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RNA干扰技术原理及应用


RNAi的发现 的发现
1995年 等试图阻断秀丽新小杆线虫( 1995年,Guo S等试图阻断秀丽新小杆线虫(C. elegans)中的par 基因的表达。 parelegans)中的par-1基因的表达。 设计: 设计: 反义RNA 特异性地阻断par 基因的表达; par反义RNA 特异性地阻断par-1基因的表达; 正义RNA 以期观察到基因表达的增强。 正义RNA 以期观察到基因表达的增强。 结果: 结果: 二者都同样地切断了par par二者都同样地切断了 par-1 基因的表达途 这是与传统上对反义RNA RNA技术的解释不相 径 。 这是与传统上对反义 RNA 技术的解释不相 符合。 符合。该研究小组一直没能给这个意外以合理 解释。 解释。

RNAi的提出 的提出
直到1998年2月,Fire A和Mello C才首次揭开这个悬 年 月 直到 和 才首次揭开这个悬 疑之谜。 疑之谜。 他们将体外转录得到的单链 单链RNA纯化后注射线虫时 纯化后注射线虫时 他们将体外转录得到的单链 纯化后 发现,基因抑制效应变得十分微弱;而经过纯化的 发现 , 基因抑制效应变得十分微弱 ; 而经过 纯化的 双链RNA却正好相反, 能够高效特异性阻断相应基 却正好相反, 双链 却正好相反 因的表达。 因的表达。 他们证实, 博士遇到的正义RNA抑制基因表 他们证实 , Guo S博士遇到的正义 博士遇到的正义 抑制基因表 达的现象,以及过去的反义RNA技术对基因表达的 达的现象 , 以及过去的反义 技术对基因表达的 阻断,都是由于体外转录所得RNA中污染了微量双 阻断 , 都是由于体外转录所得 中 而引起。 链RNA而引起。 而引起 该 小 组 将 这 一 现 象 称 为 RNA 干 扰 ( RNA interference, 简称 , 简称RNAi)。 )

RNAi广泛存在于自然界 广泛存在于自然界
随后, 现象被广泛地发现于真菌、 随后,RNAi现象被广泛地发现于真菌、拟南 现象被广泛地发现于真菌 水螅、涡虫、锥虫、 芥、水螅、涡虫、锥虫、斑马鱼等大多数真核 生物中。 生物中。 这种存在揭示了RNAi很可能是出现于生命进 这种存在揭示了 很可能是出现于生命进 化的早期阶段。 化的早期阶段。 随着研究的不断深入, 随着研究的不断深入,RNAi的机制正在被逐 的机制正在被逐 步阐明, 步阐明,而同时作为功能基因组研究领域中的 有力工具, 也越来越为人们所重视。 有力工具,RNAi也越来越为人们所重视。 也越来越为人们所重视

1、RNAi 机制

体外实验结果的提示
体外实验表明: 反应中, 体外实验表明 : RNAi反应中 , 加入的 反应中 加入的dsRNA被切割 被切割 核苷酸长的RNA片段 , 后者会使目的 片段, 为 21-23核苷酸长的 核苷酸长的 片段 后者会使目的mRNA 被切割为21-23核苷酸长的片段。 核苷酸长的片段。 被切割为 核苷酸长的片段 从已经发生RNAi的果蝇 细胞中,Hammond等人部 的果蝇S2细胞中 从已经发生 的果蝇 细胞中, 等人部 分纯化了一种核酸酶,该核酸酶具有序列特异性, 分纯化了一种核酸酶 , 该核酸酶具有序列特异性 , 它 仅降解与引起RNAi的 dsRNA具有同源序列的 具有同源序列的mRNA。 仅降解与引起 的 具有同源序列的 。 那么这种核酸酶是如何确定哪些mRNA该降解而哪些 那么这种核酸酶是如何确定哪些 该降解而哪些 不该呢? 不该呢? 由于在纯化该核酸酶时,可以共分离出21-23核苷酸长 由于在纯化该核酸酶时,可以共分离出 核苷酸长 片段, 的dsRNA片段,这暗示该核酸酶对 片段 这暗示该核酸酶对mRNA的切割有可 的切割有可 能是以这些片段作模板指导进行的。 能是以这些片段作模板指导进行的 。 根据以上的实验 结果,人们提出一种RNAi作用的简单模型。 作用的简单模型。 结果,人们提出一种 作用的简单模型

RNAi作用的简单模型 作用的简单模型
导入细胞后, 当 dsRNA导入细胞后 , 被一种 导入细胞后 被一种dsRNA特异的核酸内 特异的核酸内 切酶识别, 切割成21-23核苷酸长的小片段 , 这些片 核苷酸长的小片段, 切酶识别 , 切割成 核苷酸长的小片段 段可与该核酸酶的dsRNA结合结构域结合,并且作为 结合结构域结合, 段可与该核酸酶的 结合结构域结合 模板识别目的mRNA。 模板识别目的 。 识别之后, 的有义链发生链互换, 识别之后,mRNA与dsRNA的有义链发生链互换,原 与 的有义链发生链互换 中的有义链被mRNA代替, 从酶 代替, 先 dsRNA中的有义链被 中的有义链被 代替 从酶-dsRNA复 复 合物中释放出来, 合物中释放出来,而mRNA则处于原先的有义链的位 则处于原先的有义链的位 置。 核酸酶在同样位置对mRNA进行切割,这样又产生了 进行切割, 核酸酶在同样位置对 进行切割 21-23核苷酸长的 核苷酸长的dsRNA小片段 , 与核酸酶形成复合 小片段, 核苷酸长的 小片段 继续对目的mRNA进行切割,从而使目的基因沉 进行切割, 物,继续对目的 进行切割 产生RNAi现象。 现象。 默,产生 现象 通过遗传分析的方法,目前已从线虫中已分离到 RDE-2,RDE-3和Mut-7等RNAi相关的基因。 相关的基因。 和 等 相关的基因

