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病原分子生物学实验技术-2013


病原分子生物学实验技术
王荡
wangdang511@126.com

华中农业大学动物病毒室 2013级

实验内容
实验一、聚合酶链反应(PCR) 实验二、外源DNA片段的克隆 实验三、感受态细胞的制备 实验四、细菌转化 实验五、质粒的小量制备与鉴定 实验六、质粒的大量制备 实验七、原核表达与表达产物的提取 实验八、SDS-PAGE电泳 实验九、病毒基因组DNA的提取

实验要求
1、注重实验设计 2、严格操作程序 3、注意生物安全 4、了解实验原理

实验预期目标
1、掌握DNA操作和原核表达的基本实 验技能 2、提高独立进行实验设计的能力 3、了解DNA操作和原核表达实验技术 的基本原理(自己查资料)

参考书:分子克隆实验指南

本实验技术课程的总体思路
基因克隆 表达载体构建 蛋白表达与分析 PCR扩增 酶切、鉴定 原核表达、SDS-PAGE

实验一 聚合酶链反应(PCR)
? 引物的设计 ? 已知基因序列 ? 部分序列已知 5’/3’ RACE ? 高度变异序列 简并引物

实验一 聚合酶链反应(PCR)
? 模板的处理 ? 细菌 ? 细胞培养物 ? 质粒 ? 病毒基因组DNA ? 病料 ? 鼻拭子

实验一 聚合酶链反应(PCR)
? PCR ? PCR (DNA) ? RT-PCR (RNA) ? 套式PCR ? 荧光定量PCR

实验一 聚合酶链反应(PCR)
? 以原核表达PRRSV ORF7基因为例 ? 引物设计 ? 模板制备 ? PCR反应体系以及扩增条件 ? PCR产物电泳检测

载体选择

蛋白特性分析(信号肽、跨膜区)

http://www.expasy.org/tools/

SignalP软件

引物设计

上游引物:ATGCCAAATAACAACGGCAAGC 下游引物:TCATGCTGAGGGTGATGCTGTG

引物设计原则
? 引物的长度一般为15-30 bp,常用的是18-27 bp,但不应大 于38,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于Taq DNA 聚合酶进行反应 ? 引物序列的GC 含量一般为40-60%,过高或过低都不利于引 发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大 ? 引物3’端的末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基 ? 5’端序列对PCR 影响不太大,常用来引进修饰位点或标记物

酶切位点添加

载体自连?
PRRSV ORF7酶切位点

插入方向? 同尾酶?

读码框校正(BamH I+Hind III)

30a(+)

5‘-GGATCCATGCCAAATAACAACGGCAAGC …………CACAGCATCACCCTCAGCATGAAAGCTT -3’

Gly-Ser-Met-(PRRSV ORF7)-(TGA)

读码框校正(Sal I+Xho I)

30a(+)

5‘-CGTCGACATGCCAAATAACAACGGCAAGC …………CACAGCATCACCCTCAGCATGACTCGAG -3’

Arg-Arg-His-(移码的PRRSV ORF7)

读码框校正(Sal I+Xho I)

30a(+)

5‘-CGTCGACAAATGCCAAATAACAACGGCAAGC …………CACAGCATCACCCTCAGCATGACTCGAG -3’

Arg-Arg-Gln-Met-(PRRSV ORF7)-(TGA)

引物设计注意事项
? 载体N端有标签,上游引物要对读码框;下游引物要加终止 密码子 ? 载体C端有标签,上游引物要加起始密码子,且考虑是否加 Kozak序列(真核表达系统);下游引物要对读码框,并且 要去掉基因本身的终止密码子 ? 利用真核表达系统表达分泌蛋白,其信号肽一般添加在载体 的N端;如需要用标签纯化该蛋白,这需将标签添加到该蛋 白的C端,同时去掉基因本身的终止密码子

保护性碱基
? 通常保护性碱基添加2-3 个,但是不同公司的限制 性内切酶的保护碱基个数 有所不同 ? 可通过添加不同保护性碱 基,使上下游引物GC含量 尽可能一致 ? 根据实验要求添加酶切位 点和保护性碱基,如果 PCR产物直接连T载体则可 不用添加保护性碱基 TaKaRa公司

