在原胚的胚根一端,当胚达到球形期,胚柄发育到最大。 胚柄可参与幼胚的发育过程。一般胚柄较小,很难与胚一起剥离出来,所以培养的胚都不具
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备完整的胚柄。 在幼胚培养中, 胚柄的存在对幼胚的存活是关键。 因为胚柄的存在会显著刺激胚的进一步发 育,在胚发育的心形期达到高潮。 没有胚柄存在时,一定浓度范围的 KT 可促进幼胚生长,但赤霉素作用更好。

四、胚培养的应用 1、远缘杂交中应用 2、克服珠心胚的干扰,提高育种效率 3、缩短育种周期 4、测定休眠种 子的萌发率 5、理论研究中应用

第二节 胚乳培养

胚乳培养—将胚乳从母体上分离出来, 在无菌条件下人工培养, 使其生长发育成为幼苗的过 程。

一、培养过程 1、胚乳外植体的制备

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⑴胚乳较大块组织的种子,可直接将种子表面灭菌,无菌条件下除去种子的外皮即可培 养。⑵桑寄生类植物,胚乳被流质层包裹,不好取出胚乳,可先将种子表面灭菌,无菌条件 下剥开种皮,去掉粘性流质层,取出胚乳。⑶带果实的的种子(斛寄生类) ,取授粉几天后 的幼果,表面灭菌后, 无菌条件下切开幼果,取出种子,小心分离出胚乳, 接种在培养基上。 培养室温度 25-27℃,黑暗或弱光下 2.离体胚乳的发育及其植株的形成 ⑴愈伤组织的诱导 胚乳接种后的 6-10 天后,不断增生成乳白色团状,成为愈伤组织。少数胚乳外植体可转 为绿色叶状丛。 ⑵愈伤组织的再分化 生长旺盛的愈伤组织应及时进行分化培养,此时需光。有器官发生和胚胎发生途径。 ⑶胚乳苗的生根培养:转入生根培养基 10-15 天后即可长根 植物胚乳可分为两大类: 被子植物胚乳——被子植物中它是双受精的产物,胚乳属于三倍体。

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裸子植物胚乳——裸子植物很特殊,它的胚乳在受精前就已形成。裸子植物的胚乳为是 单倍体。 3、适合培养的胚乳的发育时期 几种植物胚乳培养的最佳时间(授粉后天数) 大 麦 10~12 天 黄 瓜 7~16 天 小黑麦 7~14 天 4、胚乳植株染色体数目的检查 取胚乳培养植株根尖、幼叶或胚乳愈伤组织,0.2-0.5%秋水仙素(或对二氯苯饱和溶液) 25℃下处理 4-8h,流水冲洗,卡洛氏液或 FAA 固定,1mol 盐酸 60℃水溶下水解 10min,染 色、压片、观察。

二、影响因素 (一)培养基 1、White 和 MS 2、辅助生长物质 3、天然提取物 培养 4、蔗糖 3-5%。小麦 8%,枸杞 5% (二)培养条件 1、ph 2、光照 3、温度 4.5-6.3 10-12h 黑暗和光照交替 24-26℃ 带胚的胚乳产生愈伤组织比不带胚的高。当愈伤组织形成后,除去胚并 2,4_D,玉米素等 20%番茄汁、葡萄汁、玉米汁、椰乳、水解酪蛋白、酵母提取物促进胚乳
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(三)胚的影响

不影响胚乳组织的增殖。 胚对胚乳培养的影响与胚乳的生理状态或年龄有关。 处在旺盛生长 期的未成熟胚,在诱导培养基上无胚存在时,可形成愈伤组织。对成熟胚乳,特别是干种子 的胚乳进行培养时,由于其生理活动十分微弱,在诱导其脱分化前,必须借助于原位胚的萌 发使其活化。胚对胚乳的增殖作用,有人认为是某种“胚性因子”在起作用,这种胚性因子 可能是赤霉素。 (四)胚乳发生类型和发育程度 1、发生类型: 核型:精核与极核受精后,只以核的分裂方式增殖。占 61%

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细胞型:受精后,以细胞分裂方式增殖。 混生目型:两种方式混生增殖。 2、发育时期: 早期:愈伤组织诱导率低 旺盛生长期:最容易诱导产生愈伤组织 成熟期:诱导率很低。水稻和桑寄生科的一些木本植物例外 胚乳培养中,旺盛生长期是取材的最适时期。

三、再生植株的染色体倍数 1、稳定型:继代培养后染色体无变化,植株三倍体 2、畸变型:细胞染色体异常,植株为多倍体,且不一致,形成多种倍性细胞组成的嵌合体。

四、胚乳培养的应用 培养胚乳的首要目的是为了直接获得三倍体植株。 三倍体——六倍体——生产 倍性多样性——筛选非整倍体植株 杂种胚乳—附加系和换代系—遗传育种
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第三节 胚珠和子房培养

一、胚珠培养 将胚珠从母株中分离出来,放在无菌的人工环境条件下,让其进一步生长发育,以致形 成幼苗的过程。 根据胚珠是否受精分为两类:受精胚珠的培养;未受精胚珠的培养 (一)胚珠培养的过程 1、胚珠的获取 ⑴培养受精胚珠,摘取授粉时间合适的子房,如培养未受精胚珠,则在授粉前摘取子房。 ⑵表面灭菌 ⑶剖开子房壁,取出胚珠或带胚珠的胎座接种。 2、培养条件 固体培养基,White,Nitsch(普遍使用) ,MS 培养基。附加天然有机物和氨基酸。

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蔗糖浓度:幼嫩胚珠 4-10%,胚珠内含有合子和少数胚乳核 5-6%,刚受精的胚珠 8% 室温 26℃,50-60%相对湿度,光照 18h, 3、受精胚珠的发育 胚珠——种子 胚珠——愈伤组织

二、子房培养 将子房从母株上摘下,放在无菌的人工环境条件下,让其进一步生长发育,以至形成幼 苗的过程。 根据培养的子房是否授粉分为:授粉子房培养;未授粉子房培养 (一)子房培养的过程 1、子房的获取 未授粉子房在开花前 1-5 天摘取子房,授粉子房在授粉后摘取子房。 灭菌:禾谷类幼穗表面用 70%酒精擦拭即可,双子叶花蕾漂白粉液灭菌,其他植株暴露 的子房须严格消毒,无菌滤纸吸干。 拨开幼花,子房接种到培养基上。 2、子房的培养 固体和液体培养基均可,26℃,50-60%相对湿度,光照 16h。 N6,MS,BN,Nitsch 培养基 (二)培养子房的发育 子房性细胞——愈伤组织或胚状体——单倍体植株 子房体细胞——愈伤组织或胚状体——二倍体植株
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三、胚珠和子房培养的应用 1、胚珠 受精胚珠培养目的——打破种子的休眠挽救胚的发育以获得杂交种 未受精胚珠培养目的——获得单倍体细胞发育而来的植株 2、子房 授粉子房培养目的——挽救子房内杂种胚的发育 未授粉子房培养目的——获得单倍体植株,试管受精解决杂交育种中不亲和问题。

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第四节 植物离体授粉

在远缘杂交中,遇到两种障碍(受精前和受精后) 离体授粉(离体/试管受精) :将未授粉的胚珠或子房从母体上分离下来,进行无菌培养,并 以一定的方式授以无菌花粉,使之在试管内实现受精的技术。 三 种 方 式 : 离 体 柱 头 授 粉 ( 授 于 离 体 雌 蕊 的 位 置 ); 离 体 子 房 授 粉 离体胚珠授粉 一般都在试管内完成的。 ;

一、离体授粉的类型 (一)离体柱头授粉 1、定义:通过雌蕊的离体培养,使无菌花粉授于柱头上,得到含有可育的种子和果实的技 术。 2、方法:在花药尚未开裂时切取母本花蕾,消毒后,在无菌条件下用镊子剥去花瓣和雄蕊, 保留萼片,将整个雌蕊接种在培养基上,当天或第二天在其柱头上授以无菌的父本花粉。 (二)离体子房授粉 1、定义:通过人工方法将花粉直接引入子房,使花粉粒在子房腔内萌发,并进行正常受精, 最后获得具有生活力的种子。又称子房内授粉。 2、两种形式:活体子房内授粉/离体子房内授粉 1)活体子房内授粉:指被授粉的子房并不离体,仍然活在植株上,对其用花粉悬浮液进行 授粉,使活体子房发育并形成成熟种子的过程。 ①步骤:确定供试植物的开花和花药开裂时间; 对母本花蕾去雄并套袋; 采集父本花粉; 将花粉引入子房。 ②花粉粒引入子房有两种方法:直接引入法和注射法 直接引入法:用锋利刀片在子房壁或子房顶端上开一切口,把花粉从切口处送进子房。 注射法:用 100mg/L 硼酸将花粉粒配制成悬浮液,每滴含 100-300 个花粉粒。母本开花后, 将子房用酒精棉表面消毒, 在子房两侧彼此对应的位置上钻两个小孔, 用注射器由一个小孔 向子房注射悬浮液,注满子房腔,到另一小孔流出为止,用凡士林封闭小孔。
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2)离体子房内授粉:指用无菌花粉对离体培养的子房进行授粉,使其发育为成熟种子的技 术。 方法:取即将开花的花蕾,经过表面消毒,剥离花萼和花瓣,去掉柱头和花柱,在试管中 将无菌花粉授予子房顶端切口处,或将花粉引入子房内,实现受精过程。 (三)离体胚珠授粉 定义:离体培养未受精的胚珠,并在胚珠上授粉,最终在试管内结出正常种子的技术。 方法: 1、将胎座上切下的单个胚珠(裸露胚珠)接种在培养基上,然后撒播花粉于胚珠表面,实 现受精。 2、将带有完整胎座或部分胎座的胚珠接种在培养基上,并撒播花粉进行受精。

二、离体授粉的方法 (一)试验材料的选择 最好选择子房较大并有多个胚珠的植物 (二)离体授粉的程序
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1、确定开花、花药分裂、授粉、花粉管进入胚珠和受精的时间 2、去雄后将花蕾套袋隔离 (开花前)3、制备无菌子房和胚珠 4、制备无菌花粉 5、胚珠(或子房)的试管内授粉 离体授粉成功的标志:授粉后由胚珠或子房形成有生活力的种子。

三、影响离体授粉受精的因素 (一)外植体 1、柱头和花柱的影响 2、胎座的影响(子房或胚珠上带有胎座,有利于离体受精的成功) 3、外植体的生理状态(开花后 1~2d 剥离的胚珠比当天剥离的胚珠结实率高) (二)培养基(Nitsch,white,MS 等) CaCl2、培养基中蔗糖浓度一般为 4%~5%、常用的有机附加物 (三)培养条件:一般在黑暗或光照较弱的条件下培养,温度 20-25℃