RNAi研究的一般技术路线 研究的一般技术路线

2、siRNA 的设计

何为siRNAs 何为siRNAs
越来越多的研究人员开始采用小分子干扰RNA 越来越多的研究人员开始采用小分子干扰 ( small interfering RNAs, siRNAs) 来抑 , ) 制特定的哺乳动物基因表达。 制特定的哺乳动物基因表达。 siRNA即为能够以同源互补序列的 即为能够以同源互补序列的mRNA为靶 即为能够以同源互补序列的 为靶 目标并将其降解而介导RNA干扰途径的短片断 目标并将其降解而介导 干扰途径的短片断 双链RNA分子。 分子。 双链 分子 如何设计有效的siRNA一直是当前 一直是当前RNAi研究 如何设计有效的 一直是当前 研究 的热点话题,不同的实验室有不同的结果。 的热点话题,不同的实验室有不同的结果。

一般设计原则
(1)从mRNA 的AUG起始密码开始,寻找“AA”二连序 ) 起始密码开始,寻找“ 二连序 起始密码开始 并记下其3'端的 个碱基序列,作为潜在的siRNA 端的19个碱基序列 列 , 并记下其 端的 个碱基序列, 作为潜在的 靶位点。 有研究结果显示GC含量在 含量在30%—50%左右的 靶位点 。 有研究结果显示 含量在 左右的 siRNA要比那些 含量偏高的更为有效。 要比那些GC含量偏高的更为有效 含量偏高的更为有效。 要比那些 Tuschl 等 建 议 不 要 针 对 5' 和 3' 端 的 非 编 码 区 regions, UTRs) ( untranslated regions , UTRs ) 。 这些地方有丰富 的调控蛋白结合区域,而这些UTR结合蛋白或者翻译起 的调控蛋白结合区域,而这些 结合蛋白或者翻译起 始 复 合 物 可 能 会 影 响 siRNP 核 酸 内 切 酶 复 合 物 结 合 mRNA从而影响 从而影响siRNA的效果。 的效果。 从而影响 的效果 ( 2) 将潜在的序列和相应的基因组数据库 ( 人 , 或者小 ) 将潜在的序列和相应的基因组数据库( 大鼠等等) 进行比较, 鼠 , 大鼠等等 ) 进行比较 , 排除那些和其他编码序列 /EST同源的序列。例如使用 同源的序列。 同源的序列 例如使用BLAST ( 3) 选出合适的目标序列进行合成 。 通常一个基因需要 ) 选出合适的目标序列进行合成。 设计多个靶序列的siRNA,以找到最有效的 序列。 设计多个靶序列的 ,以找到最有效的siRNA序列。 序列

负对照
一个完整的siRNA实验应该有负对照。 实验应该有负对照。 一个完整的 实验应该有负对照 作 为 负 对 照 的 siRNA 应 该 和 选 中 的 siRNA 序 列 有 相 同 的 组 成 , 但 是 和 mRNA没有明显的同源性。 没有明显的同源性。 没有明显的同源性 通常的做法是将选中的siRNA序列打乱 , 序列打乱, 通常的做法是将选中的 序列打乱 同样要检查结果以保证它和其他基因没 有同源性。 有同源性。

3、制备siRNAs的方 制备siRNAs的方 法

(1)化学合成 )
尽管化学合成是最贵的方法,但是却是最方便的—— 尽管化学合成是最贵的方法 , 但是却是最方便的 研究人员几乎不需要做什么工作。 研究人员几乎不需要做什么工作 。 许多公司都可以根 据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。 据用户要求提供高质量的化学合成 。 主要的缺点包括价格高,定制周期长, 主要的缺点包括价格高 , 定制周期长 , 特别是有特殊 需求的。 需求的。 由 于 价 格 比 其 他 方 法 高 , 为 一 个 基 因 合 成 3—4 对 siRNAs 的成本就更高了 , 比较常见的做法是用其他 的成本就更高了, 方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。 方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。 最适用于:已经找到最有效的siRNA的情况下,需要 的情况下, 最适用于:已经找到最有效的 的情况下 大量siRNA进行研究; 进行研究; 大量 进行研究 不适用于:筛选siRNA等长时间的研究,主要原因是 等长时间的研究, 不适用于:筛选 等长时间的研究 价格因素

(2)体外转录 )
相对化学合成法而言成本比较低, 相对化学合成法而言成本比较低,是一种性价比高的 筛选siRNAs的好方法。 的好方法。 筛选 的好方法 更重要的是能够更快的得到siRNAs。 更重要的是能够更快的得到 。 值得一提的是体外转录得到的siRNAs只要较低的浓 值得一提的是体外转录得到的 只要较低的浓 度就可以达到化学合成siRNAs较高浓度得到的效果 。 较高浓度得到的效果。 度就可以达到化学合成 较高浓度得到的效果 不足之处:实验的规模受到限制, 不足之处:实验的规模受到限制,虽然一次体外转录 合成能提供足够做数百次转染的siRNAs, 但是反应 合成能提供足够做数百次转染的 , 规模和量始终有一定的限制。 规模和量始终有一定的限制。 最 适 用 于 : 筛 选 siRNAs , 特 别 是 需 要 制 备 多 种 siRNAs,化学合成的价格成为障碍时。 ,化学合成的价格成为障碍时。 不适用于:实验需要大量的,一个特定的siRNA。长 不适用于 :实验需要大量的,一个特定的 。 期研究。 期研究。

Figure. Use of Chemically Synthesized and in Vitro Transcribed siRNAs targeting ?-Actin to Induce Gene Silencing.

