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2013-2分子生物学实验


绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达

1. 构建重组质粒( pET-28α-GFP) : 以特定的引物和模板,利用 PCR 获得 gfP 的片段 切片段 BamHⅠ.NdeⅠ酶切 回收 酶

用同样的酶切 DH5α(pET-28α)获得载体片段 获得重组质粒。

连接酶切后

回收的 gfP 片段和载体片段 2. 导入与表达:

重组质粒 转化 DH5α 酶切和 PCR 鉴定 电泳检测 BL-21(pET-28α-GFP) 诱导表达与检测

质粒(pET-28α-GFP)转化

获得绿色荧光蛋白。

1 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化(转化 DH5α) 大肠杆菌感受态细胞的制备
1.接种:挑一大肠杆菌单菌DH5α(或BL21)落放入5mL LB液体培养基,37 ℃培养 过夜。 2.转接活化大肠杆菌:取3mL新鲜的LB液体培养基加入50-150μ L的过夜菌,培养2-3 个小时,用处于对数生长期的菌液制备感受态细胞,此时OD600=0.2-0.4。(全班一起 可以用锥形瓶活化培养后分装) 3.将活化的DH5α(或BL21)培养液在无菌条件下收集在一个5mL于eppendorf管中, 冰上放置10 min,然后于4 ℃下 6000 rpm 离心5min; 4.在无菌条件下弃去上清, 转入到一个1.5mL eppendorf管中。用0.1 mol/L 的预冷 的CaCl2溶液1mL轻轻悬浮细胞,冰上放置10 min, 4℃下6000 rpm 离心5 min; 5.加入100μL预冷的0.1 mol/L的CaCl2 溶液缓和菌液,放置冰上。即成感受态细胞悬 液(可-80 ℃长期保存)。

转化 pET-28α-GFP 的连接产物(或者质粒)
1.取2个无菌离心管,分别加入100μ L DH5α 感受态细胞悬液,第1管加1μ L无菌水

(空白对照),第2管加入质粒DNA溶液1μ L,轻轻摇匀,冰上放置30 min。 2.42 ℃水浴中热激90 s,热激后迅速置于冰上冷却2min。 3.分别向管中加入300μ L LB液体培养基,混匀后在37 ℃100 r/min振荡培养45min。 4.从管1中取200μ L涂布于含抗生素的平板上(空白对照),从管2中取200μ L涂布 于含抗生素的平板上。正面向上放置约40分钟,待菌液完全被培养基吸收后 倒置培养皿,37 ℃培养20小时。 准备:无菌的eppendorf管,枪头,平板,培养基(倒平板时加抗生素kana),涂 布棒

2 挑平板培养,kana 抗性
用 5mL 玻璃管培养 DH5α 培养液 准备灭菌好的 LB 培养基(挑平板时要加抗生素 Kana) 5ml 加 15μL 10mg/mL 的卡那霉素(简称 kana) ,那么终浓度(即工作浓度是 30μ g/mL)

3 质粒 DNA 的提取分离与纯化 (碱法提取质粒)
1.将5mL DH5α培养液倒入 5mL的 eppendorf 管中, 9000 rpm离心5min。 2.弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。 3.菌体沉淀重悬浮于150μ L预冷溶液Ⅰ中(需剧烈振荡混合均匀),冰浴放置3 min。 4.加入新配制的溶液Ⅱ300μ L, 盖紧管口,快速温和颠倒eppendorf管5次,以混匀内 容物(千万不要振荡),冰浴3 min。 5.加入250μ L预冷的溶液Ⅲ,盖紧管口,并倒置离心管,温和振荡3次,使沉淀混匀, 冰浴中3 min,12000 rpm离心5min。 6.取上清液500μ L移入干净eppendorf 管中,加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24: 1) 500μ L,缓和15 s, 12000 rpm离心5 min。 7.将水相移入干净eppendorf 管中,加入2倍体积的无水乙醇,振荡混匀后,置于冰上 10 min(或者放入冰箱冷冻层),然后12000 rpm离心10 min。 8 .弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入500 μ L 70%乙醇洗沉 淀一次, 振荡混匀后,10000 rpm离心2 min。

1

9.吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,室温干燥得质粒。加灭菌水20μL溶 解质粒备用。

