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RT-PCR实验方法


逆转录 PCR (RT-PCR)

实验四逆转录 PCR (RT-PCR)【实验目的】1.了解用逆转录 PCR 法获取目的基因的原理。2.学习和掌握 逆转录 PCR 的技术和方法。【实验原理】聚合酶链式反应(PCR)过程利用模板变性,引物退火和引物延 伸的多个循环来扩增 DNA 序列。因为上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板,是一个指数增 实验四 逆转录 PCR (RT-PCR) 【实验目的】

1.了解用逆转录 PCR 法获取目的基因的原理。 2.学习和掌握逆转录 PCR 的技术和方法。
【实验原理】

聚合酶链式反应(PCR)过程利用模板变性,引物退火和引物延伸的多个循环来扩增 DNA 序列。因为上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板,是一个指数增长的过程,使其成为 检测核酸和克隆基因的一种非常灵敏的技术。一般经 25-35 轮循环就可使模板 DNA 扩增达 106 倍。 RT-PCR 将以 RNA 为模板的 cDNA (complement DNA) (即 RNA 的反转录 合成 (RT, reversetranscription)),同 cDNA 的 PCR 结合在一起的技术,提供了一种基因表达检测、 定量和 cDNA 克隆的快速灵敏的方法。 由于 cDNA 包括了编码蛋白的完整序列而且不含内含 子,只要略经改造便可直接用于基因工程表达和功能研究,因此 RT-PCR 成为目前获得目的 基因的一种重要手段。 RT-PCR 技术灵敏而且用途广泛,可用于检测细胞中基因表达水平、表达差异,细胞中 RNA 病毒的含量和直接克隆特定基因的 cDNA 序列。RT-PCR 比其他包括 Northern 印迹、RNase 保护分析、原位杂交及 S1 核酸酶分析在内的 RNA 分析技术,更灵敏,更易于操作。 RT-PCR 的基本原理(图 4.1)。首先是在逆转录酶的作用下从 RNA 合成 cDNA,即总 RNA 中的 mRNA 在体外被反向转录合成 DNA 拷贝,因拷贝 DNA 的核苷酸序列完全互补于模板 mRNA,称之为互补 DNA(cDNA);然后再利用 DNA 聚合酶,以 cDNA 第一链为模板,以 四种脱氧核苷三磷酸(dNTP)为材料,在引物的引导下复制出大量的 cDNA 或目的片段。 在 RT 时,有 3 种引物可选择 (表 4.1) 。用 1)和 2)方法,理论上是扩增的所有的 cDNA, 还要用此产物做 PCR 的模板继续扩增。 如果用 3) 方法, 先要去 http://www.ncbi.nlm.nih.gov 查它的序列,并用 oligo 等软件设计引物。

RT-PCR 可以一步法或两步法的形式进行。两步法 RT-PCR 比较常见,在使用一个样品检测 或克隆多个基因的 mRNA 时比较有用。在两步法 RT-PCR 中,每一步都在最佳条件下进行。

cDNA 的合成首先在逆转录缓冲液中进行,然后取出 1/10 的反应产物进行 PCR。而一步法 RT-PCR 具有其它优点(表 4.2),cDNA 合成和扩增反应在同一管中进行,不需要打开管盖 和转移,有助于减少污染。还可以得到更高的灵敏度,最低可以达到 0.1pg 总 RNA,因为 整个 cDNA 样品都被扩增。 对于成功的一步法 RT-PCR, 一般使用基因特异性引物(GSP)起始 cDNA 的合成。

由图 4.1 不难看出,随机引物法是三种方法中特异性最低的。引物在整个转录本的多个位点 退火,产生短的,部分长度的 cDNA。这种方法经常用于获取 5"末端序列及从带有二级结构 区域或带有逆转录酶不能复制的终止位点的 RNA 模板获得 cDNA。为了获得最长的 cDNA, 需要按经验确定每个 RNA 样品中引物与 RNA 的比例。随机引物的起始浓度范围为 50 到 250ng 每 20?l 反应体系。因为使用随机引物从总 RNA 合成的 cDNA 主要是核糖体 RNA,所 以模板一般选用 poly(A)+RNA。