第五章

花药和花粉培养

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第一节 花药培养和花粉培养的概念和应用

一、概念 花药培养是将一定发育期的花药进行离体培养的技术,就培养方法和技术来讲,属于器 官培养的范畴。 花粉培养:将处于一定发育阶段的花粉从花药中分离出来,再加以离体培养。有时花粉 培养也称为小孢子培养。从培养方法和技术方面来讲,它属于细胞培养的范畴。 二、 花药和花粉培养的应用 花药和花粉培养所得单倍体植株,不能开花结实,本身无利用价值。应用于植物品种改 良和新品种选育,形成了单倍体育种,有重要作用。 (一)单倍体植物在育种中的作用 现代农业用杂种优势的有效途径是杂交制种, 目前应用最广泛地为 “三系配套” , 对小麦、 水稻等自花授粉的植物显得尤为重要。 雄性不育系—指自身雄蕊不正常,不能产生正常的花粉或花粉败育,雌蕊正常,接受外来 花粉能正常结实的品系。一般作杂交母本。 雄性不育同型保持系—自身雌雄蕊正常,能自交繁殖,用它的花粉给不育系授粉,使不育 系结实,并保持雄性不育系的后代仍是不育的品系。 雄性不育恢复系—自身雌雄蕊正常,能自交繁殖,它的花粉给不育系授粉,能使不育系当 代结实并在 F1 代恢复育性正常的品系。是杂交种子的父本。 1、克服后代分离、缩短育种年限 常规育种中,杂交 F2 代起会出现性状分离,到 F6 代才开始选择,育成一个品种需 8-10 年。单倍体育种将 F1 或 F2 代花药进行培养,对所获得的单倍体植株进行加倍处理,获得稳 定的纯合二倍体,下一代植株性状基本稳定,育种只需 3-5 年。 2、选择效率高:为常规育种的 2n 倍。 3、有利于隐性基因控制性状的选择 杂交育种中等位基因的隐性基因被显性基因掩盖,不宜显现出来,单倍体育种中隐性基 因都被加倍而纯合,利于选择。 4、快速获得自交系的超雄株:利于异花授粉植物杂种优势的利用。 5、其他:提纯复壮、远缘杂交。
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(二)单倍体植株的染色体加倍 1、自然加倍 2、人工加倍:秋水仙素浸苗、处理愈伤组织、涂抹田间单倍体植株的顶芽、腋芽。 3、从愈伤组织再生:单倍体植株作外植体培养愈伤组织,反复继代培养可得较多二倍体植 株,也叫组织创伤法。 第二节 花粉小孢子发育途径 离体培养条件下,花粉是产生花粉植株的原始细胞,其第一次有丝分裂,在本质上与合子的 第一次孢子体分裂相似,把花粉形成植株的途径称为“花粉孢子体发育途径” 。 目前,习惯把小孢子或花粉沿孢子体途径发育成花粉植株的过程称为“雄核发育” 。 一、活体小孢子发育途径 花粉发育时期对诱导雄核发育是极其重要的。 花粉母细胞经减数分裂形成四分体, 有多种模 式,以四面体和等二面体最普遍。 体细胞组织分泌出胼胝质到四分体表面,花粉四分体的胼胝质壁溶解并释放出四个小孢子。 此时,小孢子细胞质浓厚,中央有一细胞核。 当液泡发生时,小孢子体积迅速增加,细胞核被挤向一边。在第一次有丝分裂时,小孢子核
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产生大而疏松的营养核和一个小而致密的生殖核, 形成两个精子, 它们处在花粉或花粉管中。 小孢子从里到外被绒毡层、中层、药室内壁和表皮包围着。 二、离体小孢子发育途径 (一)雄核发育途径 离体培养时, 尽管雄核发育可在四分体时期和双核花粉期被诱导, 但最适宜诱导的时期是第 一次有丝分裂或之前。小孢子在培养过程中呈现不同的发育模式。 目前,一般根据小孢子第一次有丝分裂情况将雄核发育分为 A 途径(不均等分裂)和 B 途径 (均等分裂) ,其中 A 途径又根据第二次分裂及其以后的情况细分为 A-V 途径、A-G 途径、 A-VG 途径(E 途径)及 C 途径。 1、A 途径 A-V 途径:多细胞花粉(多核花粉)由营养细胞重复分裂衍生而成,生殖细胞以游离核的形 式存在一个周期后退化, 或分裂一至数次后存在于多核花粉的一侧, 有的甚至到球形胚形成 时仍存在。因此,生殖核并不参与花粉孢子体的形成,在花粉中往往可以观察到生殖细胞的 存在。 A-G 途径:生殖细胞进行多次分裂形成胚状体,营养细胞不分裂或者仅分裂数次形成胚柄结

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构。由生殖细胞形成的细胞群其核致密,染色后着色较深,容易同营养细胞衍生而来的细胞 群区分开来。 A-VG 途径:花粉内的营养细胞和生殖细胞独立分裂,形成两类细胞群,各群的子细胞都类 似其母细胞 C 途径:在获得的花粉植株群体中,除单倍体外,常有相当比例的二倍体、三倍体、四倍体、 非整倍体等非单倍体植株,即小孢子培养过程中自发加倍现象。此途径中,生殖核与营养核 共同参与了花粉植株的形成。 2、B 途径 小孢子第一次有丝分裂为均等分裂,形成两个大小相近的细胞(或游离核) 。以后,由这两 个细胞连续分裂产生单一类细胞组成的多细胞花粉或多核花粉。 三、花粉植株形态发生方式 如果不考虑小孢子核的早期分裂行为, 花粉植株的形态发生有两种途径, 即胚状体发育途径 (直接发生途径)和愈伤组织发育途径(间接发生途径) 。 (一)胚状体发育途径 小孢子的行为与合子的一样,经历了如同活体条件下诱导胚发生的各个阶段。 (二)愈伤组织发育途径 与胚状体发育途径相比,小孢子没有经历胚发生阶段,而是分裂数次形成愈伤组织,从花药 壁上冒出来。 第三节 花药和花粉培养方法
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一、花药培养 首先报道通过花药培养获得单倍体植株成功的是印度学者 Guha 和 Maheshwari(1964, 1966)。已有 250 多种植物花药培养成功。目前,花药培养获得单倍体的技术途径已在禾本 科作物、茄科作物、十字花科作物的育种中广泛应用。 花药培养可诱导花粉发育形成单倍体,快速获得纯系;缩短育种周期,利于隐性突 变体筛选、提高选择效率;与二倍体融合成体-配杂种。 (一)花药培养方法 1、材料的选取 大多数园艺植物的花药培养,成功率最高的是单核期或单核中晚期。 花粉的发育时期:四分体 — 小孢子 — 单核花粉 — 双核花粉 2、材料与处理与灭菌 最适期

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3-5℃低温处理 3-10 天(大花蕾将萼片剥掉) -酒精几秒-0.1%升汞 10min-无菌水冲洗。 3、接种培养 镊子剥去花瓣-花药均匀接种于培养基上,常用培养基 MS、N6 和马铃薯培养基。 蔗糖 5-10%,20-30℃,光照 12h。 可固体培养或液体培养。 (二)花药培养下花粉的发育与植株再生 1、花粉离体培养的发育 A 途径 花粉进行不对称分裂,形成一个大的营养细胞和小的生殖细胞,接着分裂形成胚 或愈伤组织。 B 途径 花粉进行对称分裂,细胞相似于营养细胞,发育成胚状体或愈伤组织。 C 途径 生殖细胞与营养细胞同时发育,核融合形成胚状体。 2、植株的分化再生 (1)愈伤组织-植株,降低生长素与蔗糖浓度,提高细胞分裂素。 (2)胚状体-植株,降低无机盐浓度,蔗糖浓度。高的是单核期或单核中晚期。 二、花粉培养 花粉培养比花药培养优越:从较少的花药得到大量的花粉植株;便于生理生化研究。 (一)花药预培养 适合的花蕾—浸有滤纸的培养皿中—5℃几天—灭菌—取出花药—接种于培养基中数天— 将花粉分离—悬浮培养。 (二)花粉培养 1.取材时期的确定 四分体—单核早期—单核晚期—双核早期—双核晚期—三核期 小 孢 子 花粉培养 2、花粉预处理 低温处理花蕾,或单核后期离心预处理。 3、花粉分离 适合的花蕾-消毒-取出花药-烧杯壁中挤压花药-尼龙网过滤-花粉液离心-花粉粒沉淀培养基稀释-纯净花粉群体。 将小孢子从花药里游离出来的主要方法有: 花 粉 粒 花药培养
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1)自然散落法

合适的花蕾消毒后→无菌条件下取出花药→接种在预处理液或培养基→花

粉囊自动裂开→小孢子散落到培养基中→收集小孢子→用新鲜培养基培养。 2)挤压法 ①挤压法 消毒处理过的花药→置与无菌培养皿或烧杯中→加少量提取液→用注射器内管

或一端压扁的玻璃棒轻压花药→花粉挤到提取液中→级联过筛→除去组织碎片→低速离心 →沉淀→清洗几次→制成小孢子悬浮液用于培养。 ②研磨过滤收集法。与上法相似,区别是把消毒过的花蕾置与无菌的研钵中研磨,挤出小孢 子。 3)机械游离法 ①磁搅拌法 将花药接种盛有培养液或渗透压稳定剂的三角瓶→放一根磁

棒→置磁力搅拌器低速旋转至花药透明。②小型搅拌(超速旋切)法 4)小孢子分离和纯化 小孢子匀浆→ 过筛→离心收集 花粉培养方式 1)平板培养 花粉置琼脂固化培养基上培养,诱导产生胚状体,进而分化成植株。 2)液体培养 花粉悬浮在液体培养基中进行培养。 3)双层培养 花粉置固体-液体双层培养基上培养。 4)看护培养 配制好花粉粒悬浮液和琼脂固体培养基后,将完整的花药或花药的愈伤组织 放在琼脂培养基上,将圆片滤纸放在花药或愈伤组织上,然后将花粉置与滤纸的上方。 5)微室培养 将花粉培养在很少的培养基中。 做法:①琼脂培养基②液体培养基 6)条件培养基培养 在预先培养过花药的液体培养基中或在加入失活的花药提取物的合成 培养基中,接入花粉进行培养。 4、培养方法 培养基:我国朱至清 N6 适于禾谷类作物、庄家骏马铃薯 2 号、王培 C17、欧阳文俊 W14 等。 高浓度的铵离子抑制花粉愈伤组织形成,活性炭、铁盐促进花粉分裂。生长素促愈伤组织 形成,2,4-D 抑制愈伤组织分化成胚状体。 蔗糖浓度不同植物有不同。天然有机附加物可提高花粉愈伤组织和胚状体诱导率,促进生 长。 三、移栽驯化 花粉植株非常娇嫩,很难移植。需采取逐步过渡的方式,使其适应从异养到自养。移栽的关
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键是保持高空气湿度(80%-90%,1-2 周)和低土壤湿度。 四、白化苗现象 (一)白化花粉植株的亚微结构特征 小麦花粉绿苗和花粉白化苗虽在形态、 营养生长和染色体倍性上无明显差异, 但白苗的生殖 生长和雌蕊发育均不正常,在离体培养条件下,它不能完成有性世代和产生种子。 在花粉白化苗的细胞中,常发现有微核存在,叶肉细胞的细胞质中,存在着原质体,质体早 期发育正常,但发育到一定阶段即停止发育,在质体中缺乏核糖核蛋白体。 某些胚性花粉粒和白苗的茎段分生细胞中出现染色体断片和微核。 (二)白化苗产生的影响因素及机理 ① 内部因素和外部因素在一定程度上影响花粉植株的白苗率。 内部因素:供体植株的基因型、花药和花粉本身的状态 外部因素:低温预处理、培养基成分、生长激素水平和种类、培养条件和方法、愈伤组织转 分化时间等。 ②质体 DNA 的缺失可能是出现白化苗的直接原因。 ③核基因是控制花药培养力(包括绿苗率)的关键因素。小麦花粉白苗发生是由核基因控制 的,或是由核 DNA 变异引起的。 ④一些研究者认为, 离体培养中高频发生的体细胞无性系变异是花粉白苗大量出现的原因之 一。 (三)白化苗的控制 措施: ①采穗时主要取主茎和大分蘖穗, 取花粉发育时期处于单核中晚期的幼穗。 镊取花药接种时, 幼穗穗轴中部分花药全取,下部多取,上部少取。②幼穗 4℃低温离体预处理 24h。③脱分 化培养一般栽暗室进行,温度 30-32 ℃时,出愈率较高,但白苗多。在 29 ℃条件下培养, 较为理想。 ④脱分化培养基一般情况下用 2.0mg/l 的 2, 4-D 愈 0.5mgl 的 KT 或 6-BA 配合使 用。⑤诱导愈伤组织分化阶段,把培养基的碳源由 11%蔗糖改为 9%蔗糖+2%麦芽糖。⑥前期 产生的愈伤组织分化能力较强,后期产生的愈伤组织分化能力降低,白苗率相对较高,所以 出愈后应提早进行转分化培养。 五、影响雄核发育和花粉花药培养的因素 (一)基因型:植物基因型是影响离体诱导单倍体成功的最重要因素之一。 (二)植株生长条件和生理状态
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植株的生长条件(如光周期、强度、温度和矿质营养)和生理状态是影响雄核发育的又一重 要因素。一般来说,取相对年幼植株上开花始期的花比开花末期的花更适当,但从老年、病 弱的甘蓝核白菜型油菜分离的小孢子, 比从幼年、 健康的植株分离的小孢子有较高的胚产量。 (三)花粉发育时期 花粉发育时期的选择对雄核发育也是至关重要的。 1.花粉粒发育时期的观察 单核早期?单核中期 ?单核靠边期?二核期 成熟期?三核期 2.花粉发育时期的确定 花药在接种以前一般需先用醋酸洋红染色压片镜检, 以确定花粉的发育时期, 并找出花 粉的发育时期与花蕾或幼穗大小、颜色等形态学性状的相关性,便于取材。 (四)预处理 1.高低温处理 2.化学物质处理 (1)高糖 接种前用高糖预处理花药一定时间,再转移到适宜的糖浓度下培养,可大幅度 提高愈伤组织核胚状体的诱导率。 (2)甘露醇 用甘露醇进行预处理在麦类作物上很普遍。 (3) 秋水仙素 通过改变小孢子的有丝分裂、 诱导它们像体细胞一样生长的途径是用秋水仙 素处理。 其作用是扰乱了对不对称分裂起决定作用的微管细胞骨架, 使单核花粉的细胞核移 向中央,导致均等分裂。 (4)乙烯剂 乙烯剂是一种杀雄剂。 此外也有报道用 EMS、酒精、顺丁烯二酰阱等化学
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高低温处理包括低温预处理、低温后处理以及热击处理。