4质粒的限制性内切酶反应分析(酶切)
1.按下表加入其混合液
反应物(μ L) 质粒 pET-28α-GFP 5 0.3 0.3 1 3.4

Xho I XbaI
10×buffer ddH2O

2.离心 5 s,混匀。 3.37 ℃水浴酶切 3-4 h。 4.配制 1.0%(M/V)普通琼脂糖凝胶 15mL。 5. 适当放置冷却,45 ℃左右,加入2.5微升的Gelview核酸染料,混匀,倒于电泳 胶板上,插好梳子。 6.待凝胶凝固好以后,拨下梳子。 7.酶切样品中加入1?L溴酚蓝-GeneFinder混合液混匀,上样。 8.1×TAE Buffer,80V(3-4 V/cm)下电泳30 min。 9.荧光激发器观察质粒DNA条带(核酸染料gelview染色)的酶切情况,并照像。

2

5、质粒PCR检测
PCR反应体系 反应物 Ddw P上 P下 模板 4×dNTP Buffer Taq polymerse 2.离心 5 s,混匀。 3.放置于 PCR 仪中。设置合适的 PCR 程序: 94℃ 3min 94℃ 30s 58℃ 30s 72℃ 45s 72℃ 10℃ 4.配制 1.0%(M/V)普通琼脂糖凝胶 15mL。 5.适当放置冷却,45 ℃左右,加入2.5微升的Gelview核酸染料,混匀,倒于电泳胶 板上,插好梳子。 6.待凝胶凝固好以后,拨下梳子。 7.PCR样品中加入1?L溴酚蓝-GeneFinder混合液混匀,上样。 8.1×TAE Buffer,80V(3-4 V/cm)下电泳30 min。 9.荧光激发器观察质粒DNA条带(核酸染料gelview染色)的PCR情况,并照像。 2min 30cycles (μ L) 14.2 1 1 0.5 1 2 0.3

6 质粒 DNA 的琼脂糖凝胶电泳(DNA、酶切和 PCR 电泳分析)
1%琼脂糖凝胶的配制

3

1.加 50 ml 1×TAE 缓冲液于三角瓶中, 2.精确称取 0.4 g 琼脂糖加到三角瓶中,于微波炉中加热至完全熔化, 3.冷却至 60 ℃左右, 4.轻缓倒入封好两端和加上梳子的电泳胶板中,静置冷却 30 分钟以上, 5.将胶板除去封胶带, 放入电泳缓冲液 (TBE) 使电泳缓冲液刚好没过凝胶约 1 mm, 中, 轻轻拔除梳子, 6.取 5μ l 质粒 DNA 及 1μ L GeneFinder 混匀上样 7.50-100v 约电泳 0.5-1 小时 8.蓝盾可见光透射仪观察结果.

7 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化(BL21)
BL21 DE3 整合以后用于以 T7RNA 聚合酶为表达系统的高效外源基因的蛋白表达宿主。 将噬菌体的一部分区域整合与 BL21 的染色体上

1.取2个无菌离心管,分别加入100μ L BL21感受态细胞悬液,第1管加1 μ L无菌水, 第2管加入质粒DNA溶液1μ L,轻轻摇匀,冰上放置30 min。 2.42 ℃水浴中热激70 s,热激后迅速置于冰上冷却2min。 3.分别向管中加入300μ L LB液体培养基,混匀后在37 ℃100 r/min振荡培养1 h。 4.从管1中取100μ L涂布于含抗生素的平板上,从管2中取100μ L涂布于含抗生素 的平板上。正面向上放置约40分钟,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养 皿,37 ℃培养20小时。

8 GFP 蛋白的诱导表达
1.取1支无菌带盖试管,加入新鲜LB液体培养基5mL,加Kan+15μ L。用枪头在无菌条件 下取适量菌垂直丢入试管中,37 ℃培养20小时。 2.取1支无菌带盖试管, 加入新鲜LB液体培养基4mL (含有Kan+),加入80μ L菌

液(1:50),37 ℃培养至生长期,约2-3小时。 3.加入IPTG(1:1000)至终浓度1mmol/L即4μ L,诱导4 h。
4

4.分别取1.5mL,10000 rpm离心5 min,去除上清,收集沉淀,再重复一次收集沉淀。 5.分别取IPTG诱导培养液20μ L涂布在含Kan+的固体培养基上,37 ℃培养20小时。 6.观察蛋白表达 用紫外线照射菌体沉淀及培养平板,可以看到绿色荧光。分别对均匀涂布的平 板以及表达蛋白的样品管照相,保存照片。

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