( 3) 用 RNase III 消化长片断双链 ) RNA制备 制备siRNA 制备
其他制备siRNA的方法的缺陷是需要设计和检验多个 的方法的缺陷是需要设计和检验多个 其他制备 siRNA序列以便找到一个有效的 序列以便找到一个有效的siRNA。 序列以便找到一个有效的 。 这种方法——制备一份混合有各种 制备一份混合有各种siRNAs “混合鸡 这种方法 制备一份混合有各种 混合鸡 尾酒” 就可以避免这个缺陷。 尾酒” 就可以避免这个缺陷。 这个方法是选择通常是200—1000碱基的靶 碱基的靶mRNA模 这个方法是选择通常是 碱基的靶 模 用体外转录的方法制备长片断双链dsRNA ,然 版,用体外转录的方法制备长片断双链 后用RNase III (or Dicer) 在体外消化 , 得到一众 在体外消化, 后用 siRNAs“混合鸡尾酒”。 混合鸡尾酒” 混合鸡尾酒 在除掉没有被消化的dsRNA后 , 这个 在除掉没有被消化的 后 这个siRNA混合物 混合物 就可以直接转染细胞,方法和单一的siRNA转染一样。 转染一样。 就可以直接转染细胞,方法和单一的 转染一样 由于siRNA混合物中有许多不同的 混合物中有许多不同的siRNAs, 通常能 由于 混合物中有许多不同的 , 够保证目的基因被有效地抑制。 够保证目的基因被有效地抑制。

(3)用RNase III 消化长片断双链 ) RNA制备 制备siRNA 制备
dsRNA消化法的主要优点在于可以跳过检测和筛选有 消化法的主要优点在于可以跳过检测和筛选有 效 siRNA 序列的步骤 , 为研究人员节省时间和金钱 注意:通常用RNAse III比用 比用Dicer要便宜)。 要便宜) (注意:通常用 比用 要便宜 不过这种方法的缺点也很明显, 不过这种方法的缺点也很明显 , 就是有可能引发非特 异的基因沉默,特别是同源或者是密切相关的基因。 异的基因沉默,特别是同源或者是密切相关的基因。 现在多数的研究显示这种情况通常不会造成影响(1-4)。 现在多数的研究显示这种情况通常不会造成影响 。 最适用于:快速而经济地研究某个基因功能缺失的表 最适用于: 型 不适用于:长时间的研究项目, 不适用于 : 长时间的研究项目 , 或者是需要一个特定 进行研究, 的siRNA进行研究,特别是基因治疗 进行研究

Ku-70 levels were reduced 86% in cells transfected with the siRNA cocktail, compared to non-transfected controls.

(4)siRNA表达载体 ) 表达载体
多数的siRNA表达载体依赖 种RNA聚合酶 启动子 表达载体依赖3种 聚合酶III 多数的 表达载体依赖 聚合酶 启动子(pol III)中 中 的一种,操纵一段小的发夹siRNA在哺乳动物细胞中的表达。 在哺乳动物细胞中的表达。 的一种 , 操纵一段小的发夹 在哺乳动物细胞中的表达 包括的人源和鼠源的U6启动子和人 启动子。 启动子和人H1启动子 包括的人源和鼠源的 启动子和人 启动子。 之所以采用RNA pol III启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中 之所以采用 启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中 表达更多的小分子RNA,而且它是通过添加一串 ( 3到6个) U 表达更多的小分子 , 而且它是通过添加一串( 到 个 来终止转录的。 来终止转录的。 使用这类载体,需要2段编码短发夹 段编码短发夹RNA序列的 序列的DNA单链, 退 单链, 使用这类载体 , 需要 段编码短发夹 序列的 单链 克隆到相应载体的pol III 启动子下游。 启动子下游。 火,克隆到相应载体的 由于涉及到克隆, 由于涉及到克隆,这个过程需 要几天的时间, 要几天的时间,同时也需要经 过测序以保证克隆的序列是正 确的。 确的。 不过幸好载体容易大量扩增, 不过幸好载体容易大量扩增, 这个优点足以弥补所有缺陷, 这个优点足以弥补所有缺陷, 特别是当载体在实验中确实有 效的时候。 效的时候。

(4)siRNA表达载体 ) 表达载体
毫无疑问, 毫无疑问,siRNA表达载体的优点在于这是众多方法中唯一可以 表达载体的优点在于这是众多方法中唯一可以 进行长期研究的方法——带有抗生素标记的载体可以在细胞中持 进行长期研究的方法 带有抗生素标记的载体可以在细胞中持 长期研究的方法 续抑制靶基因的表达,持续数星期甚至更久。 续抑制靶基因的表达,持续数星期甚至更久。 即使是对转染带有筛选标记质粒的细胞进行瞬时筛选 瞬时筛选, 即使是对转染带有筛选标记质粒的细胞进行瞬时筛选,也有助于 富集带质粒的细胞。 富集带质粒的细胞。这也可以帮助解决一些难转染的细胞由于转 染效率低造成的问题。 染效率低造成的问题。 开始研究逆转录病毒和其他病毒载体用于siRNA表达, 逆转录病毒和其他病毒载体用于siRNA表达 开始研究 逆转录病毒和其他病毒载体 用于 siRNA 表达 , 其优势在 于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究, 于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究,避免由于质粒 转染效率低而带来的种种不便。 转染效率低而带来的种种不便。 最适用于:已知一个有效的siRNA序列,需要维持较长时间的基 最适用于:已知一个有效的 序列, 序列 因沉默,或者需要用抗生素筛选能表达siRNA的细胞。长期研究。 的细胞。 因沉默,或者需要用抗生素筛选能表达 的细胞 长期研究。 不适用于:筛选siRNA序列(其实主要是指需要多个克隆和测序 不适用于:筛选 序列( 序列 等较为费时、繁琐的工作) 等较为费时、繁琐的工作)

HeLa cells expressing cycle 3 GFP were transfected with pSilencer 2.1-U6 hygro containing an insert encoding an siRNA targeting cycle 3 GFP or pSilencer 2.1-U6 hygro without an siRNA-encoding insert. Following transfection, the cells were selected with hygromycin. Three weeks following selection, the cells were analyzed for GFP expression by fluorescence microscopy. Green: GFP. Blue: DAPI stained nuclei. GFP levels were remarkably reduced (94%) in cells transfected with the GFP siRNA-encoding pSilencer 2.1U6 hygro siRNA Expression Vector as compared to those transfected with an "empty" siRNA expression vector.