Oligo(dT)起始比随机引物特异性高。 它同大多数真核细胞 mRNA 3"端所发现的 poly(A)尾杂 交。因为 poly(A)+RNA 大概占总 RNA 的 1%到 2%,所以与使用随机引物相比,cDNA 的数 量和复杂度要少得多。因为其较高的特异性,oligo(dT)一般不需要对 RNA 和引物的比例及 poly(A)+选择进行优化。建议每 20?l 反应体系使用 0.5?g oligo(dT)。oligo(dT)12-18 适用 于多数 RT-PCR。 基因特异性引物(GSP)对于逆转录步骤是特异性最好的引物。GSP 是反义寡聚核苷,可以 特异性地同 RNA 目的序列杂交, 而不象随机引物或 oligo(dT)那样同所有 RNA 退火。 用于设 计 PCR 引物的规则同样适用于逆转录反应 GSP 的设计。 GSP 可以同与 mRNA 3"最末端退火 的扩增引物序列相同,或 GSP 可以设计为与反向扩增引物的下游退火。 已经制备好的双链 cDNA 和一般 DNA 一样,可以插入到质粒或噬菌体中,为此,首先必需

有适当的接头(Linker),接头可以是在 PCR 引物上增加限制性内切酶识别位点片段,经 PCR 扩增后再克隆入相应的载体; 也可以利用末端转移酶在载体和双链 cDNA 的末端接上一段寡 聚 dG 和 dC 或 dT 和 dA 尾巴,退火后形成重组质粒,并转化到宿主菌中进行扩增。 本实验是要从小鼠肝脏组织中获取 Fas 配体基因,Fas 配体(FasL)是一分子量约为 40u 的 II 型跨膜糖蛋白,属 TNF 家族成员。活化的 T 细胞可表达 Fas 和 FasL,并通过 Fas/FasL 系统 介导细胞凋亡作用,保持机体免疫系统的自稳态。近年研究发现在部分癌细胞中 FasL 表达 增强,并与肿瘤的复发转移有关。我们采用 RT-PCR 方法克隆 FasL 全长 cDNA 并构建其表 达载体,可以为进一步研究 FasL 的功能提供条件。在上下游引物的 5’端分别加上了限制酶 切位点及其保护碱基(即 Hind III 和 BamH I),以便可以通过双酶切将目的片段定向的克 隆到原核表达载体 pGFPUv 上(附录图 4.3)。 为了便于后续实验可以用金属螯和层析的方法分离和纯化目的蛋白,我们改造了 pGFPUv, 在其上加了 6×His 标签。
【试剂与器材】

(一)试剂 1.总 RNA(或 mRNA) 2.RNA 酶抑制蛋白(RNase Inhibitor) :40 U/mL 3.dNTP 混合物 (各 10 mM) 4.oligo(dT)12-18:2.5 ?mol/L 5.10*逆转录合成缓冲液(10?RT buffer):250 mmol/L Tris-HCl (pH8.3),375 mmol/L KCl, 15 mmol/L MgCl2 6.AMV 逆转录酶 5u/?L 7.基因特异性 5’和 3’引物各 20 ?mol/L 8.Tap DNA 聚合酶 5u/?L 9.10*PCR 缓冲液:500mmol/L KCl,100mmol/L Tris?Cl,在 25℃下,pH9.0,1.0% Triton X-100,15mmol/L MgCl2。

(二)器材 1)PCR 仪, 2)PCR 管, 3)微量移液器
【操作方法】

(一)逆转录: 1)建立 RT 反应体系:

2)涡旋混匀,42℃反应 1 小时,95℃加热 5 分钟,然后置于冰上。

(二)PCR 扩增: 1)建立 PCR 反应体系:

2)将上述反应体系涡旋混匀, 按下列程序运行循环:

step2-4 运行 30 个循环,其中复性温度主要依据引物的不同而不同。 (三)取 10-20uL PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,余下的 PCR 产物-20℃保存。
【注意事项与提示】

1.逆转录反应过程,需建立无 RNAase 环境,以避免 RNA 的降解。 2.成功的逆转录反应决定于高质量的模板 RNA。高质量的 RNA 至少应保证全长并且不含逆 转录酶的抑制剂,如 EDTA 或 SDS。此外,RT-PCR 所遇到的一个潜在的困难是 RNA 中沾染 的基因组 DNA。使用较好的 RNA 分离方法,如 Trizol Reagent,会减少 RNA 制备物中沾染

