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RNA干扰技术解析_图文

RNA干扰技术
张风娇

简介
RNA干扰(RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双

链RNA(dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解,
导致转录后基因沉默的现象。由于这种现象发生在转录后, 故又称为转录后基因沉默(PTGS)。 RNAi是近年来研究生物体基因表达、调控与功能的一项崭

新技术,它利用了由小干扰RNA(siRNA)引起的生物细胞内同
源基因的特异性沉默现象,其本质是siRNA与对应mRNA特异 结合,使之降解,从而阻止mRNA的翻译。

RNAi的发现和发展历程
1984年, Jonathan 研究小鼠 L 细胞时发现 反义mRNA 会干扰同源基因的表达,机制 不清 ? 1990年 Jorgensen等 矮牵牛颜色加深实 验 “共抑制(co-suppresion)”
?

P35S 重组

色素基因

? 1990, Jorgensen et al,
?

材料:矮牵牛花 ( petunias)

Ti质粒 +色素 基因 转化

?方法:构建强启动子色素基因(苯基苯乙

烯酮合酶)表达载体,导入牵牛花
? ?

结果:杂色(花变得更白)。 分析:所转基因(外源)和同源的内源基
繁殖

因的表达都被抑制。这个现象称之为共抑制

1995,康乃尔大学Guo Su et al ? 材料:秀丽新小杆线虫(C. elegans) ? 目的:消除线虫第一次分裂的不对称性 ? 方法: 反义RNA 特异性地阻断par-1基因的表达; 正义RNA 以期观察到基因表达的增强。
?

1998年,Fire和Mello通过一系列设计精巧的实验,证明双链 RNA是引起上述基因沉默现象的根源。

证明外源导入的单链正义 RNA只有在反义RNA存在

的条件下才能引起RNA降 解。Fire和Mello首次将这 种双链RNA引起的基因沉 默现象称为RNA干扰。

2006年10月2日由诺贝尔奖评审委员会授予了2位美国 科学家AndrewA.Fire和CraigC.Mello,以表彰他们发现 了真核生物中的RNA干扰(RNAinterference)现象。

Andrew.Fire

CraigC.Mello

RNAi广泛存在于自然界
?

RNAi 现 象 被 广 泛 地 发 现 于 真 菌 、 拟 南 芥 (Arabidopsis thaliana) 、水螅、涡虫 ( Planaria) 、锥虫 ( Trypanosomes) 、 斑 马 鱼 ( Zebrafish) 、 果 蝇 (Drosophila) 、大小鼠和人体内等大多数真核生物中。
这种存在揭示了RNAi很可能是出现于生命进化的早 期阶段。 随着研究的不断深入,RNAi的机制正在被逐步阐明, 而同时作为功能基因组研究领域中的有力工具,RNAi 也越来越为人们所重视。

?

?

参与RNA干扰的几个重要因子
1、Dicer酶
Dicer酶是一种ATP依赖性核酸内切酶,属于RNase酶家 族的成员之一。Dicer酶能产生RNA干扰所必需的siRNA和 miRNA(microRNA),这些小的RNA的特性由Dicer酶蛋白 的结构决定。 Dicer酶蛋白包括RNA、HELICs、PAZ、RNase和 dsRNA结合域。不同生物体具有不同数量的Dicer酶,各 Dicer酶既有功能上的各自独立,又有冗余和交叉。在进化 过程中,Dicer酶的数量逐渐减少,却逐步整合从而表现出 更多功能。

2、小干扰RNA

siRNA是通过Dicer酶或类Dicer酶从长的双链RNA切割产生 或通过化学途径合成的,大小为21~25个核苷酸(nt),siRNA 可以与多细胞蛋白结合形成RISC。
3、RNA诱导的基因沉默复合物 RISC是一种核酸和蛋白质的复合物(包括蛋白质和siRNA), 可以将同源的mRNA分解成siRNA;

4、RNA依赖的RNA聚合酶 RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)在转录后基因沉默中起着重 要作用。

RNAi 的机制
?

第一步(起始阶段),较长 dsRNA在 ATP参与下

被 Dicer 酶切割成 21~23nt ,由正义和反义链组成,
即小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)。

ds RNA Dicer酶 siRNA

?