(5) siRNA表达框架 ) 表达框架
siRNA 表 达 框 架 (siRNA expression cassettes , SECs)是一种由 是一种由PCR得到的 得到的siRNA表达模版, 能够直 表达模版, 是一种由 得到的 表达模版 接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。 接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。 这个方法最早是由Castanotto采用 , 包括一个 采用, 这个方法最早是由 采用 包括一个RNA pol III启动子,一段发夹结构 启动子, 启动子 一段发夹结构siRNA,一个 ,一个RNA pol III 终止位点。 终止位点。 表达载体不同的是, 不需要载体克隆、 和siRNA表达载体不同的是,SECs不需要载体克隆、 表达载体不同的是 不需要载体克隆 测序等颇为费时的步骤,可以直接由PCR得到, 不用 得到, 测序等颇为费时的步骤 ,可以直接由 得到 一天的时间。 一天的时间。 因此, 成为筛选siRNA的最有效工具,甚至可以 的最有效工具, 因此,SECs成为筛选 成为筛选 的最有效工具 用来筛选在特定的研究体系中启动子和siRNA的最适 用来筛选在特定的研究体系中启动子和 的最适 搭配! 搭配!

(5) siRNA表达框架 ) 表达框架
如果在PCR两端添加酶切位点 , 那么通过 两端添加酶切位点, 那么通过SECs筛选 如果在 两端添加酶切位点 筛选 出的最有效的siRNA后 , 可以直接克隆到载体中构建 出的最有效的 后 siRNA表达载体。 表达载体。 表达载体 构建好的载体可以用于稳定表达siRNA和长效抑制的 构建好的载体可以用于稳定表达 和长效抑制的 研究。 研究。 这个方法的主要缺点是PCR产物很难转染到细胞中。 产物很难转染到细胞中。 这个方法的主要缺点是 产物很难转染到细胞中 如果有适合的新型转染试剂能提高SEC的转染效率的 如果有适合的新型转染试剂能提高 的转染效率的 话 , 那问题就可以解决了。另外,没有克隆到载体中 那问题就可以解决了。 另外, 片断并不适于大规模制备。 的PCR片断并不适于大规模制备。 片断并不适于大规模制备 最适用于: 筛选siRNA序列 , 在克隆到载体前筛选最 序列, 最适用于 : 筛选 序列 佳启动子; 佳启动子; 不适用于:长期抑制研究。 不适用于 : 长期抑制研究 。 ( 如果克隆到载体后就可 以了) 。 以了)

Variable Reduction in Target Gene Expression Using SECs with Different Promoters. siRNA Expression Cassettes featuring the mouse U6 (Mo-U6), human U6 (HuU6), and human H1 (HuH1) promoters and encoding a c-fos-specific hairpin siRNA were transfected into HeLa cells. 72 hours post-transfection, the cells were assessed using nuclear staining with DAPI and immunofluorescence using a c-FOS antibody. Non-transfected cells (NT) as well as cells transfected with an SEC expressing a negative control siRNA (scramble) demonstrate wild-type levels of c-FOS. The relative level of reduction in gene expression was quantified and is provided in the bar graph.

制备siRNA5种不同方法的比较 种不同方法的比较 制备

制备siRNA5种不同方法的比较(续) 种不同方法的比较( 制备 种不同方法的比较

4. 转染细胞
siRNAs需要进入细胞后才能对蛋白的表达进 需要进入细胞后才能对蛋白的表达进 行抑制, 行抑制 , 因此将其高效地转入细胞也是研究成 功与否的关键步骤。 功与否的关键步骤。 例如,一个siRNA对某个特定基因表达的抑制 例如,一个 对某个特定基因表达的抑制 效率是90%,但是其转染效率只有 效率是 ,但是其转染效率只有10%,那么 , 总的抑制率只有9%。 总的抑制率只有 。 目前传统的转染方法与试剂的效果都不是很理 想。 但是有专门的RNA转染试剂,其原理也是基于 转染试剂, 但是有专门的 转染试剂 脂质体技术, 可用于多种真核细胞的RNAi研 脂质体技术 , 可用于多种真核细胞的 研 究。

5. RNAi的效果分析
可从mRNA和蛋白质两方面进行。 和蛋白质两方面进行。 可从 和蛋白质两方面进行 mRNA: RT-PCR; 定量 : ; 定量PCR; Northern 杂 ; 交等。 交等。 蛋白质: 杂交; 蛋白质:Western杂交;ELISA;免疫荧光等。 杂交 ;免疫荧光等。 细胞的代谢过程, 细胞的代谢过程 , 生理生化系数等表型参数 的变化是RNAi效果最终和最大的体现。 效果最终和最大的体现。 的变化是 效果最终和最大的体现

6、RNAi技术的应用 RNAi技术的应用

(1)在功能基因组中的应用 )
在功能基因组研究中, 在功能基因组研究中 , 需要对特定基因进行功能丧失 或降低突变,以确定其功能。 或降低突变,以确定其功能。 由于RNAi具有高度的序列专一性,可以特异地使特定 具有高度的序列专一性, 由于 具有高度的序列专一性 基因沉默,获得功能丧失或降低突变,因此RNAi可以 基因沉默,获得功能丧失或降低突变,因此 可以 作为一种强有力的研究工具,用于功能基因组的研究。 作为一种强有力的研究工具 , 用于功能基因组的研究。 将功能未知的基因的编码区(外显子)或启动子区, 将功能未知的基因的编码区 ( 外显子 ) 或启动子区 , 以反向重复的方式由同一启动子控制表达。 以反向重复的方式由同一启动子控制表达 。 这样在转 基因个体内转录出的RNA可形成 可形成dsRNA,产生 基因个体内转录出的 可形成 ,产生RNA干 干 使目的基因沉默, 涉 , 使目的基因沉默 , 从而进一步研究目的基因的功 这种技术即为RNAi技术。 技术。 能,这种技术即为 技术 根据所选用序列的不同,可将其分为编码区 编码区RNAi和启 根据所选用序列的不同,可将其分为编码区 和 动子区RNAi技术。 技术。 动子区 技术