物质进行预处理。 3.其他 (1)г 射线:对小孢子也有刺激作用。 (2)离心:重力作用可打破微管,影响小孢子的发 育。 (3)磁场:磁场预处理可明显提高愈伤组织诱导率,且对培养基的选择性降低。 (五)培养基 1.基本培养基:现在花药和花粉培养中用到的基本培养基主要有:适于烟草的 H 培养基;适 于小麦的 C17 培养基、W14 培养基、马铃薯-Ⅱ培养基、Chu 培养基和 BAC1 培养基;适于玉 米的正 14 培养基。 2.碳 源:由于不同植物花粉细胞渗透压的差异,使得不同种类植物花药培养要求不同的蔗 糖浓度。

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3.氨基酸和其他有机物质 4.植物激素:2,4-D 被认为是禾本科花药培养的适宜激素。 5.活性碳: 6.pH (六)培养条件 1.温度:有一个原则,一个物种花粉发育的最适温度比不分化的愈伤组织的最适温度要高。 2.光照:黑暗条件下,小植株能从花药培养中发育出来。有光条件下,花药能培养出更多更 壮的苗。小孢子在红光条件下比白光条件下发育更快。 3.植板密度:小孢子的植板密度和分化培养时愈伤组织/细胞团值班密度对植株再生有很大 影响。 (七)花药壁因素:培养中花药组织的存在带来了影响胚产量的一些不清楚因素。 第四节 单倍体植株鉴定和染色体加倍 一、花粉和花药植株的倍性 (一)倍性鉴定 1、染色体直接计数法 2、间接鉴定 1)扫描细胞光度仪鉴定 2)细胞形态学鉴定:叶片保卫细胞的大小、单位面积上的气孔 数及保卫细胞中叶绿体的大小和数目与倍性具有高度的相关性。3)植株形态学鉴定法 4) 高/低温胁迫法 5)杂交鉴定法 6)分子标记鉴定 单倍体植株高度不育,要充分利用单倍体,只有将其加倍成纯合的二倍体植株。 1、茎段培养 2、化学试剂诱变 1)秋水仙素诱导 2)除草剂诱导
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第六章 植物细胞培养
细胞培养,即通过细胞继代培养,使细胞无限增殖,并使高等植物的单个细胞,在离体培养 条件下,通过诱发细胞分裂形成细胞团,再分化形成具根芽的完整植株。

第一节 单细胞培养

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一、单细胞培养意义 1、建立单细胞无性系 2、对培养的单细胞科诱发突变 3、排除体细胞干扰 4、遗传转化受体 的建立

二、单细胞的分离 叶组织是分离单细胞的最好材料, 1、机械法:叶片组织轻轻研碎,匀浆过滤或离心,得到纯化细胞。 特点:细胞不受酶伤害,不会发生质壁分离。不适用于所有植物 2、酶解法:利用果胶酶处理叶片,使细胞间的中胶层发生降解,分离出具有代谢活性的细 胞。特点:必须对酶溶液给予渗透压保护,防止细胞胀裂。

三、单细胞培养方法 (一)看护培养法 用一块活跃生长的愈伤组织块来看护单个细胞,并使其生长和增殖的方法。 (1)取处于活跃生长期约 1 厘米大小愈伤组织块。
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(2)无菌条件下,愈伤组织块安放在培养瓶中,在愈伤组织上放约 1 厘米平方的无菌滤纸 片。置培养室中放过夜。 (3)从悬浮培养物或疏松的愈伤组织上分离出单细胞,并把单细胞接种在培养瓶中的滤纸 上面。 (4)恒温培养。 (二)微室培养法 人工制造一个小室(载玻片和盖玻片) ,将单细胞培养在小室中的少量培养基上,使其分 裂增殖成细胞团的方法。小室可通过毛细管与外界通气,便于观察。 注意载玻片厚度 1mm,微室厚度最好不超过 20um,盖玻片厚度在 0.17-0.18mm 左右,观 察效果才好。 (三)平板培养法 平板培养法是把单个细胞与融化的琼脂培养基均匀混合,并平铺一薄层在培养皿底上 的培养方法。广泛应用于细胞、原生质体及融合产物的培养。 步骤: 1、单细胞悬浮液的制备 2、悬浮细胞密度的调制 3、琼脂培养基的配制 4、平板制作 5、培

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养 (四)条件培养基:在培养基中加入高密度的细胞进行培养,一定时间后这些细胞就会向培 养基中分泌一些物质,使培养基条件化。 方法: 把液体培养基中培养了 4-6 周的高密度细胞过滤掉, 将其培养基制成液体培养基或固 体培养基来培养单细胞或低密度细胞群体,这样可明显提高单细胞培养物存活和分裂的能 力。

第二节 细胞悬浮培养

细胞悬浮培养是使离体的植物细胞悬浮在液体培养基中进行的无菌培养。 建立在愈伤组织的 液体培养技术基础上。 目前已发展到全自动控制的大容积发酵罐的大规模工业生产的连续培 养。为研究细胞的生长和分化提供了一个独特的实验系统。

1、愈伤组织诱导 材料自来水冲洗—— 75% 的乙醇擦洗——将材料切成小块(带形成层)——接种到 MS+2,4-D 2mg/L+CH 500mg/L+琼脂 0.8%,pH5.8 的培养基上——得愈伤组织——扩大繁殖。
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2、单细胞悬浮液的制备 愈伤组织转移到液体培养基中——4r/min 转床培养 10d——140m×140m 的细胞筛过筛 ——使细胞密度达到 10 个/ml 左右——得单细胞悬浮液。 在细胞悬浮培养中,采用生长快、有效成分高、适合悬浮培养的细胞株。筛选细胞株的方法 是: (1)从培养的愈伤组织中挑选出外观疏松、生长快的浅色愈伤组织。 (2)用振荡或酶法, 游离出单个细胞或小细胞团。 (3)接种在固体培养基上培养 2 周。 (4)挑选生长快的细胞株 并继代培养。 (5)取各细胞系的培养物,进行有效成分的测定,筛选出有效成分高而生长较 快的细胞株。

一、培养类型和方法 一)成批培养 指把细胞分数在一定容积的培养基中进行培养,当培养物增殖到一定量时,转接继代,

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建立起单细胞培养物。它是进行细胞生长和细胞分裂的生理生化研究常用的培养方法。 (1)细胞生长在固定体积的培养基上,直至培养基中的养分为细胞耗尽为止。 (2)用适当搅拌的方法增加和维持游离细胞和细胞团在培养基中的均匀分布。 (3)在整个培养过程中,细胞数目会不断发生变化,呈现出明显的慢-快-慢,最后增长停 止的细胞生长周期。 (4)成批培养结束后,若要进行下一批培养,必须另外进行继代培养,其方法是用注射器 吸取一定量的含单细胞和小细胞团的悬浮培养物, 并移到含有新鲜培养基的培养瓶里, 继续 进行培养。 (二)半连续培养 指每隔一定时间后倒出一半的悬浮液, 并同时补充加入等量新鲜培养液。 能重复地取得大量、 均一的培养细胞,供生物研究之用。 (三)连续培养 是利用特制的培养容器进行大规模细胞培养的一种方式。 在培养过程中, 以不断抽取悬浮培养物并注入等量新鲜培养基, 使培养物不断得到养分补充, 保持其恒定体积的培养。 1、连续培养的特点 (1)由于不断加入新鲜培养基,保证了养分的充分供应,不会出现悬浮培养物发生营养不 足的现象。 (2)可在培养期间使细胞保持在对数生长期中。细胞增殖速度快。 (3)适于大规 模工业化生产。 2、连续培养的种类 封闭式连续培养:系统中的细胞数目不断增加。 开放式连续培养:系统中的细胞密度保持恒定。 封闭型连续培养:在培养过程中,排除的旧培养基由加入的新鲜培养基进行补充,进出数量 保持平衡,从而使培养系统中营养物质的含量总是超过细胞生长的需要。 悬浮在排除液中的细胞经机械方法收集后再放回培养系统中, 因此在这样培养方式中, 随着 培养时间延长,细胞密度不断增加。 开放型连续培养:为了不使限制细胞生长的因子出现,创造一个稳定的细胞生长的环境,必 须建立一套自动控制系统来调节培养基注入的数量和培养液的总体积。 在开放连续培养中, 注入的新鲜培养液的容积与流出的培养液容积相等, 其中细胞的密度也 保持恒定,并通过调节流入和流出的速度,使细胞的生长速度一直保持在一个稳定状态,流
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出的细胞相当于培养系统中新细胞的增加数。 3、为了保持在开放连续培养中细胞增殖的稳定性,采取的控制方法: (1)浊度恒定法(2)化学恒定法

二、悬浮细胞的继代 在悬浮培养中,为了保持一定的悬浮细胞增殖速度和增殖量,应定期做继代培养,最适的周 期一般为 1-2 周。但实际所需的时间和接种量应视不同细胞系而定。 继代时间为 1 周的细胞系可用 1:4 的接种量,继代时间为 2 周的可用 1:10 的接种量。 在悬浮培养中,细胞刚进入静止期之初,细胞悬浮液达到最大量,就必须进行继代培养。因 为处在静止期的细胞悬浮液保存时间太长会引起细胞的大量死亡和解体。 为了加速细胞增殖,有的甚至在对数生长期末就进行继代。

三、培养细胞的同步化 同步培养: 在培养基中大多数细胞都能同时通过细胞周期的各个阶段, 同步性的程度以百分 百分数表示。 实现悬浮培养细胞同步化的方法: 1、饥饿法:先对细胞断绝供应一种进行细胞分裂所必需的营养成分或激素,使细胞停滞在 G1 期或 G2 期,经过一段时间的饥饿后,当重新在培养基中加入这种限制因子时,静止细胞 就会同时进入分裂。 2、抑制法:使用 DNA 合成抑制剂,也可使细胞培养同步化。当细胞受到这些化学药物处理 后,由于这些核苷酸类似物的存在阻止了 DNA 的合成,细胞周期只能进行到 G1 期,细胞都 滞留在 G1 期和 S 期的边界,当把这些抑制剂除去后,细胞就进入同步分裂。
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四、培养基的振荡 为了改善液体培养基中材料的通气状况,需进行培养基的不断振荡: (1)旋转培养(2)往返振荡培养(3)旋转振荡培养(4)搅动振荡培养

五、影响细胞培养的因素 1、培养基成分: N6,MS,B5 适合单子叶植物细胞,

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MS,B5,LS,SL 适合双子叶植物细胞。 条件培养基适合单细胞和低密度细胞培养。 需要硝态氮、铵态氮、无机磷浓度更高。 2、细胞密度:培养基的成分和起始细胞密度对单细胞培养成败有影响。 起始密度:细胞培养最低的有效密度,即能使细胞分裂、增殖的最低接种量,低于这个密度 细胞不能分裂,甚至很快解体死亡。 3、植物生长调节剂:细胞悬浮培养时,常表现一种自然的聚集现象,加入 2,4-D,少量水 解酶或酵母提取液,能够增加细胞的分散度。 4、PH 和二氧化碳浓度 在悬浮培养时,PH 变动相当大。加入 EDTA 使铁和其他金属离子长期处于可利用状态。硝态 氮和铵态氮之间进行调整可作为稳定 PH 的一种方法。 二氧化碳对细胞培养没有太大影响, 但在低密度细胞培养中, 二氧化碳对于诱导细胞分裂可 能有重要作用,