实验一 聚合酶链反应(PCR)
? PRRSV ORF7的PCR扩增 1、引物 P1:5’-CATGGATCCATGCCAAATAACAACGGCAAGC-3’ (BamHI) P2:5’-CACAAGCTTTCATGCTGAGGGTGATGCTGTG-3’ (HindIII) 2、模板(质粒) 用前于沸水浴中变性10min,迅速置冰浴上不少于3min

实验一 聚合酶链反应(PCR)
3、反应体系
10xBuffer 15mM MgCl2 2.5mM dNTPs P1 P2 Taq 模板 ddH2O Total 体积 5μl 5μl 4μl 1μl 1μl 1μl 1μl 32μl 50μl 终浓度 1.5mM 0.2mM 0.5μM 0.5μM 5U

实验一 聚合酶链反应(PCR)
4、反应条件(要摸索最佳条件,尤其 是退火温度;如何降低非特异性) 95℃变性
5 Min

94℃
1 ‘

1 ‘

58℃
30’’

35个循环

72℃ 72℃延伸10 min 4℃

实验一 聚合酶链反应(PCR)
5、电泳检测
取8-10μl扩增产物于上样膜上,加1.5μl上样缓冲 液混匀后点样。 0.8%琼脂糖凝胶的配制: 称取0.8g琼脂糖粉,加入100ml 1×TAE中,加热煮沸使琼 脂糖完全熔化,稍稍冷却后,加入5μl 10mg/ml的溴化 乙锭(EB),混匀后倒入电泳槽中,制备凝胶。

PCR电泳检测结果
M1 1 2 3 4 5 6 7 M2
15000bp 2000bp 500bp 250bp 100bp 2000bp 1000bp 250bp

对照

ORF7 PCR产物

胶回收法回收PCR产物
1、将PCR扩增产物,在0.8%琼脂糖回收胶中上样电泳。 2、在长波紫外灯下,用刀片切下目的片段,装入1.5ml离心管中 ,按回收试剂盒说明书进行回收,最后用20μl ddH2O洗脱, 获得目的片段

沉淀法回收PCR产物
1、将3管PCR产物混合后加入适量的水至500ul,加等体积的苯酚∶氯 仿∶异戊醇(25∶24∶1)涡旋混匀,12000r/min离心5min 2、取上层液相于另一离心管中,加2倍体积预冷的无水乙醇和1/10体 积的3M NaAc,混匀后于-20℃沉淀30min 3、12000r/min离心5min,小心吸去上清液,将离心管倒置于吸水纸 上,以使所有液体流出 4、用70%乙醇洗一次,倒掉洗液并倒置吸水纸上让痕量液体流尽。然 后用真空干燥器抽干或自然干燥直到无乙醇气味 5、用35μl ddH2O溶解

实验二 外源DNA片段的克隆
? 直接克隆到T载体
连接反应体系: DNA pMD18-T 10X T4 Ligase buffer T4 Ligase 16.0μl 1.0μl 2.0μl 1.0μl
? 是不是所有PCR产物都可 以直接克隆到T载体?

22℃ 10min或者过夜(Thermo,公司不同反应条件也不相同) 取10μl转化大肠杆菌DH5α,质粒提取,鉴定

实验二 外源DNA片段的克隆
? 直接克隆到克隆载体或表达载体
一、PCR产物的酶切
双酶切反应时通用缓冲液的使用表

DNA 10X Buffer K BamHI HindIII (35ul体系) 37℃ 2-3h。

29.5μl 3.5μl 1.0μl 1.0μl

实验二 外源DNA片段的克隆
二、载体(pET-30a(+))的酶切处理 载体pET-30a(+)同样用BamHI和HindIII酶切,酶切 产物电泳回收,用10μl ddH2O洗脱
酶切体系: DNA 10X Buffer K BamHI HindIII ddH2O 37℃ 2-3h 4.0μl(根据浓度确定用量) 3.5μl 1.0μl 1.0μl 25.5μl

酶切注意事项
? 了解各种限制性内切酶的特性与使用 ? Star活性(注意酶的用量、时间、温度) ? 酶切时间 ? 酶切温度 ? 双酶切(侧翼序列、Buffer)

实验二 外源DNA片段的克隆
三、外源片段或载体酶切产物的回收 制备回收胶,将所有酶切产物上样电泳回收,用12μl ddH2O洗脱。(一般来说,回收后应电泳观察浓度) 四、外源片段与载体的连接
连接体系(不是一成不变的,要根据经验) DNA片段 10μl pET-30a(+) 7μl 10×T4 Ligase buffer 2.0μl T4 Ligase 1.0μl 22℃ 10min或者过夜(Thermo,不同公司的连接酶反应条件不一样)