编码区RNAi技术 技术 编码区
1998年在线虫中发现RNAi现象以来 年在线虫中发现RNAi现象以来, 自1998年在线虫中发现RNAi现象以来,以基因编码区为靶序列 的编码区RNAi技术已用于线虫功能基因组的研究。 RNAi技术已用于线虫功能基因组的研究 的编码区RNAi技术已用于线虫功能基因组的研究。 最初这种技术是通过注射或浸泡等方法直接导入到线虫的性腺 或早期胚胎中。这些方法虽然可以关闭目的基因的表达, 或早期胚胎中。这些方法虽然可以关闭目的基因的表达,产生 突变表型,但这种表型变化却不能遗传。 突变表型,但这种表型变化却不能遗传。 这种早期的RNAi RNAi技术可以用于研究与胚胎发育有关的基因的功 这种早期的RNAi技术可以用于研究与胚胎发育有关的基因的功 但由于细胞分裂造成dsRNA的稀释, dsRNA的稀释 能,但由于细胞分裂造成dsRNA 的稀释,使得这种方法在研究 成体的基因功能时有一定的局限性。 成体的基因功能时有一定的局限性。 为弥补早期RNAi技术的上述不足,Tavernarakis等对RNAi技术 RNAi技术的上述不足 等对RNAi 为弥补早期RNAi技术的上述不足,Tavernarakis等对RNAi技术 进行了改进,将目的基因的靶序列以反向重复的方式, 进行了改进,将目的基因的靶序列以反向重复的方式,由热激 启动子控制在转基因生物中表达。 启动子控制在转基因生物中表达。 热激处理后,反向重复序列在细胞内开始转录, 热激处理后,反向重复序列在细胞内开始转录,其产物会形成 具发夹环结构的dsRNA 从而产生RNAi 使目的基因沉默。 dsRNA, RNAi, 具发夹环结构的dsRNA,从而产生RNAi,使目的基因沉默。

编码区RNAi技术 技术 编码区
这种改进的RNAi技术与传统的 RNAi技术相比 这种改进的 RNAi技术与传统的RNAi 技术相比 , 具有明 RNAi 技术与传统的RNAi技术相比, 显的优点: 显的优点: 首先转基因可以遗传给后代,有利于突变的分析; 首先转基因可以遗传给后代,有利于突变的分析; 其次dsRNA可以被诱导产生,RNAi能够在发育特定阶段 dsRNA可以被诱导产生 其次dsRNA可以被诱导产生,RNAi能够在发育特定阶段 出现, 出现 , 从而使研究发育早期必需基因在发育晚期的功 能成为可能; 能成为可能; 另外,当用细胞特异性启动子控制dsRNA的表达时, dsRNA的表达时 另外,当用细胞特异性启动子控制dsRNA的表达时,可 以研究特定基因在不同器官中的功能。 以研究特定基因在不同器官中的功能。 CarthewR. GAL4/UAS系统控 Kennerdell J. R. 和 CarthewR. W. 用 GAL4/UAS 系统控 dsRNA在果蝇中的表达 在果蝇中的表达, 制dsRNA在果蝇中的表达,实现了诱导性或细胞特异性 控制RNAi的发生。 RNAi的发生 控制RNAi的发生。

编码区RNAi技术 技术 编码区
随着应用RNAi技术研究线虫功能基因组工作的开展, 技术研究线虫功能基因组工作的开展, 随着应用 技术研究线虫功能基因组工作的开展 研究人员对该技术在植物中应用的可能性进行了探索。 研究人员对该技术在植物中应用的可能性进行了探索。 加州理工大学的Chuang C. F.和Megerowitz E. M.使 加州理工大学的 和 使 用此技术研究了拟南芥的AG, CLV3, AP1, PAN四个 用此技术研究了拟南芥的 四个 开花相关基因。 开花相关基因。 结果表明使用RNAi技术可以产生功能丧失或降低突变 结果表明使用 技术可以产生功能丧失或降低突变 其表型与以前通过其它方法鉴定的突变体类似。 体 , 其表型与以前通过其它方法鉴定的突变体类似 。 RNA原位杂交表明,RNAi突变体的目的 原位杂交表明, 突变体的目的mRNA显著降 原位杂交表明 突变体的目的 显著降 低。 该结果说明RNAi技术亦可以成为植物功能基因组研究 该结果说明 技术亦可以成为植物功能基因组研究 中的有力工具。 中的有力工具。

启动子区RNAi技术 技术 启动子区
M. F. Mett等证明含有启动子区的 等证明含有启动子区的dsRNA在植物体内 等证明含有启动子区的 在植物体内 同样被切割成21-23核苷酸长的片段,这种 核苷酸长的片段, 同样被切割成 核苷酸长的片段 这种dsRNA可 可 使内源相应的DNA序列甲基化 , 从而使启动子失去 序列甲基化, 使内源相应的 序列甲基化 功能,使其下游基因沉默。 功能,使其下游基因沉默。 由于多基因家族的各成员之间高度同源, 由于多基因家族的各成员之间高度同源,因而使用编 码区RNAi技术很难将各个成员区分开来研究 , 而多 技术很难将各个成员区分开来研究, 码区 技术很难将各个成员区分开来研究 基因家族内的启动子序列通常比编码区变化大, 基因家族内的启动子序列通常比编码区变化大,采用 启动子区RNAi技术有望将多基因家族的各个成员区 启动子区 技术有望将多基因家族的各个成员区 分开来研究。 分开来研究。 这样综合编码区RNAi技术和启动子区 技术和启动子区RNAi技术的信 这样综合编码区 技术和启动子区 技术的信 息即可更全面地了解多基因家族地各成员的功能。 息即可更全面地了解多基因家族地各成员的功能。 RNAi现象存在的广泛性远远超过人们的预期 现象存在的广泛性远远超过人们的预期, RNAi现象存在的广泛性远远超过人们的预期,对此问 题的深入研究结果将为进化的观点提供有力佐证。 题的深入研究结果将为进化的观点提供有力佐证。