第三节 植物细胞生长和活力的测定

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一、悬浮培养中细胞生长的测定 1、细胞计数:把 1 份培养加入到 2 份 8%三氯化铬溶液中,在 70℃下加热 2-15 分钟,然后 将混合物冷却,用力震荡 10 分钟,用血球计数板进行细胞计数。 2、细胞总体积:将已知体积的均匀分散的悬浮液放入 1 个 15ml 刻度离心管中,在 2000g 下离心 5min,得到细胞沉积的体积。 细胞密实体积(PCV) :以每 ml 培养液中细胞总体积的 ml 数表示。 3、细胞鲜重和干重: 4、细胞有丝分裂的指数:在一个细胞群体中,处于有丝分裂的细胞占细胞总数的百分数。 5、细胞植板率=每个平板形成的细胞团数/每个平板接种的细胞总数

二、培养细胞活力的测定 1、TTC 法 2、荧光素二乙酸法(FDA 法)3、伊凡蓝染色法

第四节 植物细胞培养的应用

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一、植物次生代谢产物的生产 (一)生产天然的植物成分 通过细胞培养可得到大量合成的植物次生化合物,如生物碱、 抗菌剂、抗血平、橡胶、类 固醇、糖类衍生物、天然色素等很多物质. 问题: 1.在很多情况下,有些细胞培养物不能产生天然化合物或者比正常的植株产量低 原因: (1)培养细胞与完整植株不同,培养的细胞缺少完整植株 所有的那种进行转化 反应的能力(2)对于能够促成这类天然产物合成的营养条件和其他培养条件缺乏了解 已知:在培养细胞中生物碱的产量受培养物的生长阶段、培养基成分、培养条件(光 照、温度)及细胞基因型等的影响。

2.细胞在遗传上的不稳定性 解决:对能够合成这些化合物的细胞进行不断的筛选,选择那 系。 (二)生产转化 定义:利用生物系统通过水解、加氢、羟基化作用、氧化还原及脂化反应,将有机分 子转化为新的化合物的过程。 方法: (1)给细胞提供在一般情况下植物所不具备的底物化合物。 目的:得到自然界中不存在的化合物。 (2)给细胞提供植物天然产物中间体。 目的:提高该种天然化合物在细胞中的产量。 (三)细胞的工厂化生产 步骤: (1)高产细胞株的选择(2) “种子”培养(3)细胞的规模培养 二、突变体选择 突变体育种缺点:对多细胞有机体进行诱变处理后会形成嵌合体 利用细胞培养进行突变体选择, 多采用离体的单倍体细胞, 因为它能加强获得隐性突 变体的机会。还可以在很小的空间操作千百万潜在的植株。 (1)直接选择法:适用于抗性变异的细胞选择 方法:在培养基中加入某种对正常细胞有毒害的物质,当多数细胞死去以后,把少数能存 活的细胞系分离出来, 转入含有同种毒素但浓度更高的培养基上, 进一步检验这些细胞系的 些稳产和高产的细胞
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突变性质。 (2)间接选择法(负选法) 适用于目标表现型不具有选择上的优势,即细胞未产生某种抗性物质,而是产生了一种代 谢形式或表现形式的性状。 如:在抗氯酸盐细胞的选择中,分离出了硝酸还原美确实突变的细胞系。 硝酸还原酶可还原硝酸成亚硝酸, 加入氯酸盐, 硝酸还原酶也可还原氯酸盐成亚氯酸盐。 亚氯酸盐的毒性比氯酸盐高几百倍。 如果细胞含有硝酸还原酶, 在培养基中加入 20-80mmol/L 氯酸盐, 此浓度氯酸盐虽不足以杀 活细胞,但氯酸盐可被还原成亚氯酸盐,使这些细胞被杀死,存活下来的只有硝酸还原酶确 实的突变细胞。

第五节 人工种子

一、人工种子的概念及意义 定义:离体培养条件下的植物材料,通过繁殖获得大量的高质量的成熟胚状体,把这
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些胚状体外面包上有机化合物作为保护胚状体及提供营养的“种皮” ,从而创造出真种子类 似的结构。 包括 :细胞胚、人工胚乳、人工种皮 分类: (1)裸露或休眠繁殖体(2)种皮包裹的繁殖体(3)水凝胶包裹的胚状体、不定芽等 繁殖体(4)液胶包埋系统 优点: (1)使自然条件下不易结实或种子昂贵的材料能快速繁 殖和保存 (2)繁殖速度快,以一个体积为 12L 的发酵罐计算,在二十几天内可产生胡萝卜体细胞胚 1000 万个 (3)固定杂种优势,可使 F1 杂种优势多代利用,使优良单株快繁成无性系而多代利用,保 持杂种材料的遗传稳定性 (4)由于从任何材料都能得到胚状体,为基因工程技术应用于生产提供桥梁 (5)在人工种子的制作中,加入各种营养成分或生长调节剂,调节植物生长,提高植物抗 逆性 (6)常规种子繁殖每年消耗大量粮食供播种,人工种子在一定程度上可取代天然种子而节 约粮食,同时人工种子体积小,贮运方便,而且可以像天然种子那 样播种育苗。

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二、人工种子的制备技术 (一)胚状体的诱导(胡萝卜) 将胡萝卜天然种子表面消毒, 在无菌条件下发芽成无菌苗→切割下胚轴或子叶接种在含 2,4-D0.5~1.5mg/L 的 MS 培养基上诱导胚性愈伤组织→将胚性愈伤组织悬浮在培养基中, 诱导产生体细胞胚→每 7~10d 更换一次培养液,震荡培养→扩大繁殖量或继代培养。 (二)成熟与干燥 ⑴:繁殖体必须同步增殖并达到成熟方可用于人工种子的制备。体细胞诱导成功后,必须转 入成熟培养基。 成熟培养基特点: ①在培养基中减少或除去激素②加入 ABA③加入 PEG ⑵:对繁殖体进行干燥的研究发现,经过干燥的繁殖体,其人工种子的成株率可明显提高, 但在另一些植物中有降低的趋势。 (三)人工种子的包裹 方法 1. 离子交换法 2. 干燥法 3. 冷却法 用 2.5%的聚氯乙烯作为包裹介质,然后使其干燥固化 用 0.25%的胶包埋,冷却固化
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三、人工种子的贮藏与萌发 因农业生产的季节性限制,要求人工种子能贮藏一定的时间,以适应生产的要求。但 人工种子含水量大,常温下易失水变干,因此人工种子的保存是目前研究的一个难题。 通过对人工种子进行脱落酸、蔗糖、低温及干燥处理,可延长贮藏时间。 人工种子萌发的幼苗中弱苗和畸形苗较多,其主要原因是人工种子的质量问题,包括 体细胞胚的发育和完熟程度、遗传 变异的影响等。在培养基中加入脱落酸,可明显提高胚 状体的质量,增加成株率。

第八章

原生质体培养

一、原生质体概念 原生质体:原生质体去掉细胞壁的由质膜包裹着的裸细胞。 二、原生质体培养意义:

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1、原生质体没有细胞壁,有利于细胞融合,体细胞杂交,基因转移和单细胞培养。 2、原生质体能比较容易摄取外来的遗传物质,作为理想的受体系统进行各种遗传操作的研 究,实现体细胞杂交在植物遗传育种方面的应用。 第一节 原生质体的分离与纯化

一、原生质体的分离 (一) 植物细胞壁的结构及其化学组成 1、植物细胞壁:初生壁:纤维素、半纤维素、果胶 次生壁:纤维素、半纤维素 2、相邻细胞的初生壁间有中层(胞间层) :果胶酸钙、果胶酸镁 果胶化合物是一种可塑性大且高度亲水的交替, 可使相邻细胞粘在一起, 并有缓冲作用。 (二) 降解细胞壁的酶类 用于植物原生质体分离的酶类:纤维素酶:半纤维素酶:果胶酶: (三) 材料来源 1、来源 叶片,花瓣,果实组织,花瓣髓部,子叶等,尤其是叶肉细胞及由各部分形成的培养细胞 和悬浮细胞。 2、预处理 1)低温处理 2)等渗溶液处理 (四)分离方法 1、机械分离法:产生质壁分离——释放原生质体 缺点:原生质体的产量很低;方法繁琐费力;因必须高度质壁分离,故局限性大。 优点:能够排除外加酶对离体原生质体的结构和代谢活性的有害影响。 2、酶分离法:收率高、活力强、完整性好。分离原生质体最有效。 (1)酶的种类及特点:分离原生质体的酶多是一些复合酶制剂,以其所含的主要酶的作用 分为:1、纤维素酶类 2、半纤维素酶类 3、果胶酶类 4、崩溃酶 5、蜗牛酶 (2)酶液的配制 1、酶的配比和浓度 2、渗透压和稳定剂及 PH。 (3)分离原生质体 1、两步分离法。用果胶酶离析植物组织,收集细胞,经洗涤后用纤维素酶解离细胞壁,然 后获得原生质体。2、一步分离法。一定量的纤维素酶和果胶酶组成混合酶液,对材料进行 一次性处理。
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二、原生质体的纯化 1、沉降法(过滤离心法) :低速离心使原生质体沉于底部。 2、漂浮法:根据原生质体和细胞或细胞碎片的比重不同,分离出原生质体。 3、不连续梯度离心法:在离心管中首先放入不同浓度的 Ficoll 溶液,构成不同梯度,在上 部滴入 1-2ml 酶—原生质体混合液,在 150g 离心 5min,不同比重的原生质体漂浮在不同的 浓度梯度的界面上,用吸管手机原生质体,悬浮洗涤备用。 三、原生质体活力的测定 1、荧光素二乙酸法 2、染色识别:用 0.1%酚番红或 Evans 蓝进行染色。 3、形态识别:形态上完整,含有饱满的细胞质,颜色新鲜的原生质体即为存活的。 四、影响原生质体数量和活力的因素 1、供试材料 一般选用继代后 处于旺盛分裂时期的淡黄色、 颗粒状的愈伤组织、 悬浮细胞系或生长健 壮植株上的较幼嫩外植体。 2、酶的种类、组合和酶解时间
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选择纯度高的酶类, 根据酶解材料细胞壁的特性及酶活性大小确定适宜的酶液组合。 酶浓 度不宜过高,酶解时间不宜过长,最好不超过 8h。木本植物细胞壁成分坚厚,半纤维素较 多,适当添加半纤维素。 3、渗透压稳定剂 主要有两类:一类由糖醇或可溶性糖组成的有机溶液,目前大多采用这一类,一般使用 甘露醇或山梨醇,也有的使用蔗糖,使用甘露醇者最多。一类是无机盐类,由氯化钙、硫酸 镁、氯化钾或培养基中的无机盐组成。优点是原生质体的产量高,缺点是可降低细胞壁降解 酶的活性,使高浓度的无机盐进入细胞内,从而影响培养效果。 4、质膜稳定剂 为了提高质膜的稳定性和增加原生质体的产量,可在酶液中添加多聚阳离子和无机钙离 子作为质膜稳定剂。一般添加 0.5%-1.0%的葡聚糖硫酸钾或 0.1%氯化钙。 5、PH 酶液的 PH 对原生质体的产量和活力影响很大, 因植物材料不同要求也不同, 一般为 5.5-5.8。 如原生质体的供体材料是植物器官,酶液中应加入 PH 缓冲剂,以维持稳定酶液的 PH,一般 添加 0.05-0.1%磷酸盐或 3.0-5.0mmol/L MES.

