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RNA干扰技术分析_图文

RNA干扰技术

什么是RNA干扰
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RNA干扰(RNA interference,RNAi),又称
转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing,PTGS),是指将特异性 同源双链RNA(dsRNA)导入到细胞内,使 目的基因的不表达或表达水平下降.

目前应用的基因干扰技术
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DNA水平的基因干扰技术 基因敲除技术 寡核苷酸与双链DNA 杂交 采用多胺等小分子识别并阻遏特定转录因子 mRNA水平的基因干扰技术 用反义RNA 技术阻遏翻译过程, 破坏内源性 mRNA 设计寡核苷酸来破坏与mRNA 结合的蛋白质, 使 mRNA 不稳定 双链RNA 干扰技术(RNAi)

RNAi的发现和发展历程
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1984 年,Jonathan 研究小鼠L 细胞时发现 反义mRNA 会干扰同源基因的表达,机制 不清 1990年 Jorgensen等 矮牵牛颜色加深实 验 “共抑制(co-suppresion)” 1995年 Su Guo 和Ken Emphues 反义 RNA阻断秀丽小杆线虫par-1基因的表达 实 验 ,首次发现 RNA干扰现象

1998年 Andrew Fire和Craig Mello 发现单 链RNA抑制作用较弱,而纯化的dsRNA可高 效、特异地抑制基因的表达 Nature1998; 391: 806-11 , 正式提出 RNA干扰的概念 ? 2002 年 Novina 等用RNAi 技术实现了 对HIV-1 病毒的阻抑 ? 2004年 Morris 等用RNAi技术实现了对 人细胞基因的抑制 Science 2004(August 27);305:12891292

RNAi的主要特点和优势
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诱导转录后水平的基因沉默 具有高度的特异性 抑制基因表达的高效性可在不同细胞之间 传递甚至传到子代中去 “基因沉默系统化”

RNAi的主要过程
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启动阶段 dsRNA (500nt左右最佳)被Dicer 酶特异 性识别,以一种ATP依赖的方式逐步切割 成siRNA 长度:21-25nt 结构:3ˊ端悬垂两个未配对的碱基UU

细胞中内源性dsRNA的形成
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基因组中DNA 反向重复序列的转录产物 同时转录反义和正义RNA 病毒RNA 复制中间体 以单链RNA 为模板由细胞或病毒的RNA 依 赖RNA 聚合酶(RdRp) 催化合成dsRNA

Dicer酶
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RNAase III超家族成员。结构中包括一个 螺旋酶结构域,两个RNA酶Ⅲ结构域,一 个双链RNA结合位点 对单链RNA没有活性 对200~500nt的dsRNA作用效果最好,能 降解成25nt左右的siRNA 广泛存在

RdRp(RNA dependent RNA polymerase)
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使异常的RNA转变为dsRNA 参与细胞内dsRNA和siRNA的扩增 siRNA与靶mRNA 的结合可激活RdRp, 形成大量的dsRNA

RNAi的主要过程
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效应阶段 RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC) 的形成 RISC的激活:ATP依赖的解双链过程 在siRNA反义链的指导下(靶序列的识别), RISC特异性切 割、降解靶mRNA,导致基 因表达失活

RNAi技术的实验方法
siRNA的设计原则 序列大小 19-21nt ,最好以A或G开始 从mRNA的AUG开始,寻找AA二连序列,作 为潜在的RNAi靶位点 不要针对5‘和3’端非编码区(untranslated regions,UTRs)
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设计2~4个序列, BLAST 比对基因序列以确 保序列设计的特异性 优先选择 GC 含量30-50%的序列 设计适当的阴性对照序列

阴性对照序列的设计
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特异性siRNA中的碱基进行随机排列,且 行BLAST基因比对 AGCCTTAGCTTAAGTCCTAG ATTCGTGCTCAATGCAATCG 在特异性siRNA引入1~2个错配碱基 AGCCTTAGCTTAAGTCCTAG AGCCTTAGTTTAAATCCTAG

siRNA的制备方法
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体外制备方法 化学合成siRNA 体外转录获取siRNA 利用Dicer或 RNaseⅢ消化长的dsRNA成 siRNA

化学合成法制备siRNA
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优点: 纯度高 合成量不受限 能被标记 缺点:价格昂贵、合成周期长 用途:已经找到最有效的siRNA的情况下, 需要大量siRNA进行研究

体外转录法制备siRNA
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优点:简单 成本低 速度快 毒性小 稳定性 好 缺点:反应规模和量始终有一定的限制 用途:筛选siRNAs,特别是需要制备多种 siRNAs