第二步(效应阶段)。siRNA和内切核酸酶以及其它蛋白 一起形成沉默复合物( RISC )。 RISC 由siRNA、解旋酶、 ATP、核酸内切酶、核酸外切酶等多种成分组成。当ATP 存在时, RISC 中依赖 ATP 的解旋酶在 ATP 供能下解开 siRNA 双链,释放出正义 RNA 链,RISC被活化。

蛋白复合体 siRNA RISC

siRNA解链

活化的RISC

?

活化的 RISC 在单链 siRNA 引导下识别目的 mRNA ,并在
RISC 中的核酸内切酶作用下从 siRNA 引导链中心所对应 的靶基因位置切割靶mRNA,最后可能再被核酸外切酶进 一步降解,从而干扰基因表达。

结合目的mRNA mRNA 活化的RISC

?

第三步(倍增阶段)在 RISC 复合物中,以 siRNA 的单链 为引物,以 mRNA 为模板,在 RNA 指导的 RNA 聚合酶作 用下,合成 mRNA 的互补链,即形成 dsRNA 。 dsRNA 再 被Dicer酶裂解成新的siRNA(次级siRNA)。 因此,细胞内的siRNA数量大大增加,显著增强了对基因 表达的抑制作用。 siRNA 也可转运出细胞,使 RNAi 扩散 到整个机体。

?

扩增

RNA干扰的作用特点
1、RNAi是转录后的基因沉默机制 转录后水平的基因沉默。针对的是成熟mRNA. 2、RNAi的高效性 高效性:相对较少的dsRNA就可以使相应的基因表达受抑制 3、特异性: 在siRNA21~23个碱基对中有1~2个碱基错配会大大降低对靶 mRNA的降解效果;只降解与其序列相关的单个内源性基因的 mRNA

4、ATP的依赖性 RNA干扰是一个ATP依赖的过程原因可能是ATP为Diecer和 RISC的酶切反应提供能量。 5、长度有限 在siRNA介导作用下,长链dsRNA在细胞内被Dicer酶切割为 21-23bp左右的siRNA,大于30bp的dsRNA在哺乳动物中不能 诱导特异的RNA干扰过程 6、可传播性和遗传性 dsRNA分子能够通过细胞膜、细胞间隙和细胞屏障而被转运; RNA干扰机制中可能存在维持mRNA降解序列特异性的信号 分子。但这种遗传只限于子一代,子二代往往又回复到野生 型

RNAi的作用
1、抗病毒功能:
RNA沉默被认为是低等生物和植物抗病毒防御系统的一道

防线。

2、基因调控
在小分子RNA中发现了一类与调节基因表达密切相关的分

子microRNA(miRNA)。这种内源性的小分子RNA针对3’端非 编码区,有着极高的保守性,并在组织中广泛表达,可在转 录后以及翻译水平上调控基因表达。

RNAi的分子作用机制
1、siRNA引起的基因沉默

miRNA诱导的基因沉默
miRNA是一种广泛存在于真核生物中内源性的、高度保守 的、非编码小的RNA。 miRNA主要是通过抑制翻译来实现基因的沉默,成熟的双 链miRNA会很快被整合到miRNA介导的沉默复合体(miRISC) 中。 成熟miRNA结合到与其序列互补的mRNA位点,通过2种依 赖于序列互补机制负性调控靶基因的表达。如果miRNA与靶 位点序列完全互补,miRNA的结合会引起mRNA的降解;如 果miRNA与mRNA不完全互补,则能抑制mRNA的翻译过程。

RNA干扰设计流程

siRNA转染

设计siRNA序列
siRNA的序列专一性要求非常严谨,与靶mRNA之间一个 碱基错配都会显著削弱基因沉默的效果。 在植物、原生动物、昆虫、线虫中应用RNAi技术相对是比

较简单的,因为通过体外转录的方法制备较长的双链RNA并
不困难。但是在哺乳动物细胞中就麻烦多了,因为超过30nt的 dsRNAs会引起非特异基因沉默。实验表明,在哺乳动物细胞 内引发特异的基因沉默最有效的siRNAs是有19-29个互补碱基, 3′端各有2个碱基突出(通常是UU)的dsRNAs。

获得siRNA产物方法
?

目前主要有5种方法用于siRNA的制备

(1)化学合成法;(2)体外转录法;
(3)长链dsRNA的RNaseIll体外消化法;

(4)siRNA表达载体法;(5)siRNA表达框架法。
?