五、转化大肠杆菌DH5α

本实验技术课程的总体思路
基因克隆 表达载体构建 蛋白表达与分析 PCR扩增 酶切、鉴定 原核表达、SDS-PAGE

实验基本原理的思考题:
1、PCR引物设计原则 2、PCR的种类及用途 3、提高PCR反应特异性的策略 4、限制性内切酶的同尾酶、Star活性

病原分子生物学实验技术
王荡
wangdang511@126.com

华中农业大学动物病毒室 2013级

本实验技术课程的总体思路
基因克隆 表达载体构建 蛋白表达与分析 PCR扩增 酶切、鉴定 原核表达、SDS-PAGE

实验三 感受态细胞的制备
1、商品化的DH5α菌种在无抗性的固体LB平皿中划线复苏

?用接种环以无菌操作取细菌悬液,在平板培养基的一边,做第一次平行划线。 转动培养皿,用烧过冷却的接种环,通过第一次划线部分,做第二次平行划线。 用同法通过第二次平行划线,做第三次平行划线。

实验三 感受态细胞的制备
1、商品化的DH5α菌种在无抗性的固体LB平皿中划线复苏 2、从大肠杆菌DH5α平板中挑取一个单菌落,转到一个含 50mL LB培养基的盐水瓶中,于37℃ 300转/分剧烈振荡 培养3-4h。为得到有效转化,活细菌数不应超过108细胞 /ml,一般以稍见浑浊为宜。

实验三 感受态细胞的制备
1、商品化的DH5α菌种在无抗性的固体LB平皿中划线复苏 2、从大肠杆菌DH5α平板中挑取一个单菌落,转到一个含 50mL LB培养基的盐水瓶中,于37℃ 300转/分剧烈振荡 培养3-4h。为得到有效转化,活细菌数不应超过108细胞 /ml,一般以稍见浑浊为宜。 3、在无菌条件下将细菌转移到一个无菌,用冰预冷的50ml 聚丙烯离心管中,在冰上放置30min,使培养物冷却到 0℃。 4、于4℃ 4000转/分离心10min,回收细菌。

实验三 感受态细胞的制备
4、弃上清,将离心管倒置在吸水纸上1min,使管壁上的 培养液流尽. 5、取10ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬沉淀,冰上放 置25-30min。 6、重复步骤3、4。 7、取2ml用冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬沉淀。 8、将悬液分装成小份,若要长时间保存,于-70℃冻存 ,若近期使用,可放在4℃保存。
注意事项:菌体不能超过对数生长期;冰上操作;无菌操作

感受态细胞效率检测
Amp+ Kan+

直接涂感受态

直接涂感受态

转Amp+抗性的质粒

转Kan+抗性的质粒

实验四 连接产物转化
1、取100μl感受态细胞悬液转移到无菌的1.5mlEP管中, 加入10μl连接产物,轻轻旋转以混合内容物,在冰上放 置30min(实验中设一不加质粒DNA的对照)。 2、将离心管放到预先加温到42℃的循环水浴中热冲击90秒 3、快速将离心管转移到冰浴中,使细胞冷却1-2min。 4、每管加400μl LB 培养基。用水浴将培养基加温至37℃ ,然后将离心管转移到37℃摇床上,温育45min,使细菌 复苏。(为达到有效转化,复苏时转速不宜超过225转/ 分)。

实验四 连接产物转化
5、取100μl转化的感受态细胞转移到含相应抗生素(Kan )的LB琼脂平皿上,用一无菌弯头玻棒将转化的细胞均 匀地涂布到琼脂平板表面。 6、将平皿置37℃培养,直至液体被吸收,然后倒置平皿培 养,12-16h可出现菌落。
注意事项:热激时间、复苏转速、新制备的平皿注意“发汗” 如果是转化质粒,可以简化复苏这一步

实验五/六 质粒提取
? 目前已经有商品化试剂盒,但通过经典方法提取,有助 于掌握基本原理。 ? 在购买质粒提取试剂盒时,应注意所提取质粒的用途, 如果是用于将来的转染或动物实验,应采用去内毒素的 试剂盒。