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第二节 原生质体培养 一、培养基 1、碳源:葡萄糖 2、氮源:谷氨酰胺 3、生长物质:生长素与细胞分裂素 4、钙源:可增强 稳定性,提高分裂频率,明显改变细胞质内外的离子交换。5、渗透压:高渗溶液,培养时 一般逐步过渡,通常的渗透剂是甘露醇和山梨醇。6、PH5.6~6.0,醋酸纤维微孔滤膜过滤 灭菌 二、培养方法 1、液体浅层培养 原生质体(约 2×105/ml 密度)悬浮在液体培养基—将悬浮物质移到直径为 60cm 的平皿 中(2-3mm 为宜)—5-10 天后开始原生质体分裂 特点:通气好,原生质体代谢物易扩散,防止有害物质积累过多造成毒害,转移添加新鲜 培养基方便,便于观察和照相。操作简单,可微量培养,细胞植板率高。但原生质体沉淀, 分布不均,细胞团聚集多,难成单细胞株系。 2、平板法培养 原生质体(密度为 4×105/ml)与等量体积琼脂糖培养基均匀混合—置于 6cm 培养皿 (2-3mm),暗培养—5-7 天原生质体开始分裂 特点:原生质体分布均匀,利于分裂,容易获得单胞株系,可定位观察。原生质体易受 热伤害,易破碎,原生质体始终处于高渗透压胁迫下生长发育缓慢,植板率低。 3、悬滴法培养 将含一定密度原生质体的悬浮液, 滴在 6cm 培养皿盖内侧上, 皿底加入培养液和渗透剂 等液体保湿,此时培养小滴悬挂在皿盖内。 特点:用材少,培养液消耗少,利于通风与观察,可做原生质体不同密度的培养对比试 验,进行单细胞培养。 4、双层培养法 固体培养和液体培养浅层培养相结合的方法, 效果最佳。 原生质体采用平板培养方法 包埋在培养皿底层,上面再加入相同成分的液体培养基,暗培养。需更换新鲜液体培养基。 特点:原生质体分布均匀,有利于分裂,易获单细胞株系,能除去抑制分裂的有害物 质,细胞植板率高。原生质体易受热伤害,易破碎。 5、饲喂培养法 将饲喂的细胞用培养基作平板,此平板称饲喂层,用 X 射线或紫外线照射,使核失活但
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细胞存活,然后将原生质体以液体浅层培养或平板技术铺在饲喂层上。 特点:以一种植物细胞制成的平板,支持另一种植物原生质体的生长。饲喂层没有种的 特异性。 三、原生质体存活率、密度及产量的测定 (一)双醋酸盐荧光素染色法测定存活率 存活率=存活原生质体数/总原生质体数×100 (二)测定原生质体的密度 原生质体的密度(个/ml)=(原生质体数/1 区域)×104×稀释倍数 (三)原生质体产量的测定 Y=DV / FW Y(个/g)——原生质体产量 D(个/ml)——存活原生质体密度 V(ml)——制备所得原生质体悬液的总体积 FW(g)——制备原生质体所用材料的鲜重 四、影响原生质体培养的因素 1、原生质体活力 选择生长健康植株上的外植体, 或分裂旺盛的愈伤组织或悬浮细胞, 在酶解处理时酶 制剂浓度不要过高。 2、原生质体起始密度 一般起始密度为 5000-10000 个/ml,看护培养可降低培养密度。 3、渗透压稳定剂 在原生质体培养中除用 2-3%蔗糖作为稳定剂外,还使用 0.3-0.5mol/l 的甘露醇。有 的用葡萄糖完全或部分取代甘露醇,效果也很高。 4、培养基成分 1)基本培养基:MS,B5,Nitsch、N6、KM-8P 2)碳源:葡萄糖(大多数用) 3)无机盐浓度和氮形态:无机盐浓度不宜过高,尤其铵态氮浓度不宜过高。 4)植物生长调节剂的浓度配比: 5、培养条件 光照:原生质体培养初期不需要光照,采用暗培养,当形成细胞团后在光下培养,强光
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抑制细胞分裂 温度:26±1℃ 6、植物材料和基因型 第三节 原生质体融合 也称体细胞杂交,就是分离下来的不同亲本杂交的原生质体,在人工控制下,像性细胞受精 作用那样互相融合成一体。 自然条件下,原生质体自然融合频率极低,必须加以一定的方法诱导,才能促进原生质体的 融合。 二、原生质体融合的方法和过程 (一)无机盐诱导融合 硝酸钠 (二)聚乙二醇(PEG)诱导剂与高钙相结合的诱导融合 1、PEG 诱导剂溶液配制:分子量为 4000-6000。 2、 高 Ca2+-高 PH 液 3、 原生质体培养基: NT 与 MS4、融合过程 (1) 收集原生质体 (2) 滴 150ul 混合双亲的原生质体悬浮液于载体玻片上, 形成一层薄层。 (3)吸取 PEG 融合诱导液 450ul,使 PEG 溶液逐渐与原生质体接触,促使原生质体相粘连。 (4)保温后,取高 Ca2+-高 PH 溶液 0.5ml,滴入原生质体悬浮液与 PEG 混合液中。 (5)吸取 2ml 原生质体培养基洗涤 PEG 处理过的原生质体 5 次。 (6)在载玻片上的材料上,加上一层原生质体生长所须的培养基 (7)融合百分率计算 (三)电融合技术 1、 将原生质体悬浮液离心, 去上清, 用电击液 (10%甘露醇, 0.1mmol/L 醋酸钙, 0.5mmol/L 醋酸镁)2、对电融合仪的交变电场频率,高压方波幅值和持续时间、次数、间隔时间进行 预先设置试验。3、取 1-2 滴悬浮液与电融合仪极间。4、1-2min 后,给予瞬间的高度电脉 冲。 三、杂种细胞的筛选与鉴定 (一)互补筛选 1、白化互补选择法 2、营养缺陷型互补选择 3、抗性互补选择 4、代谢互补仰制选择 (二)机械分离杂种细胞法法 (三)双荧光标记选择法 融合百分率=融合数目/两亲本原生质体总数×100%
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四、杂种植株的鉴定 1、形态学鉴定 2、细胞学观察 3、DNA 内切图谱分析法 4、同工酶分析法

第九章

植物离体繁殖

第一节 植物快繁的器官形成方式 根据器官形成方式的不同,将植物器官的再生分为五种类型: 短枝发生型、丛生芽发生型、不定芽发生型、胚状体发生型、原球茎发生型 一、短枝发生型 是指外植体携带的带叶茎段,在适宜的培养环境中萌发,形成完整植株,再将其剪成带叶茎 段,继代再生成苗的繁殖方法。 特点:一次成苗,遗传性状稳定,培养过程简单,移栽成活率高。 二、丛生芽发生型 是使外植体携带的顶芽或腋芽在适宜培养环境中不断发生腋芽而呈丛生状芽, 将单个芽转入 生根培养基中,诱导生根成苗的繁殖方法。 特点: 是大多数植物快繁的主要方式, 不经过愈伤组织, 能使无性系后代保持原品种的特性, 在生产中普遍使用。 三、不定芽发生型 是外植体在适宜培养基和培养条件下, 经过脱分化形成愈伤组织, 然后经过再分化诱导愈伤 组织产生不定芽, 或外植体不形成愈伤组织而直接从其表面形成不定芽, 将芽苗转移到生根 培养基中,经培养获得完整植株的繁殖方法。 有时将从愈伤组织途径再生不定芽的方式成为器官发生型, 将外植体一直接再生不定芽的方 式成为器官型。 特点: 是许多植物快繁的主要方式, 增殖率高于丛生芽发生型, 但是变异植株发生频率增高, 会导致嵌合形状发生分离。 。 四、胚状体发生型 是外植体在适宜的培养环境中, 经诱导产生体细胞胚的繁殖方法。 外植体诱导产生的愈伤组 织进一步发育成类似合子胚的体细胞胚,或外植体表皮细胞直接发育成体细胞胚。 特点:成苗数量大,速度快,结构完整,是外植体增殖系数最大的途径。但胚状体发生发育 情况复杂,应用没有丛生芽和不定芽广泛。 与丛生芽和不定芽再生的小植株相比,具有两个显著差异:1)胚状体多起源于单细胞。2)
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生理隔离。 五、原球茎发生型 是兰科植物的一种快繁方式,是茎尖或腋芽外植体经培养产生原球茎的繁殖类型。 特点:原球茎是短缩的、呈珠粒状的、由胚性细胞组成的类似嫩茎的器官,它可以增殖,形 成原球茎丛。 由茎尖或腋芽外植体诱导产生原球茎, 切割原球茎进行增殖, 或停止切割使其继续培养而转 绿,产生毛状假根,叶原基发育成幼叶,将其转移培养生根,形成完整植株。 第二节 植物快繁的程序 包括四个阶段: 无菌培养的建立、 繁殖体的增殖、芽苗的生根、小植株的移栽驯化 一、无菌培养的建立 1、母株和外植体的选取 母株应选择性状稳定、生长健壮、无病虫害的成年植株。 木本植物、较大的草本植物多采用带芽茎段、顶芽或腋芽作为快繁的外植体。易繁殖、矮小 或具短缩茎的草本植物多采用叶片、叶柄、花茎、花瓣等外植体。 2、无菌培养物的获得 选取的外植体经适当有效的灭菌处理后, 接种在基本培养基中, 以检测每个材料的菌类污染 情况。一般每一个培养瓶中接种一块材料,避免相互污染。对接种 15 天以上仍未见污染并 且成活的外植体,可转移至促使其启动生长的培养基中。 3、外植体的启动生长 不同外植体启动生长的方式不同,主要有: 1)腋芽被刺激后进行生长; 2)茎段、叶片、花芽、子叶和其他器官外植体的伤口出产生不定芽; 3)外植体切口表面产生愈伤组织。 启动生长所用的培养基随植物种类、 栽培方式和外植体类型的不同而异。 生长素和细胞分裂 素的浓度最重要,刺激腋芽生长时,细胞分裂素浓度为 0.5-1.0mg/l,生长素水平很低;诱 导不定芽形成时,需较高水平细胞分裂素;诱导愈伤组织时,增加生长素浓度并补充一定浓 度的细胞分裂素。 二、繁殖体增殖 1、培养材料的增殖
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以上述五种方式进行增殖。 每种植物采用哪种方式进行快繁,取决于培养目的和材料自身的可能性。 2、增殖培养基 增殖率是植株快速繁殖特别是商业性繁殖的重要指标。 通常,基本培养基与阶段 1 相同,而细胞分裂素和矿物元素的水平要高于阶段 1,最佳浓度 应通过实验确定进行。 3、增殖体的大小和切割方法 为了保证每次继代培养能获得同样的快速增殖效果, 增殖茎段应具有最小组织量, 即携带一 个茎节,但从初代培养物中切割的茎段一般都有 2-4 个茎节。 这些茎段可以垂直插入培养基中,深度不应淹没茎节;或水平放入培养基表面,以刺激侧芽 萌动。 初代培养物切割完茎段后,可以继续进行整块分割,再培养。 三、芽苗生根 1、离体生根 所用基本培养基组成同阶段 1,但需降低无机盐浓度,一般用 1/2 或 1/4 的量,并减少或除 去细胞分裂素,增加生长素浓度。辅以黑暗培养,生根效果更好。 2、活体生根 又称试管外生根。 芽苗可以先在生长素中快速浸蘸或在含有相对高浓度生长素的培养基中培 养 5-10 天,然后在温室中栽入培养基质中,辅以高湿度环境,几天后可自行生根。 四、小植株的移栽驯化 1、移栽 洗去小植株根部附着的培养基,避免微生物繁殖污染,造成小苗死亡。将小植株栽入人工配 制的混合培养基质中,基质用保湿又透气的材料,以利于小植株生长。 2、驯化管理 移栽的试管小植株和活体生根的小植株,湿度的控制十分重要。应采用加覆塑料薄膜、经常 喷雾的方法。同时,逐步降低空气相对湿度,使其适应环境条件。 移栽初期光照强度应减弱,经过一段时间适应后,在逐步增强。 适宜温度与植物种类有关。 防止菌类滋生,适当喷一些杀菌剂。 第四节 植物快繁的商业化应用
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一、商品化生产规模及工艺流程 (一)试管苗生产规模的确定 商业化生产规模的确定应以市场需求为标准,否则试管苗难以销售,造成经济损失。 外植体的入瓶;器官形成及增殖;试管小植株出瓶等试管苗生产过程均是在无菌条件下 进行的,因此,试管苗生产规模是以无菌工作台的数量来衡量的。 一般一个单人无菌工作台可年生产 10 万~15 万株苗,一个 1.2m×0.6m×2.0m 的 6 层 培养架可年繁殖 1.5 万~2 万株试管苗。年产 100 万株的组培苗生产工厂,需 8~10 个无菌 工作台,培养架 40~50 个。接种室面积应为 40~50m2,培养室面积则为 100~120m2。 培养容器的数量取决于生产规模,一个 6 层培养架(1.2mX0.6mX2.Om)可放置 900 个 左右三角瓶,还需增加 10%~15%的周转用培养容器。 (二)商业化实验室的设计 根据生产规模和组织培养的生产程序, 实验室应尽量布局合理, 使生产程序能连续、 有效地进行。 (三)商业化生产的配套设施 配套设施包括过渡培养室和露地
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过渡培养室可内装喷灌设施和可移动苗床。每平方米苗床可栽种 800 株试管苗,一 茬苗的过渡周期为 30d,年产 100 万株苗的过渡培养室,建造面积应为 400~600m2。 (五)试管苗增殖率的估算 Y=mX n Y-年繁殖数 m-无菌母株苗数 (六)生产计划的制定和实施 1.生产计划的制定 销售计划=实际生产数量 X[1—损耗(5%~10%)]×移栽成活率 2.生产计划的实施 ①准备繁殖材料。 ②合格繁殖材料的快速增殖。 存瓶增殖总瓶数=月计划生产苗数/每个增殖瓶月可产苗数 月计划生产苗数=每个操作人员每天可接苗数×月工作日×人员数 全年生产量=全年初评苗数×炼苗成活率 二、商业化生产效益分析 X-每个培养周期增殖倍数 n-全年可增殖的周期数