前3种是在体外制备然后导入到细胞中;后两种则

是基于具有合适启动子的载体或转录元件在哺乳动
物或细胞中转录生成siRNA。

(1)化学合成
?

是指将直接化学合成siRNA通过专用的RNA转染 试剂,瞬时转染可以将这些siRNA转入细胞内进 行实验。该方法合成的siRNA组成均一性高,能 合成很高的量,能进行更多的化学修饰。缺点是 合成费用相当高,合成用的时间长。 最适用于:已经找到最有效的siRNA的情况下, 需要大量siRNA进行研究; 不适用于:筛选siRNA等长时间的研究,主要原 因是价格因素。

?

?

(2)体外转录
?

是指体外条件下,以短的双链寡核苷酸盒式结构 为模板,该结构在紧连siRNA模板链的上游启动 子序列,利用T7RNA聚合酶转录得到siRNA。

?

最适用于:筛选siRNAs,特别是需要制备多种

siRNAs,化学合成的价格成为障碍时。
?

不适用于:实验需要大量的,一个特定的siRNA。 长期研究。

(3) 长片断双链 RNA 经RNase III降解
?

?

?

?

选择通常是200—1000碱 基的靶mRNA模版,用 体外转录的方法制备长 片断双链dsRNA RNase III (or Dicer) 在体 外消化,得到一众 siRNAs 除掉没有被消化的 dsRNA siRNA混合物直接转染细 胞

(4)siRNA表达载体

是将siRNA对应的siDNA序列克隆到含有适当启动子
和转录终止信号之间形成siRNA表达载体,然后导入细 胞中利用胞内的RNA聚合酶转录出siRNA。随后起始 RNAi过程,引发基因沉默。

构建RNAi表达载体的方法
由于RNAi表达载体可实现长效抑制,可以重复扩增,显著

降低实验成本,因此构建RNAi表达载体是高效、高通量表
达siRNA的常规方法: (1)寡核苷酸退火法 (2)双元启动子法 (3)PCR扩增法 (4)一步PCR-同源重组法

siRNA的转染
不同的生物体可以选择不同的方法
简单生物,如单细胞生物等,可选用电穿孔的方法; 较复杂生物可选用dsRNA微注射入生殖细胞或早期胚胎,线虫 也能采用肠道或假体腔注射的方法,还有浸泡法、工程菌喂养

法、磷酸钙共沉淀法等。
若使用的是化学法人工合成的siRNA(正义链和反义链),还要经 过退火过程,以双链的形式导入靶细胞。

RNAi效果检测
RNAi效果可从mRNA和蛋白质两个水平来进行量化。

(1)在mRNA水平上,NorthernBlot和实时定量
PCR是两种常用方法。

(2)蛋白质水平可以通过WesternBlot、荧光免疫
检验法、流式细胞分析术和表型分析来检测。

RNAi在基础学方面的研究
1、高通量研究基因功能
针对某个已知的基因,设计可诱导其表达抑制的siRNA,将 其导入细胞或机体,使该基因的的表达水平下降或抑制,从而

研究基因功能。RNAi技术可以简单快速地抑制一个基因的表达,
而且能够通过选择不同的作用位点分别或同时作用于同一个基 因家族的若干个成员,因此RNAi干扰技术是研究基因家族功能 的理想工具。

2、研究信号传导通路的新途径
由于RNAi能高效特异地阻断基因的表达,可使其成为研究 信号传导通路的良好工具。联合利用传统的缺失突变技术和 RNAi技术可以容易地确定复杂的信号转导途径中相关基因的 上下游关系及其作用。 RNAi技术较传统的转染实验简单、快速、重复性好,克 服了转染实验中重组蛋白特异性聚集和转染效率不高的缺点, 因此认为RNAi技术将可能成为研究细胞信号传导通路的新途 径。

RNAi在医学方面的研究
1、利用RNAi建立疾病模型
传统的建立人类疾病动物模型是利用基因敲除和Cre-

LoxPsystems方法,但是如果目的基因是小鼠发育必需基因的
话,这些方法就会受到很大的限制。RNAi技术将是建立人类 疾病动物模型的新的工具,随着该技术的发展,它可以通过