的基因组 DNA。 因此在进行 PCR 反应时应该对每个 RNA 模板进行一个无逆转录的对照反应, 以确定扩增出来的片段是来自基因组 DNA 还是 cDNA。在无逆转录时所得到的 PCR 产物来 源于基因组。 3.RT-PCR 的起始模板可是总 RNA 或 mRNA,都可以检测到扩增结果(如下图)。另外,分 离 mRNA 会导致样品间 mRNA 丰度的波动变化, 从而使信息的检出和定量产生偏差。 然而, 当分析稀有基因时,使用 mRNA 会增加检测的灵敏度。 4.在逆转录反应中经常加入 RNA 酶抑制蛋白以增加 cDNA 合成的长度和产量。RNA 酶抑制 蛋白要在第一链合成反应中,在缓冲液和还原剂(如 DTT)存在的条件下加入,因为 cDNA 合成前的过程会使抑制剂变性,从而释放结合的可以降解 RNA 的 RNase。RNA 酶抑制蛋白 仅防止 RNase A,B,C 对 RNA 的降解,并不能防止皮肤上的 RNase,因此尽管使用了这些 抑制剂,也要小心试验者的手上 Rnase 对样品的污染。 5.较高的保温温度有助于 RNA 二级结构的打开,增加了反应的产量。对于多数 RNA 模板, 在没有缓冲液或盐的条件下,将 RNA 和引物在 65℃保温,然后迅速置于冰上冷却,可以消 除大多数二级结构,从而使引物可以结合。然而某些模板仍然会存在二级结构,即使热变性 后也是如此。对这些困难模板的扩增可以使用经过改良的耐高温逆转录酶, 如:Invitrogen 公司的 ThermoScript 逆转录酶,使逆转录反应置于较高温度下进行以改善扩增。而且适当 提高逆转录保温温度,可增加 RT-PCR 的特异性。 6.建立反应体系时,加完其它反应物后,才加模板 DNA 和 Taq DNA 聚合酶;然后将全部反 应物涡旋混匀;上 PCR 仪前加矿物油封盖或设热盖。 7.PCR 反应的循环数一般 25-30 次就足够了, 过多的循环数会造成非特异性扩增和时间的浪 费。复性温度的计算,一般是在引物的 Tm 值上下浮动,Tm =2(A+T)+4(G+C)。适 当提高复性温度可提高 PCR 扩增的特异性。 8.不管是反转录反应还是 PCR 反应都应先调制试剂的 Master Mix (包括 RNase Free dH2O、 缓冲液、dNTP Mixture 等),然后分装到每个反应管中。这样可使所取的试剂的体积更准确, 减少试剂的损失,避免重复分取同一试剂,同时也可以减少实验操作造成的误差。而且分装 试剂时务必用新 Tip,以防止样品间的污染。 9.AMV、RNase Inhibitor、Taq 等酶类,要轻轻地混匀,避免起泡。分取之前要轻轻地离心 收集到反应管底部,因其粘度高,所以要慢慢地分取。 酶类务必在实验前从-20℃取出,使 用后立即放回-20℃保存。 10.最佳的 PCR 条件,因 PCR 扩增仪的不同而不同,所以在使用您的样品之前最好先做 Control 反应, 以确定最佳的 PCR 条件。 为延长 PCR 仪的使用寿命, 应尽可能缩短 PCR 仪 4℃ 保存的时间,尽量避免 4℃过夜的情况。

Lane 1:总 RNA 的 RT-PCR 产物(人细胞调亡因子 TF15 基因) Lane 2: mRNA 的 RT-PCR 产物,人细胞调亡因子 TF15 基因 Lane 3: 100bp marker
【实验安排】

1.第一天:试剂的配制和所用一次性塑料制品和玻璃器皿的去 RNase 处理(0.1%DEPC 浸 泡或高温干烤)。 2.第二天:进行(一)逆转录和(二)PCR 扩增。 3.第三天:进行(三)琼脂糖凝胶电泳检测。 4.为了保证实验质量,最好能将总 RNA 提取、mRNA 的分离纯化、RT-PCR 和 cDNA 文库 构建实验安排在连续的时间内进行。
【实验报告要求与思考题】

1.RT-PCR 产物琼脂糖凝胶电泳结果; 2.如何提高 RT-PCR 的灵敏度和特异性?


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