启动子区RNAi技术 技术 启动子区
与其它几种进行功能丧失或降低突变的技术相比,RNAi技术具有 与其它几种进行功能丧失或降低突变的技术相比,RNAi技术具有 明显的优点,它比反义RNA技术和同源共抑制更有效, RNA技术和同源共抑制更有效 明显的优点 , 它比反义 RNA 技术和同源共抑制更有效 , 更容易产 生功能丧失或降低突变。 生功能丧失或降低突变。 而且通过与细胞特异性启动子及可诱导系统结合使用, 而且通过与细胞特异性启动子及可诱导系统结合使用,可以在发 育的不同时期或不同器官中有选择地进行, DNA技术造成的 育的不同时期或不同器官中有选择地进行 , 与 T-DNA 技术造成的 功能永久性缺失相比,这是更受科学家偏爱的。 功能永久性缺失相比,这是更受科学家偏爱的。 作为一种新的、强有力的研究工具,RNAi在功能基因组学领域呈 作为一种新的、强有力的研究工具,RNAi在功能基因组学领域呈 现出巨大的应用前景,成为当今研究领域最引人注意的话题之一。 现出巨大的应用前景,成为当今研究领域最引人注意的话题之一。 相对于基因敲除技术(knockout) RNAi具有快速 有效、 (knockout), 具有快速、 相对于基因敲除技术(knockout),RNAi具有快速、有效、容易操 作和序列特异性强等优点,被称为基因抑制(knockdown) 技术, (knockdown)技术 作和序列特异性强等优点 , 被称为基因抑制 (knockdown) 技术 , 是研究特定基因功能的有效方法。 是研究特定基因功能的有效方法。 因此, 因此,在某种程度上可以替代操作复杂和费用昂贵的基因敲除技 术。 与基因芯片等高通量基因筛选技术相结合, 与基因芯片等高通量基因筛选技术相结合,在哺乳动物细胞基因 组学功能研究中将起重要作用,其应用前景不亚于PCR技术。 PCR技术 组学功能研究中将起重要作用,其应用前景不亚于PCR技术。

(2)在基因治疗中的应用 )
治疗HIV 感染 治疗
由于RNAi是机体中古老而天然的抗病毒机制, HIV病 是机体中古老而天然的抗病毒机制, 由于 是机体中古老而天然的抗病毒机制 病 毒感染是我们亟待解决的问题, 毒感染是我们亟待解决的问题,将RNAi技术应用于艾 技术应用于艾 滋病治疗是顺理成章之事。 滋病治疗是顺理成章之事。 针对HIV病毒研究有 病毒研究有Jacque等设计的抑制 等设计的抑制HIV 1长末端 针对 病毒研究有 等设计的抑制 长末端 重复序列、附件基因vif和 表达的siRNA,Lee等针 重复序列、附件基因 和nef表达的 表达的 , 等针 转录子设计的siRNA及 Novina等 ] 针对 对 rev转录子设计的 转录子设计的 及 等 针对HIV病毒 病毒 gag基因设计的 基因设计的siRNA,其基本策略都是选择 基因设计的 ,其基本策略都是选择HIV病毒 病毒 或宿主细胞基因为靶点。 或宿主细胞基因为靶点。

治疗HIV 感染 治疗
然而, 治疗HIV,应用于临床,有几个重要问题 然而,RNAi治疗 治疗 ,应用于临床, 必须解决: 必须解决: 作用靶点的选择, 对序列要求非常严格, A 、 作用靶点的选择 , siRNA对序列要求非常严格, 1 对序列要求非常严格 个碱基的错配,将大大降低siRNA基因表达抑制作用。 基因表达抑制作用。 个碱基的错配,将大大降低 基因表达抑制作用 如果HIV逆转录酶有较高的错配率 逆转录酶有较高的错配率(1/1000个核苷酸每 如果 逆转录酶有较高的错配率 个核苷酸每 个复制循环), 就可能迅速导致所谓siRNA逃逸突变 个复制循环 , 就可能迅速导致所谓 逃逸突变 的出现。感染个体中HIV序列的多样性, 为 siRNA的 序列的多样性, 的出现 。 感染个体中 序列的多样性 的 设计和合成增加了难度。 设计和合成增加了难度。 如何有效导入siRNA. DNA质粒、逆转录病毒载体、 质粒、 B、如何有效导入 质粒 逆转录病毒载体、 腺病毒载体和脂质体等在培养细胞株中有良好的导入 效果,但在原代细胞中效果较差。 效果,但在原代细胞中效果较差。 C 、 增 强 siRNA 在 细 胞 中 的 稳 定 性 . 为 了 防 止 细 胞 内 RNA酶对 酶对siRNA的降解 , 可以用 的降解, 酶对 的降解 可以用DNA质粒和病毒载 质粒和病毒载 体将siRNA以发夹 以发夹(hairpins)的形式导入细胞内。 的形式导入细胞内。 体将 以发夹 的形式导入细胞内