使组织特异的基因功能灭活,获得疾病动物模型。
但是利用RNAi建立的疾病动物模型的性状持续时间不太 长,而且不一定能被稳定遗传,还有其他问题有待继续研究。

2、基因治疗
利用RNAi技术可以特异抑制与疾病有关的内源性或外源

性基因,而不会对个体的发育产生影响,这一特性为
RNAi技术在基因治疗上的应用开创了广阔的前景,主要 表现在:

a、 RNAi在病毒感染性疾病中的应用
b、RNAi在抗HIV中的应用 c、RNAi在肿瘤治疗中的应用

RNAi治疗恶性肿瘤
(1)沉默癌基因 (2)促进癌细胞凋亡 用RNAi特异性地抑制癌基因癌相关基因或突变基因的过度表 达,使这类基因保持在静默或休眠状态,从而有望用这种新的手 段治疗各种恶性肿瘤 。 运用RNAi抑制抗凋亡蛋白表达,可以显著提高抑凋亡蛋白表 达,从而促进细胞凋亡 。另外还可以在沉默多个抗凋亡基因的同 时表达促凋亡蛋白。

4、RNAi在整形外科领域的应用前景

已证实N-Ras或BRAF的激活型突变是引发黑素瘤的 主要病因,使用RNAi技术剔除黑素瘤细胞的BRAF表

达,不仅抑制了肿瘤细胞生长,而且减弱了其侵袭能
力,为黑素瘤基因治疗奠定了基础。

RNAi在药学方面的研究
利用RNAi进行药物研究,利用RNAi能够特异高效地抑 制基因表达,获得去基因功能表型,能够在短时间内大规 模筛选靶点,从而实现了在细胞水平和动物水平筛选药靶 和评定药靶。 RNAi在被广泛应用于功能基因组研究确定了大量潜
在的药物作用靶点的同时,也被证实其作为新一代基因 治疗药物的可能性。

RNAi在植物学方面的研究
1、植物功能基因组的研究
由于RNAi具有高度的序列专一性和有效的干扰活力,可 以特异地使某些基因沉默,从而获得功能丧失或降低突变。 因此,它可以作为研究基因组学的一种有效工具。
Lawrence等曾用拟南芥着丝点甲基化相关的dsRNA,对 拟南芥的四倍体进行RNA干扰,发现拟南芥的四倍体中对应 的与甲基化有关的mRNA含量水平剧减。这些都可以证明 RNAi技术是多倍体植物功能缺失突变很好的工具。

2、植物生长发育及新品种培育的研究
(1)利用RNAi技术可以创造一些优良的不育材料
雄性不育是高等植物生命活动的一个常见现象,在农业上 有巨大的应用价值。Cigan等利用RNAi技术直接沉默玉米 的花粉囊基因表达的启动子MS45,从而抑制花粉囊的形成, 形成玉米的雄性不育株。 (2)利用RNAi技术可以使经济作物的作用成分含量增加或 降低,可以提高作物的经济价值和利用效率。 张银波等利用RT-PCT技术克隆了油菜PEP基因片段并构建了 对应于PEPASE基因的RNAi载体,以利用RNAi技术抑制 PEPASE基因的表达,使代谢流偏向油脂合成,从而提高油 菜籽粒中的油脂含量。

(3)RNAi技术可针对植物的一些表型进行改良,技丰富 了植物的品种,尤其是对花卉品质的改良。 澳大利亚和日本的研究者使用RNAi技术沉默玫瑰中DRF 基因,培育出了世界上唯一的蓝玫瑰

日本生物研究所使用RNAi技术诱导花色和类黄酮生物合 成的关键酶查尔酮合成酶(CHS)基因沉默,成功地将花由原 来的蓝色变为白色和粉色,创造了新的商品花卉。

RNAi发展展望
未发现RNAi之前,曾利用反义RNA与靶mRNA序列互补的 特性来抑制其表型的发生,但由于反义RNA对内源性表达的 基因抑制作用较弱,往往会产生一些过渡表型,易造成对基 因功能判断错误,RNAi技术与之相比,特异性更高,作用更 迅速,副反应小,在有效地沉默靶基因的同时,对细胞本身 的调控系统也没有影响。 RNAi技术的应用,不仅能大大推动人类后基因组计划(蛋 白组学)的发展,还有可能设计出RNAi芯片,高通量地筛选 药物靶基因,逐条检测人类基因组的表达抑制情况来明确基 因的功能,并且它还将应用于基因治疗、新药开发、生物医

学研究等领域,用RNAi技术来抑制基因的异常表达,为治疗
癌症、遗传病等疾病开辟了新的途径。


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