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(一)规模分析实例 假定平均每天取用 30 瓶母种,转接成 100 瓶,其中 30 瓶为增殖用,以维持母株的瓶 数,另外 70 瓶用于生根。在 35~42 天内有 30~36 个工作日。 存架增殖总瓶数 T=30×30 或 30×36 理论值与实际值的关系: 一株试管苗繁殖数实际值比理论值低得多。 三、成本核算与效益分析 (一)成本核算 1、成本核算目的 通过成本核算可了解: ①生产过程中的各种消耗;②管理工作的质量;③各项技术措施的效果;④产品价格的制定 标准。 2、试管苗商业化的生产成本 ①人工费用。管理人员、技术人员、操作人员的工资和奖金;②生产物资费用。培养基配制 所需的各种药品、低值易耗品、当年消耗品等。③设备折旧费用。试管苗生产所用的各种固
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即:T=900 或 1080(瓶)

定资产的折旧费。④水电费用。商业化生产环节中消耗的水电费。⑤其他费用。办公费、培 训费、差旅费、种苗费、宣传费等。 (二)产品质量监控 商业化生产的试管植株需进行产品质量的跟踪监控,如接种状况、污染率、生长情 况、生根苗数量、出瓶苗质量等,并建立试管苗出瓶标准。根据出瓶苗的质量等级、移栽的 气候条件,估算移栽成活率。并以估算结果为依据,控制和调整生产节奏及进度。 (三)降低商业化生产成本的措施 1、提高劳动生产率 2、减少设备投资,延长使用寿命 3、降低消耗 4、降低污染,提高鳖殖 率和成活率 5、简化培养基 6、减少污染、褐变和玻璃化现象 7、发展多种经营,开展横向 联合 8、商品化生产的经营管理 四、培养中常见问题 (一)污染的原因及其预防措施 1、污染原因 污染是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌,导致培养失败的现象。 病原菌:细菌及真菌两大类。

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⑴细菌污染特点-菌斑呈黏液状,接种后 1-2 天发现。 污染途径: 外植体带菌 培养基及器皿灭菌不彻底 操作人员未遵守操作规程 ⑵真菌污染的特点-污染部分长有不同颜色的霉菌,接种后 3-10 天发现。 污染途径: 周围环境不清洁 超净工作台过滤装置失效 培养瓶的口径过大 2、污染的预防措施 ⑴防止材料带菌的措施 -茎尖作外植体时,进行预培养(无糖)或暗培养。无糖营养液或自来水使枝条抽枝,以新 抽嫩枝作外植体。 -晴天取材,下午取材,经日晒过可杀死部分细菌或真菌。 -接种时除去外部韧皮组织,只接内部的分生组织。 (2)外植体的灭菌 -多次灭菌法,次氯酸钠-无菌水-次氯酸钠 -多种药液交替浸泡法,肥皂水-酒精-次氯酸钠-无菌水。 ⑶器皿与金属器械的灭菌 玻璃器皿可采用湿热灭菌或干热灭菌 金属器皿一般火焰灭菌,也可干热灭菌 ⑷布质制品的灭菌 湿热灭菌 ⑸无菌操作室的灭菌 2%新捷尔灭或 70%酒精擦拭(喷雾) ,紫外灯照射,定期甲醛和高锰酸钾熏蒸。 ⑹严格按照操作程序。 (二)外植体的褐变及其防止措施。 1、褐变的原因 褐变是指外植体在培养过程中体内的多酚氧化酶被激活, 使细胞内的酚类物质氧化成棕 褐色的醌类物质, 这种致死的褐变物向外扩散致使培养基逐渐变成褐色, 抑制其它酶的活性, 影响外植体的分化,最后变褐死亡的现象。 ⑴基因型 某些植物酚类物质含量较多。
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⑵外植体的生理状态 幼年的材料培养含醌类物质较少。 ⑶培养基的成分 -过高的无机盐浓度 -生长调节物质使用不当,BA 过多 -分生能力强的材料,氧化受抑制,褐变也被抑制 -培养条件不适宜,温度过高或光照过强,褐变加速。 ⑷材料转移时间 时间过长引起材料褐变。 2、褐变的防止措施 ⑴选择适宜的外植体及最佳培养基。⑵连续转移。⑶加抗氧化物。⑷加活性炭。0.1-0.5% 活性炭 (三)玻璃化现象及其预防措施 1、玻璃化现象及其产生原因 玻璃化是在细胞生长过程中的环境产生变化,试管苗为了适应变化了的环境而呈玻璃状。 主要原因是: ⑴激素浓度 BA 浓度提高,导致玻璃化苗的产生。⑵琼脂浓度 琼脂浓度低,玻璃化苗增加。 ⑶温度 低温易形成玻璃化苗。⑷光照时间 一般要求 10-12h,大于 15h 玻璃苗增加。⑸通 风条件 培养瓶容量小,气体交换不良,玻璃化苗多。 (6)离子水平 植物种类不同,离子形 态比例量要求不同。 2、预防措施 ⑴控制无机营养成分,降低氮(铵态氮)和氯。⑵提高蔗糖和琼脂浓度⑶降低细胞分裂素和 赤霉素浓度,增加生长素比例。⑷增加自然光照 1000-1800lx,控制光照时间 8-12h。⑸适 温生长, 热击处理防止玻璃化发生。 (6) 使用透气性好的封口膜。 ⑺培养基中加入间苯三酚、 根皮苷或多效唑、矮壮素。 (四)遗传稳定性 1、影响因素 基因型,继代次数,器官发生方式 2、措施 选用不容易发生遗传变异的基因型材料,缩短继代时间,限制继代次数,采用不容易发生遗 传变异的增殖途径, 采用适当的生长调节剂和较低的浓度, 减少或不使用容易引起诱变的物 质,及时剔除生理和形态异常苗。
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(五)黄化 1、影响因素 培养基成分 铁元素、矿质营养、 激素、糖 培养条件 PH 变化过大 抗生素类 2、措施 检查培养基配制过程,调节培养基组成和 PH,控制培养室温度,增加光照,缓解通气情况 减少或不使用抗生素物质 添加抗生素类 通气不良,乙烯含量升高,温度不适,光照不足

第十章

无病毒苗木培育

所谓脱毒就是采用一定的方法除去植物体内病毒的技术。 无病毒苗: 指不含该种植物的主要危害病毒, 即经检测主要病毒在植物体内的存在表现阴性 反应的苗木。 应用植物脱毒技术意义: 植物脱毒技术可使植物恢复原来优良特性,生长势增强,明显提高产量、改善品质, 73 产量的提高幅度最高可达 300%。 植物脱毒技术不仅脱除了病毒,还可以去除多种真菌、细菌及线虫病害,使种性得以 恢复,植株生长健壮,减少肥料和农药施用量,降低生产成本,保护了环境 一、植物脱病毒的机理 病毒在植物体内的分布是不均匀的,在茎尖中呈梯度分布。 在受侵染的植株中, 顶端分生组织无毒和含毒量极低。 较老组织的含毒量随着与茎尖距离的 加大而增加。 分生组织含毒量低的原因可能是: 1)植物病毒自身不具有主动转移的能力,无论在病田植株间还是在病组织内,病毒的移动 都是被动的。在植物体内,病毒可通过维管束组织系统长距离转移,转移速度较快,而分生 组织中不存在维管束。病毒也可通过胞间连丝在细胞间移动,但速度很慢,难以追赶上活跃 生长的茎尖。 2)在旺盛分裂的细胞中,代谢活性很高,使病毒无法进行复制。 3) 在植物体内可能存在着病毒钝化系统, 它在分生组织中比其他任何区域具有更高的活性。

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4)在茎尖中存在高水平内源生长素,可抑制病毒的增殖。 第一节 植物脱毒方法 一、茎尖培养脱毒 (一)通过茎尖培养脱毒的原理 1、病毒在植物体内的分布 病毒浓度不同,离尖端越远病毒浓度越高。茎尖或根尖,离体培养便可获得无病毒再 生植株。 2、茎尖大小与脱毒 茎尖外植体的大小与脱毒效果成反比。 茎尖分生组织不能合成自身需要的生长素, 但 下部叶原基能提供,因而带叶原基的茎尖生长快,成苗率高。但茎尖越大,脱毒效果差。 (二)茎尖脱毒方法 1、取样与消毒 可直接选定的植株上取顶芽进行消毒接种。采顶芽与侧芽消毒接种 。 消毒方法是:剪取顶芽梢段 3、5 厘米,剥去大叶片,用自来水冲洗干净,在 75%酒精中 浸泡 30 秒左右,用 1%-3 次氯酸钠或 5%-7%的漂白粉溶液消毒 10-20 分,最后用无菌水冲洗 材料 4-5 次。 2、茎尖剥离和接种 将已消毒的芽放在带滤纸的培养皿上—器械固定—解剖镜下剥去幼叶—切下带 1-2 个叶 原基的生长点(0.3-0.5mm)—切下的茎尖转至培养基上(顶部向上) 。 3.培养 25+2℃ ,1500-5000LX,10-16h 一般光照培养比暗培养效果好。 其间应更换新鲜培养基。 提高培养基中 BA 的浓度可形成 大量从生芽。 4.生根诱导 诱导生根的方法是将 2-3cm 高的无根苗转入生根培养基继续培养 1-2 个月可生根。 (三)培养基与培养方式 1、培养基:MS, White , Morel 等 2、培养方式:一般采用半固体培养基。
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(四)影响茎尖脱毒效果的因素(茎尖脱毒技术的关键) 植物种类、病毒种类、剥离茎尖的大小(0.3-0.5mm 带 1-3 个叶原基) 、培养基营养 二、热处理脱毒

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脱毒原理即热处理脱毒,一些病毒对热不稳定,在高于常温的温度下(35-40 度)即钝化失 活。 1、温汤浸渍处理脱毒法 材料置于 50℃左右热水中浸渍几十分钟到数小时。 特点:简单易行,成本低,但易使材料受伤。适用:甘蔗、木本植物和休眠器官的处理。 2、热空气处理脱毒法 将植物用 35~40℃的热空气处理 2~4 周或更长时间。 适用:多数植物