治疗肝炎病毒感染
Jude Lieberman等已经成功地利用 RNAi技术治愈了 等已经成功地利用 技术治愈了 实验鼠的肝炎。 实验鼠的肝炎。 他们干扰的目标是“ 凋亡相关蛋白质( 他们干扰的目标是 “ 凋亡相关蛋白质 ( FAs) 基因 ” 。 ) 基因” FAs存在于细胞表面,它能够启动细胞的自杀程序。 存在于细胞表面, 存在于细胞表面 它能够启动细胞的自杀程序。 据认为,许多肝病是由于病毒、 据认为,许多肝病是由于病毒、免疫系统失常或慢性 酒精中毒激活了FAs基因所导致的。 基因所导致的。 酒精中毒激活了 基因所导致的 Jude Lieberman等给实验鼠尾部血管注入旨在“沉默” 等给实验鼠尾部血管注入旨在“ 等给实验鼠尾部血管注入旨在 沉默” FAs基因的 基因的siRNA,发现有 %的肝细胞接收到了这 基因的 ,发现有90% 分子, 蛋白质的产量变成原先的十分之一。 种RNA分子,FAs蛋白质的产量变成原先的十分之一。 分子 蛋白质的产量变成原先的十分之一 结果,未接受RNAi治疗的实验鼠有 %在3天内死亡。 治疗的实验鼠有40% 天内死亡。 结果,未接受 治疗的实验鼠有 只接受过治疗的实验鼠有33只活了下来 而40只接受过治疗的实验鼠有 只活了下来,10天后 只接受过治疗的实验鼠有 只活了下来, 天后 研究人员检查这些实验鼠的肝部,发现完全正常。 研究人员检查这些实验鼠的肝部,发现完全正常。

治疗肝炎病毒感染
McCaffre A及其导师 及其导师Kay M结果则证明 结果则证明RNAi可以直 及其导师 结果则证明 可以直 接治疗肝炎并病毒。 接治疗肝炎并病毒。 他们首先将HBV的基因组插入到小鼠肝脏细胞中,模 的基因组插入到小鼠肝脏细胞中, 他们首先将 的基因组插入到小鼠肝脏细胞中 感染, 基因组不同部分的2 拟HBV感染,然后合成靶向 感染 然后合成靶向HBV基因组不同部分的 基因组不同部分的 并分别与表达载体连接后导入感染小鼠。 种siRNA并分别与表达载体连接后导入感染小鼠。结 并分别与表达载体连接后导入感染小鼠 果发现治疗组小鼠体内肝炎病毒RNA的数量与对照 果发现治疗组小鼠体内肝炎病毒 的数量与对照 组相比减少了92%。 组相比减少了 。 治疗组小鼠没有发现严重的副作用。 治疗组小鼠没有发现严重的副作用。 指出, 方法不能用于人类。 但Kay指出,这种运送 指出 这种运送siRNA方法不能用于人类。他 方法不能用于人类 们正在实验更温和的途径将siRNA运送到细胞中。 运送到细胞中。 们正在实验更温和的途径将 运送到细胞中 对于人来说,身体比老鼠大得多, 对于人来说,身体比老鼠大得多,血液循环系统也庞 大。 如果解决了将siRNA有效而又充足地运送到细胞的问 如果解决了将 有效而又充足地运送到细胞的问 将为许多疾病和感染提供新疗法。 题,将为许多疾病和感染提供新疗法。

治疗肿瘤
多种癌基因可以作为靶点设计相对应的siRNA 多种癌基因可以作为靶点设计相对应的siRNA 。 等用逆转录病毒载体将siRNA siRNA导入肿瘤细 Brummelkamp 等用逆转录病毒载体将siRNA导入肿瘤细 胞中,特异性抑制了癌基因k (v12 的表达。 12) 胞中,特异性抑制了癌基因k ras (v12)的表达。 对急性髓性白血病的研究已经取得了乐观的结果。 对急性髓性白血病的研究已经取得了乐观的结果。 等以引起慢性髓性白血病和bcr ab1 Scher 等以引起慢性髓性白血病和bcr ab1阳性急性成 淋巴细胞白血病的bcr ab1癌基因为靶基因, 淋巴细胞白血病的 bcr ab1 癌基因为靶基因 , 设计了对 应的siRNA,并获得了87%的有效抑制率。 应的siRNA,并获得了87%的有效抑制率。 siRNA,并获得了87 Wilda等用siRNA抑制白血病bcr/abl融合基因表达也取 等用siRNA抑制白血病bcr/abl Wilda等用siRNA抑制白血病bcr/abl融合基因表达也取 得了成功。 RNAi技术的抗肿瘤治疗药物开 得了成功 。 因此基于 RNAi 技术的抗肿瘤治疗药物开 发潜力巨大。 发潜力巨大。

7.内源性RNAi机制及 7.内源性RNAi机制及 内源性RNAi 其作用

体内RNAi机制研究在深入 机制研究在深入 体内
是什么原因使我们有可能通过外源siRNA诱导内源性 诱导内源性 是什么原因使我们有可能通过外源 的靶基因转录后沉默? 的靶基因转录后沉默? 为 解 开 这 个 迷 题 , 更 有 效 地 进 行 RNAi 应 用 , 随 着 RNAi应用研究的广泛开展 ,, 并迅速成为 应用研究的广泛开展,, 并迅速成为RNAi研究 应用研究的广泛开展 ,,并迅速成为 研究 中的重要领域,吸引着越来越多的研究者投身其中, 中的重要领域 , 吸引着越来越多的研究者投身其中 , 涌现出一系列令人耳目一新的成果。 涌现出一系列令人耳目一新的成果。 多年来,生物学家认为RNA在生命过程中的作用仅仅 多年来 ,生物学家认为 在生命过程中的作用仅仅 是将遗传信息从DNA传递到蛋白, 就象蜂群中的雄蜂 传递到蛋白, 是将遗传信息从 传递到蛋白 般没有创意。 般没有创意。 但 近 几 年 的 一 系 列 发 现 使 研 究 者 对 RNA , 尤 其 是 mRNA以外的哪些小 以外的哪些小RNA的功能有了全新的认识。 的功能有了全新的认识。 以外的哪些小 的功能有了全新的认识