消化法( “ siRNAs 鸡尾酒 ”)
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优点:无需检测或筛选多个siRNA序列产 生多种 siRNAs 混合体,保证有效的目的 基因沉默 缺点:有可能引发非特异的基因沉默 用途:快速而经济地研究某个基因功能缺 失的表型

siRNA的其他制备方法
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细胞内制备方法 依赖表达质粒或病毒载体在细胞内获取 siRNA 通过PCR介导的siRNA表达试剂盒获取 siRNA

siRNA载体
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依赖RNA聚合酶III 启动子(pol III) ,操纵一 段小的发夹siRNA在哺乳动物细胞中的表 达。 人源U6启动子 鼠源的U6启动子 人H1启 动子 pol III可在细胞中表达许多的小分子RNA, 通过添加一串(3~6个)U来终止转录的 需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单 链再克隆到载体中

表达载体法制备siRNA
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优点:可以进行较长期研究。载体可以在 细胞中持续抑制靶基因达数星期或更久 缺点:需要进行克隆,周期长,质粒载体 表达效率较低 用途:唯一可以用于长期基因沉寂研究的 方法

基于PCR的siRNA表达框架(SECs)
组成:RNA pol III启动子 发夹结构siRNA RNA pol III终止位点 制备:PCR ,无需克隆和测序

用SECs制备siRNA
优点: ? 可直接由PCR得到,方法简便,时间短 ? 在PCR片段两端添加酶切位点,筛选出 最 有效的siRNA可用于构建表达载体 ? 可以用来筛选特定研究体系中启动子和 siRNA的最适搭配

用表达框架制备siRNA
缺点: ? PCR产物很难转染到细胞中 ? 不能进行序列测定,PCR和DNA合成时可 能产生的误读不能被发现导致结果不理想 用途: ? 筛选siRNA序列 ? 在将siRNA克隆到载体前筛选最佳启动子

shRNA(short hairpin RNA) 文库
Nature 2004 ;428: 427 - 431 (25 March) 针对:9,610 human genes 5,563 mouse genes 构建成:28,000个shRNA表达盒(cassettes) 商品化试剂盒:Expression Arrest? (美国冷泉港实验室 Open Biosystems公司) 网上数据库中选择特定的shRNA克隆,无需再 耗时耗力进行siRNA的设计、合成和验证过程

CAM:氯霉素抗性基因 hr:同源重组位点 Barcode:每个shRNA独特的识别序列 MSCV:病毒载体骨架 PKG-Puro:哺乳动物细胞中载体稳定性的选择 Kan、oriT、RK6:逆转录病毒信号序列

siRNA 使用代价 高

shRNA 相对较低

持久性
宿主类型

最多2周
细胞系

可选择获得稳定整合的细胞
原代细胞,胚胎干细胞、细 胞系

设计
获取 应用 检测方法 研究领域

复杂的设计方法
需要合成 瞬时转染 Western杂交、表型分 析RT-PCR、芯片检测 细胞培养

完成
完成 瞬时转染、稳定转染、病毒 侵染 Western杂交、表型分析、 RT-PCR、芯片检测 细胞培养&体内研究

siRNA转染细胞
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磷酸钙共沉淀 电穿孔法 DEAE-葡聚糖和polybrene 机械法 :显微注射和基因枪 阳离子脂质体试剂

提高转染效率的方法
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纯化的siRNA 避免使用抗生素 避免RNA酶污染 较低传代数的细胞 合适的转染试剂 合适的阳性对照 荧光标记的siRNA

RNAi技术的应用
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基因组功能研究的新方法 研究信号传导通路的新途径 开展基因治疗的新策略 (抗病毒、抗肿瘤 等) 筛选药物靶点的新工具

RNAi技术抗病毒
作用 ? 阻止病毒入侵、抑制病毒的复制和转录 ? 自然界中普遍存在 在医学上的应用 ? RNA病毒:如HIV、HCV、脊髓灰质炎病 毒 ? DNA病毒:如HBV

RNAi技术阻止HIV的入侵
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Novina将针对CD4的dsRNA导入 能表达 CD4、CCR 5、CXCR4的M agi2CCR 5 细 胞系),能使细胞表面CD4 表达减少75%; 转染后60 小时后, 再用H IV 感染, 结果发现 CD4-siRNA 转染的细胞很少有包涵体出现 其它试验的受体: CCR 5、CXCR4

RNAi技术抑制HIV的复制
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将HIV-1编码rev的基因和同源的dsRNA共 转染到293细胞中,rev基因的表达被显著 抑制 siRNA抑制HIV rev-EGFP的表达,其抑制 率可达到90%;而反义RNA,核酶组与对 照组无显著差异

RNAi技术抑制HCV的复制
NS5B-6133 siRNA
+ NS3-1948 siRNA + HCV表达质粒
共转染

GAPDH siRNA +

Huh-7 细胞 HCV RNA ↓ 21倍

HCV RNA ↓ 23倍

HCV RNA 无变化

RNAi技术抑制HBV的复制
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HBV(乙肝病毒)是DNA病毒,但是其复制 过程需经过逆转录的过程。 针对HBV的S,C,X,P基因序列及DR1, DR2等调控元件序列,设计的siRNA可显 著抑制HBV的复制和蛋白表达

The end!


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