特点:损伤较小,操作简便,须严格控制温度时间 3、热处理结合茎尖培养脱毒

目前常采用将热处理和茎尖分生组织培养结合起来的方法脱毒。 特点:既可缩短热处理时间,提高植株成活率,又可剥离较大的茎尖,提高茎尖培养的成活 率和脱毒率。 适用:大多数植物,并可除去一般培养难以去除的纺锤块茎类病毒 三、其他组织培养脱毒方法 (一)愈伤组织培养脱毒 将感染病毒的组织离体培养获得愈伤组织, 再诱导愈伤组织分化成苗, 从而获得无病 害毒植株的方法,即愈伤组织培养脱毒法。 部分愈伤组织细胞不带病毒可能有以下两方面的原因: 一是愈伤组织细胞分裂增殖速度快,而病毒复制速度较慢,赶不上细胞的繁殖; 二是愈伤组织发生了抗病毒突变。 (二)珠心胚培养脱毒 柑橘类种子为多胚种子,除具有合子胚外还有珠心胚,种子一般不带病毒,因此珠心 胚植株不易带病毒。 (三)微尖嫁接脱毒 指在人工培养基上培养实生砧木,嫁接无病毒茎尖(0.14-1.0mm,带 3-4 个叶原基) , 以培养脱毒苗的技术。 脱毒程序:无菌砧木培养——茎尖准备——嫁接——嫁接苗培养——移植。 第二节 脱毒苗鉴定 一、直接检查法 直接观察待侧植株生长状态是否异常, 茎叶上有无特定病毒引起的可见症状, 从而可判 断病毒是否存在。 二、指示植物法
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将一些对病毒反映敏感,症状特征显著的植物作为指示植物,用以检验待测植物体内 特定病毒的存在。即指示植物法。 特点:条件简单,操作方便,经济而有效,只能测出病毒的相对感染力。 (一)草本植物鉴定 1、汁叶涂抹法 被鉴定植物取 1~3 克幼叶—加 10 毫升水及少量磷酸缓冲液-研碎过滤-加 金钢砂作麾擦剂-汁液在叶面上涂抹 2~3 次接种 2、小叶嫁接法 指示植物作砧木,被鉴定植物小叶作接穗,常用劈接法。 (二)木本指示植物鉴定 1、直接在指示植物上嫁接待检植株的芽片 2、双重芽嫁接 3、双芽嫁接法 三、抗血清鉴定法 ?特异性高,测定速度快,几小时甚至几分钟就可以完成。植物病毒鉴定中最有用方法之一。 (一)原理 刺激抗体产生蛋白质抗原。 抗原与抗体间能发生高度专一性的血清学反应 (免疫反应) (二)方法 1、叶绿体凝集法 2、块茎沉淀法 3、环形接口法 4、酶联免疫法:用梅标记抗原或抗体的微 量测定法。现在灵敏度较高和常使用的方法。 四、分子生物学鉴定 1、双链 RNA 法 通过提取纯纯化待测植物 RNA,并对其进行电泳分析,可确定 dsRNA 存在,从而判断待 检植物是否带病毒。 2、互补 DNA(c DNA)检测法也叫 DNA 分子杂交法 五、电镜检测法 运用电子显微镜可直接检测待检植物体内有无病毒粒体存在, 并根据所观察病毒的形 态等对病毒种类进行鉴定。是较为先进的方法,但需一定的设备和技术。 第三节 无病毒苗的保存和繁殖 通过不同脱毒方法所获得的脱毒植株,经鉴定确系无特定病毒者,既是无病毒原种。 无病毒植株并不是有额外的抗病性, 它们有可能很快又被重新感染。 所以一旦培育得到无 病毒苗,就应很好保存,这些原原种或原种材料保管得好可以保存利用 5~10 年。 一、无病毒苗的保存 (一)隔离保存
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通常无病毒苗应种植在隔虫网内,使用 300 目,即网眼为 0.4~0.5mm 大小的网纱, 也可用盆栽钵。 栽培用的土壤也应进行消毒, 周围环境也要整洁, 并及时喷施农药防治虫害, 以保证植物材料在与病毒严密隔离的条件下栽培。?另一种更便宜的方法,是把由茎尖得到 的并已经过脱毒检验的植物通过离体培养进行繁殖和保存。 (二)长期保存 1、低温保存 将无病毒苗原种的器官或幼小植株接种到培养基上,低温下离体保存,是长期保存无病 毒苗及其他优良种质的方法。只需半年或一年更换培养基,也叫最小生长法。 2、冷冻保存(超低温保存) 用液氮(-196℃)保存植物材料的方法。常用冷冻保护剂为 DMSO(5-8%) 、甘油、脯氨 酸(10%) 、各种可溶性糖、聚乙二醇等。 (见十二章) 二、无病毒苗的繁殖 (一)无病毒苗的繁殖方法 1、嫁接繁殖 2、扦插繁殖 3、压条繁殖 4、匍匐茎繁殖 5、微型薯块繁殖 (二)无病毒苗繁育生产体系
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我国农作物无病毒苗繁育生产体系归结为以下模式:国家级(或省级)脱毒中心—— 无病毒苗繁育基地——无病毒苗栽培示范基地——作物无病毒化生产 三、无病毒苗的利用 无病毒苗在生产中的利用也要防止病毒的再感染。? 生产场所应隔离病毒感染途径, ?做好土壤消毒或防蚜等工作。 在此种植区及种植规模 小的地方,要较长时间才会感染。而在种植时间长、轮作及种植规模大的产地则在短期内就 可感染。 一旦感染,影响产量质量的,就应重新采用无病毒苗,以保证生产的质量。

植物组织培养基本操作

第一节

培养基成分、种类及特点

植物生长必需 16 种基本元素:N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、Mn、B、Cu、Zn、Mo、Cl、C、H、 O。

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离体培养条件下,各元素主要从培养基中获得:H 和 O 来源于水,C 来源于添加的糖类,其 它矿质元素来源于组成培养基的无机盐。 培养基是根据植物生长所需营养成分,配制成的供植物生长的人工制作的营养物质。

一、培养基的成分 培养基一般包括无机盐、有机化合物和生长调节剂三大基本组成成分。 1、无机盐类 功能: 离体组织生长发育的基本成分 根据植物对必需元素需要的量,可以分为以下两类: 大量元素—植物所需元素的使用量一般在每升几十-几千毫克,有 C、H、O、N、P、K、Ca、 Mg、S。 微量元素—植物所需元素的浓度小于 10-5~10-7mol/L,Fe、Cu、Zn、Mn、Mo、B、Cl。 除 C、H、O 外,其它矿质元素通常以离子态吸收 N-硝态氮和铵态氮 2、有机化合物
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培养基中只有无机盐叫做基本培养基,为使培养物更好的生长,还需添加有机成分,常用 有糖类、维生素、醇类、嘌呤、氨基酸等。 ⑴糖类 功能 离体培养物生长与发育不可缺少的有机成分,即作为碳源,又维持培养基的渗透压 在 1.5-4.1MPa。 多使用蔗糖,试管苗生长与繁殖浓度 2-3%,幼胚培养 4-6%,某些特殊培养中用 8-10%。 细胞和原生质体培养还用麦芽糖、葡萄糖、果糖。 ⑵维生素类 功能 参与酶的形成、蛋白质、脂肪代谢,明显的促进离体培养物的生长。 盐酸硫胺素-VB1、盐酸吡哆醇-VB6、烟酸-Vpp、生物素-VH、维生素 C-Vc。 ⑶肌醇 功能 促进糖的转化、维生素和激素的利用,对胚状体和芽的形成有良好影响。 用量 一般 50-100mg/L。 ⑷腺嘌呤 合成各种细胞分裂素的前体物质之一,利于细胞分裂,促进芽的形成和生长。

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⑸氨基酸 蛋白质的成分,是有机氮化合物,常用甘氨酸和多种氨基酸混合物如水解酪蛋白、水解 乳蛋白。 ⑹其它复合成分 成分尚不清楚的天然提取物,如椰乳、香蕉汁、酵母提取液、番茄汁、麦芽糖等。 3、生长调节物质 ⑴生长素类 功能 促进细胞脱分化和细胞伸长,诱导愈伤组织产生 生长素与细胞分裂素协调作用,在离体培养中,生长素促进根的形成,抑制芽的形成。 液体培养中利于体细胞胚胎发生。 常用 IAA、IBA、NAA、2,4-D。 ⑵细胞分裂素类 功能 促进细胞分裂和扩大,调节器官分化,延缓组织衰老,增强蛋白质合成。离体培养 中,促进不定芽的发生,与生长素协调作用可有效控制培养物的生长与分化。 常用 6-BA、ZT、KT、2iP。 植株的形态建成是 CTK 和 IAA 的比值调控的 CTK/IAA 高,诱导愈伤组织形成芽 ⑶赤霉素类 功能 促进细胞伸长生长、诱导花芽形成、打破种子休眠以及诱导单性结实等。 CTK/IAA 低,诱导愈伤组织形成根
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与生长素协调作用对形成层分化有影响,刺激体细胞胚进一步发育成植株。有 20 多种,目前主要是赤霉酸 GA3。 4、水 离体培养中,既是培养基营养成分的溶剂,又是培养基的重要组成部分,占培养基成 分的 95%。 原生质体培养、细胞培养及分生组织培养一般应用双蒸水或超纯水 大批量快速繁殖培养,可用一般蒸馏水或纯净水。 5、其它附加成分 ⑴琼脂 功能 来自海藻的多糖类物质,组织培养中最常用作凝固剂,是最方便、最好的凝固 剂和支持物。

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常用量 0.6%-1.0%,不是培养基必需成分。 卡拉胶 海藻提取物,含杂质少纯度更高,凝固后培养基透明,利于材料观察。 ⑵活性炭 功能 常用的吸附剂, 某些培养类型中, 可以吸附培养过程中产生的一些有毒物质 (酚 类物质) ,有利于培养物的生长。常用浓度 1~5mg/L 左右 其吸附作用选择性较差,使用应慎重。常受温度影响,低温吸附效果好,高温吸附能 力降低甚至解吸附。 ⑶抗生素 培养基中添加抗生素可防止菌类污染,常用的抗生素有青霉素、链霉素、庆大霉素等,用 量一般为 5~20mg/L。大部分抗生素需要过滤除菌。 ⑷抗氧化物 抗酚类氧化常用的药剂有半胱氨酸、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)及抗坏血酸(Vc) ,可用 50~ 200mg/L 的浓度洗涤刚切割的外植体伤口表面,或过滤除菌后加入固体培养基的表层。

二、常用培养基的种类、配方及特点

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(一)培养基种类 1、根据态相分: 固体培养基-加凝固剂的培养基 液体培养基-不加凝固剂的培养基。 2、根据培养过程分: 初代培养基-初次接种外植体的培养基。 继代培养基-接种初代培养之后培养物的培养基。 3、根据作用分: 诱导培养基-诱导外植体启动生长 增殖培养基-诱导离体培养苗扩大繁殖。 生根培养基-诱导离体培养苗生根 4、根据营养水平分: 基本培养基-包含无机盐等基本营养成分。 完全培养基-包含使植物离体生长全面营养。

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(二)几种常用培养基 细胞工程常用的基本培养基有: MS、MT、White、Nitsch、 Blaydes、N6、B5、NT、SH、Miller、Heller 等。 (三)几种常见培养基的特点 1、富盐平衡培养基 无机盐浓度高,元素比例适当,离子平衡好,具有较强的缓冲性,培养中维持较好的稳定 性,含高量氮、钾,营养丰富,元素种类齐全,MS 培养基使用最广泛。 2、低盐培养基 无机盐浓度低,有机成分含量低,多数作为生根培养基、胚胎培养使用,常用 White 培养基。 3、高硝态盐培养基 较低铵盐,高硝酸盐和盐酸硫胺素 B5 培养基适合双子叶植物特别是木本植物的生长。 N6 培养基为水稻等禾谷类花药培养设计,KNO3 和(NH4)2SO4 含量高,不含钼。 SH 培养基 (NH4)H2PO4 代替(NH4)2SO4,矿质浓度较高,多数单子叶和双子叶植物上使 用较好。 4、中盐培养基 大量元素无机盐为 MS 的 1/2,微量元素种类减少含量增高,无肌醇维生素种类多,增加 生物素、叶酸,有 H、Hitsch、Miller、Blaydes 等培养基,适用于特殊细胞培养。
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第二节

培养基的制备

一、培养基母液的配制 (一)营养成分的配制 根据药品性质将母液配制成以下四类: 1、大量元素 可以混在一起配制成 10—20 倍液, 硫酸镁和氯化钙 Ca2+和 Mg2+会与磷酸盐混合, 产生 不溶性沉淀,要分别单独配制,Ca2+与 PO4-一起混合易沉淀,定容后消失。 2、微量元素:可配成 100—200 倍混合母液,KI 可单独配。 3、铁盐:硫酸亚铁和 EDTA 钠盐易沉淀,需单独配制,配成 100—200 倍鳌合剂不易沉淀。 4、有机化合物:维生素、肌醇、氨基酸等一起配成 100 或 200 倍液,也可分别配制。

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(二)植物生长调节物质的配制 植物生长调节物质分别配成母液储于冰箱,浓度一般为 0.5-1mg/ml。 1、IAA、NAA: 先用少量 95%酒精使之充分溶解。 2、2,4-D: 可用少量 0.1mol/L 的 NaOH 溶液充分溶解,再缓缓加蒸馏水定容至需要的体积。 3、KT 和 BA 等细胞分裂素类: 先用少量 0.1mol/L 的 HCl 溶解,再用蒸馏水定容至需要的体积。 (三)药品用量的计算: 配制母液时药品用量(mg)=配方用量(mg)×浓缩倍数×制备容量(L)

二、培养基的制作 (一)母液取用量的计算 制备培养基时母液取用量(ml)=1000÷浓缩倍数×制备培养基数量(L) (二)培养基制作程序 1、按大量元素、微量元素、铁盐、有机成分顺序将母液取出,混合。 2、适量蒸馏水放入加热容器,蒸馏水应少于所制培养基数量,约终体积的 2/3-3/4,接 通电源加热。 3、向加热容器中加入称量好的琼脂(0.6-0.8%) ,搅拌加热,至完全溶化。 4、琼脂熬化后,称取相应量的蔗糖(2-3%) ,加入加热容器中至溶解。 5、将母液混合液加入到加热容器中,搅拌混匀。 6、蒸馏水定容至所需体积。 7、 测试培养基溶液的 PH 值(5.8-6.0), 过高滴加 0.1mol/L 的 HCL 调整, 过低滴加 0.1mol/L 的 NaOH 调整。 8、迅速分装到培养瓶中,备用。
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三、培养基及培养器械的灭菌 制备好的培养基如果带菌, 会导致植物离体培养失败, 因而还要对培养基进行灭菌处理。 (一)高压蒸汽灭菌 培养基的灭菌一般采用湿热灭菌法:

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1、培养瓶及培养器械放入高压灭菌锅。 2、灭菌锅加水至淹没电热丝。3、封闭高压灭菌锅 各出气口。4、接通电源加压至 49kPa(0.05MPa)5、打开排气阀,排冷气至压力 0 kPa。6、 继续加压至 108kPa(0.11mPa-0.12Mpa,即 121℃)7、压力至 108kPa(0.11mPa-0.12Mpa, 即 121℃)时,稳压在此压力 15-20min。8、关闭电源自然冷却至压力为 0 kPa。9、取出培 养基和器械冷却,贮存于 30℃以下室内。 (二)干热灭菌 培养瓶、三角瓶、试管等玻璃器皿及接种器械,可以进行干热灭菌。即将洗涤干净的玻 璃器皿放到烘箱中,在 150℃温度下,干热灭菌 1 小时,或 120℃下灭菌 2 小时。 灭菌完毕冷却后取出器械贮存。贮存室要保持无菌、干燥、以免造成培养基的二次污染。 灭菌后的培养基一般应在 2 周内使用,时间过长易造成潜在的污染。 培养基灭菌后如果出现过多沉淀或琼脂不凝固等现象,该培养基不能继续使用,应查明 原因重新配制。

第四节

外植体无菌接种
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一、植物材料的培养与取材 外植体—是指用于离体培养的活的植物组织、 器官等材料, 是植物离体培养的基础材料。 1、外植体的来源 -生长在自然环境下的植物 -有目的地培育在温室控制条件下生长的植物 -无菌环境下已经过离体培养的植物 自然环境中生长的植株,一般带有微生物,甚至与某些微生物具有寄生关系,使植株具有 内生菌。取自这些植物的外植体,在培养过程中会有微生物滋生,从而影响培养效果。 多数情况下, 应尽量使用温室或人工气候室控制培养的植物材料作为外植体来源, 减少培 养过程中的微生物感染概率。同时,生长在控制条件下的植物可以保持培养料间的一致性, 提高实验的可重复性,也便于培养技术的规范。 2、供体植株的管理 取自室外的外植体材料, 供体植株的管理十分重要, 这与外植体培养时的污染率密切相关。 植株管理中应注意: ⑴避免昆虫危害 许多昆虫如蚜虫、 螨类和飞虱是许多植物病虫害的传播媒介, 会引起植物

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组织的潜在感染。 ⑵注意防病 尤其是真菌和细菌病害的侵染, 取自感病植株的外植体, 在培养中的污染率远 远高于来自健康植株的外植体,必要时需使用化学药剂防治病害。 ⑶控制湿度 给供体植株浇水时应从根部给水, 避免从上部浇水, 以免上部形成易于病原侵 染的湿度环境;尽可能降低温室湿度;取材前尽可能保持植株干爽。 1、材料取材 ⑴材料选择 培养材料应选择有代表性的主要植物、选择性状优良的种质或特殊的基因型。 快速繁殖时应在植株生长的最适时期取材,花药培养应在花粉发育到单核期取材。 选取材料的大小一般在 0.5-1.0cm 之间。胚胎培养或脱毒在 0.5cm 以下。材料太大易污染, 材料太小难于成活。 ⑵采收 从生长健壮的无病虫害的植株上选取发育正常的器官和组织。最好采用茎尖,后代性状 较稳定,携带细菌较少 。 二、预处理与表面灭菌 1、预处理 先对植物材料进行修剪整理,去掉不需要部分,将准备使用的植物材料(外植体)在流水 中冲洗 20-60 分钟,备用。如特别不洁的外植体,可先用加有洗涤剂的水清洗 10-15 分钟, 再用流水冲洗干净。 2、表面灭菌 (1)操作人员穿戴灭菌过的工作服、口罩。进入接种室前双手用洗涤剂清洗干净,操作前 再用 70%酒精或消毒剂擦洗双手。 (2)操作期间双手和台面常用 70%酒精或消毒剂擦拭。超净工作台使用前必须用紫外灯照 射杀菌,然后开启风机。 (3)接种用工具(解剖刀、剪刀、镊子)可放入 70-75%酒精中,使用时需火焰灼烧灭菌, 冷却后使用。 (4)外植体放入超净工作台内,置 70-75%酒精中 5-60 秒,0.1 氯化汞 6-10 分钟,或 10% 的漂白粉上清液中 10-15 分钟,然后用无菌水冲洗 3-5 次。灭菌时需进行搅动。 常用灭菌剂使用浓度及效果比较表
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灭菌剂 次氯酸钙 次氯酸钠 氯化汞 抗菌素 酒精 过氧化氢

使用浓度 9-10% 2% 0.1-1% 4-50mg/L 70-75% 10-12%

持续时间 去除的难易 5-30 分钟 5-30 分钟 5-10 分钟 30-60 分钟 0.2-2 分钟 5-15 分钟 易 易 较难 中 易 最易

效果 很好 很好 最好 较好 好 好

三、外植体的接种—无菌接种 外植体的接种是把经过表面灭菌后的植物材料切碎或分离出器官、组织、细胞、转放到 无菌培养基上的全部操作过程。整个过程均需无菌操作。 (1)借助接种用工具将材料切割分离。 (2)将培养基放入超净工作台内,火焰灼烧培养基 瓶口,然后打开培养瓶口,置培养瓶为斜角,避免灰尘落入平中。 (3)迅速将切割分离下的 所需组织、细胞、器官,放入培养基上,及时盖上瓶盖。 (4)工具用后应及时灭菌,避免交 叉污染。 (5)工作人员操作时禁止不必要的谈话。
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第五节 外植体的培养

一、外植体的培养条件 1、光照 光照对植物生长发育有重要作用,是离体培养中非常重要的环境因素。光照强度、光质以 及光照时间,对细胞的增殖、器官的分化都有很大影响。除特殊要求外,一般都采用日光灯 作光源, 光照强度 1000-5000Lx, 根据不同植物或器官需要, 可以每天连续光照 12-16 小时, 也可每天光照 16 小时,8 小时黑暗。 2、温度 离体培养中对温度的控制比光照更为重要,大所数植物最适温度在 23-32℃之间。培养 室温度是 25±2℃。低于 15℃时,培养的组织生长停顿,高于 35℃对生长也不利。因此, 培养室应安装空调机或其他的控温设备。 3、湿度 培养瓶内相对湿度通常是 100%,而环境中的相对湿度会直接影响培养基的水分蒸发。因

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此,培养过程中,培养室一般要求相对湿度保持在 70-80%,相对湿度过低影响培养物生长 和分化,应向室内喷洒水,以提高湿度;过高杂菌滋生,大量污染,应及时地通风除湿。 4、氧气 离体培养的试管苗是需要氧气的,在固体培养或液体静置培养时,如果组织完全浸入培 养基中,与氧气隔绝,就会停止生长。因此,接种时要有部分组织合空气接触。振荡培养是 解决通气的良好办法。固体培养中,如瓶塞不透气,培养物也不能生长,要选择通气性好的 培养瓶盖, 增加可利用的氧气, 迅速除去释放出来的 CO2, 有利于外植体外层细胞开始分裂。

植物组织培养步骤: (1)准备阶段 查阅相关文献, 根据已成功培养的相近植物资料, 结合实际制定出切实可行的培养方案。 根据实验方案配制适当的化学消毒剂以及不同培养阶段所需的培养基,并经高压灭菌或 过滤除菌后备用。 (2)外植体的选择与消毒 选择合适的部位作为外植体,采回后经过处理,然后进行消毒处理。
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将消毒后的外植体在无菌条件下切割成一定大小的小块,或剥离出茎尖、挑出花药,接 种到启动培养基上。 (3)启动培养 接种后的材料置于培养室或光照培养箱中培养, 促使外植体中已分化的细胞脱分化形成 愈伤组织,或顶芽、腋芽直接萌发形成芽。 将愈伤组织转移到分化培养基分化成不同的器官原基或形成胚状体, 最后发育形成再生 植株。 (4)增殖培养 分化形成的芽、原球茎数量有限,采用适当的增殖培养基经反复多次切割转接。 当芽苗繁殖到一定数量后,再将一部分用于壮苗生根,另一部分保存或继续扩繁。进行 脱毒苗培养的还要进行病毒检测。 (5)生根培养 刚形成的芽苗往往比较弱小,多数无根,此时可降低或不加细胞分裂素浓度,提高生长 素浓度,促进芽苗生根,提高其健壮度。 (6)炼苗移栽

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选择生长健壮,有 3~5 条根的生根苗进行炼苗,移栽到疏松透气的基质中,注意保温、 保湿、遮荫。当苗完全成活后,再移向大田。

二、外植体的成苗途径(第三章后讲) 外植体的成苗途径有三种: (一)外植体-愈伤组织-完整植株。 具体又可分为三种: 1、愈伤组织-同时长芽和根-植株。2、愈伤组织-茎-根-植株。3、愈伤组织-根-芽-植 株。 (二)外植体-胚状体-植株。可从以下几种培养物中产生: 1、器官上发生。2、愈伤组织上发生。3、游离单细胞发生。4、小孢子发生。 诱导胚状体比诱导芽数量多、速度快、结构完整。 (三)外植体-直接形成根与芽-植株。如茎尖培养

第五节 试管苗的驯化移栽(后讲)

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一、试管苗的特点 1、试管苗的生态环境 组织培养出来的苗通称试管苗或组培苗。 试管苗长期生活在密闭容器中,形成其独特生态系统,与外界环境相比,有四大差异 ⑴高恒温 试管苗整个生长过程中采用的是恒温培养,温差很小。并且温度一般控制在 25+2℃甚至 更高。 外界环境条件温度不断变化,其调节由太阳辐射决定,温差很大,而且一般不会达到 25+2℃。 ⑵高湿 试管瓶内水分移动途径有两条: (1)试管苗水分从气孔蒸腾(2)培养基向外蒸发,凝结后又进入培养基 水分移动循环造成瓶内相对湿度接近 100%,远远大于瓶外空气湿度,故试管苗蒸腾小。 ⑶弱光:试管瓶内光照一般比太阳光弱,幼苗生长也较弱,不能受太阳光直接照射。

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⑷无菌 试管苗所在环境无菌,与外界有菌环境不同,试管苗也无菌,同时,培养瓶内气体环境 较为特殊,与外界环境有很大差异。 2、试管苗特点 ⑴试管苗生长细弱、茎叶表面角质层不发达 ⑵叶绿体的光合作用较差 ⑶叶片气孔数目

少,活性差 ⑷根的吸收功能差 ⑸对逆境的适应性和抵抗能力较差

二、试管苗的驯化 1、驯化的目的 提高试管苗对外界环境条件的适应性,提高光合能力,使试管苗健壮,提高试管苗移栽 成活率。 2、驯化原则 调节温湿光和无菌等环境要素,开始和培养条件相似,后期与预计栽培条件相似。 3、驯化方法 将长有完整试管苗的培养瓶由培养室转到半遮荫的自然光下锻炼,并打开瓶盖注入少量 自来水使幼苗逐渐降低温度,转向有菌,一般进行 1-2 周。
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三、试管苗的移栽 1、常规移栽法 将已诱导出大量根的试管苗,驯化 3-5 天,移到无菌混合土中,当长出 2-3 片新叶时, 栽到田间或盆钵中。 2、直接移栽法:直接将试管苗移栽到盆钵的方法。 3、嫁接移栽法:用试管苗做接穗嫁接在同一植物的实生苗上。 嫁接移栽优点: 1、移栽成活率高。2、适用范围广,嫁接移栽也适用于弱苗或污染苗。3、需时间短,20 天 成活,缓苗期 10-15 天。4、植株生长发育较快。 四、提高试管苗移栽成活率的途径 1、壮苗移栽比弱苗移栽成活率高 2、生长素(NAA)利于生根 3、低无机盐浓度生根效果好 4、活性炭利于嫩茎生根 5、避免太阳直射,温度 25-30℃,湿度在 85%以上 6、使试管苗逐 渐从无菌向有菌过渡


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