体内小RNA作用的重新认识 作用的重新认识 体内小
生物体中有一群小RNA( 目前看来人体中编码约 ( 目前看来人体中编码约255种 生物体中有一群小 种 小 RNA, 竟占整个基因组近 , 竟占整个基因组近1%, 很多可能编码自以前 , 被认为的“ 垃圾DNA”) 可以影响蛋白表达水平 , 从而 被认为的 “ 垃圾 ) 可以影响蛋白表达水平, 控制细胞的多种生命活动。 控制细胞的多种生命活动。 尤其在发育过程中2003年有一些激动人心的最新发现: 年有一些激动人心的最新发现: 尤其在发育过程中 年有一些激动人心的最新发现 仅约22个核苷酸长度的小 个核苷酸长度的小RNA, 发现竟能引导早期发 仅约 个核苷酸长度的小 , 育 ——从使植物叶片成形到介导果蝇胚胎在植物组织中 从使植物叶片成形到介导果蝇胚胎在植物组织中 的细胞增殖; 的细胞增殖; 缺少RNAi 蛋白 蛋白Dicer( 一种 缺少 ( 一种RNA酶 III家族的酶 , 参与 酶 家族的酶 RNAi过程中对 过程中对RNA的剪切)的小鼠会缺少干细胞的某些 的剪切) 过程中对 的剪切 分化系( 分化系(swathsofstemcells),在出生前就夭折; ) 在出生前就夭折; 小鼠中特定的小RNA能帮助引导干细胞生成胚胎的血细 小鼠中特定的小 能帮助引导干细胞生成胚胎的血细 胞系统。 胞系统。

1)抗病毒功能
Voinnet和Li等分别在植物和果蝇中发现 和 等分别在植物和果蝇中发现 了通过RNAi实现的抗外源核酸机制:被 实现的抗外源核酸机制: 了通过 实现的抗外源核酸机制 大多数RNA病毒启动的 病毒启动的RNAi可导致病毒 大多数 病毒启动的 可导致病毒 基因组降解。 基因组降解。 例 如 在 果 蝇 细 胞 中 , Flock house virus(FHV)就能引发果蝇内部的 就能引发果蝇内部的RNAi反 就能引发果蝇内部的 反 产生FHV特异性的 特异性的siRNA来降解感 应 , 产生 特异性的 来降解感 染的FHV。 染的 。

2)基因调控
目前在人、蠕虫, 目前在人、蠕虫,果蝇和植物等生物体 中都发现了小RNA,有的通过结合 非 中都发现了小 ,有的通过结合3‘非 翻译区( 抑制mRNA 翻译区(UTR)和靶 )和靶mRNA抑制 抑制 翻译,有的作为siRNA通过 通过RNAi机制破 翻译,有的作为 通过 机制破 坏靶基因转录本。 坏靶基因转录本。

3)染色质浓缩
内源的一些siRNA可能通过使染色质浓缩调节基因表 可能通过使染色质浓缩调节基因表 内源的一些 达。 一些研究小组发现dsRNA结合到植物启动子区域能通 一些研究小组发现 结合到植物启动子区域能通 过一种使DNA甲基化的作用导致基因沉默; 甲基化的作用导致基因沉默; 过一种使 甲基化的作用导致基因沉默 在蠕虫体内检测到许多Polycomb蛋白(能结合染色质) 蛋白( 在蠕虫体内检测到许多 蛋白 能结合染色质) 过程所必须的; 是RNAi过程所必须的; 过程所必须的 裂殖酵母中内源siRNA可介导中心粒区染色质浓缩 , 可介导中心粒区染色质浓缩, 裂殖酵母中内源 可介导中心粒区染色质浓缩 导致这个位点的基因转录沉默。 导致这个位点的基因转录沉默 。 如 Vera Schramke等 等 在裂殖酵母中通过合成shRNA反式抑制同源位点, 导 反式抑制同源位点, 在裂殖酵母中通过合成 反式抑制同源位点 致在mate区沉默的 区沉默的Swi6染色质浓缩。 染色质浓缩。 致在 区沉默的 染色质浓缩 这些结果都提示一些内源性的siRNA通过导致染色质 这些结果都提示一些内源性的 通过导致染色质 浓缩来调节基因水平。 浓缩来调节基因水平。

4)转座子沉默
目前,两方面的证据提示转座子沉默涉及 siRNA。 。 其一,发现蠕虫mut-7基因参与 基因参与RNAi和转位抑 其一,发现蠕虫 基因参与 和转位抑 制。 其二,从裂殖酵母的中心粒区也分离出siRNA, 其二 , 从裂殖酵母的中心粒区也分离出 , 并检测到这些siRNA介导此区内组蛋白甲基化。 介导此区内组蛋白甲基化。 并检测到这些 介导此区内组蛋白甲基化 由于中心粒区包含重复序列——含转座子片段, 由于中心粒区包含重复序列 含转座子片段, 含转座子片段 在一些减数分裂基因中也发现了通过其附近的 逆转录转座子LTR(长末端重复序列)介导的 逆转录转座子 (长末端重复序列) RNAi,推测在 ,推测在siRNA介导的中心粒区域的组蛋 介导的中心粒区域的组蛋 白甲基化可能源于古老的转座子沉默作用。 白甲基化可能源于古老的转座子沉默作用。

5)基因组重组
siRNA可能参与纤毛虫 , 四膜虫虫体间 可能参与纤毛虫, 可能参与纤毛虫 结合时的基因重组。 结合时的基因重组。 结合到重组序列的siRNA, 在虫体之间 结合到重组序列的 , 的结合过程中介导DNA缺失和染色体断 的结合过程中介导 缺失和染色体断 裂。 有趣的是, 在这些siRNA介导的程序性 有趣的是 , 在这些 介导的程序性 DNA删除事件中 , 也发现需要重组区域 删除事件中, 删除事件中 组蛋白的甲基化。 组蛋白的甲基化。


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