碱裂解法小量制备质粒
1、将2ml含相应抗生素的LB加到细菌瓶中,然后接入一单 菌落,于37℃振荡培养过夜。 2、将培养物转移到1.5ml微量离心管中,12000r/min离心 1min,倾去上清,将离心管倒置于吸水纸上,尽量让培 养液流尽。 3、将细菌沉淀重悬于100μl用冰预冷的溶液I,涡旋,使 沉淀完全分散,室温静置5min。 4、加入200μl新配制的溶液Ⅱ,颠倒几次,充分混匀,置 于冰上5min。

5、加入150μl用冰预冷的溶液Ⅲ,上下颠倒几次,于冰上 放置3-5min。 6、12000r/min离心5min,将上清转移到另一离心管中,不 要将沉淀吸起。 7、加等量苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)涡旋混匀, 12000r/min离心5min。 8、取上层液相于另一离心管中,加2倍体积预冷的无水乙 醇,混匀后于-20℃沉淀30min。

9、12000r/min离心5min,小心吸弃上清液,将离心管倒置 于吸水纸上,以使所有液体流出。 10、用70%乙醇洗一次,倒掉洗液并倒置吸水纸上让痕量液 体流尽。然后用真空干燥器抽干或自然干燥直到无乙醇 气味。 11、用20μl含RNA酶的TE或灭菌双蒸水溶解,37℃作用 30min以去除RNA。 12、取4μl质粒经双酶切后,电泳检测,将阳性克隆送至 测序公司测序。剩余质粒-20℃保存。

质粒双酶切鉴定
双酶切鉴定体系: DNA 4μl(根据浓度确定用量) 10X Buffer K 2μl BamHI 1μl HindIII 1μl ddH2O 12μl 37℃ 2-3h

质粒酶切电泳检测结果
未酶切质粒 双酶切质粒

病原分子生物学实验技术
王荡
wangdang511@126.com

华中农业大学动物病毒室 2013级

本实验技术课程的总体思路
基因克隆 表达载体构建 蛋白表达与分析 PCR扩增 酶切、鉴定 原核表达、SDS-PAGE

实验七 原核表达
常用的表达系统: 大肠杆菌 酵母 杆状病毒 哺乳动物细胞 各种表达系统均有优缺点(查资料)

实验七 原核表达
? DH5α是一种常用于质粒 克隆的菌株,可用于质粒 高拷贝数扩增 ? BL21用于高效表达含有噬 菌体T7启动子的表达载体 (如pET系列)的基因,该 菌适合表达非毒性蛋白 ? 将测序正确的阳性质粒转 化BL21,用于后续原核表 达实验

实验七 大肠杆菌表达(少量)
1、挑单菌落于5ml含Kan的LB中,37℃振摇培养8-12h(测 定OD值,一般达0.6-1.0)。 2、4℃过夜。 3、取培养液按1∶100的量接入含Kan的LB中,37℃振摇培 养3h。 4、加IPTG至(0.4-1.0)0.8mmol/L,37℃振摇培养,一般 培养2-3h(诱导后不同时间取样2-6h)。 5、4℃ 8000r/min 5min,弃上清。 6、SDS-PAGE检测表达(必须设对照载体诱导表达产物)

实验八 SDS-PAGE检测表达
1、制备SDS-PAGE胶(目前已有商品化胶,但价格很贵)具体 步骤:
? 夹好灌制聚丙烯酰胺凝胶的玻璃板 ? 将制好的12%的SDS丙烯酰胺分离胶约5ml迅速灌入两玻板的间隙中, 留出灌注积层胶所需空间(分离胶的浓度依据蛋白大小选择) ? 在分离胶上加入一层异丁醇。 ? 分离胶聚合后,倾出覆盖层液体,用去离子水洗凝胶顶部数次,用 纸巾吸净残留液体 ? 将刚制好的5%积层胶灌入分离胶上,立即插入梳子,待胶全部凝聚 后拨出梳子。

实验八 SDS-PAGE检测表达
2、用水洗去加样槽的残留液体,用针头拨掉加样槽的胶,将齿弄直 ,固定于电泳装置,加电泳缓冲液。 3、每孔上10-20μL样品,将电泳装置与电源相接。(样品的处理: 细菌沉淀物加适量的ddH2O重悬,加等体积的2×SDS凝胶加样缓 冲液,90-95℃水浴3-5min。) 4、将电压调到80V,待溴酚蓝跑到分离胶时,将电压调到120V-150V 。 5、等溴酚蓝跑到分离胶底部时关掉电源(可根据要求延长电泳时间 ),取出聚丙烯酰胺凝胶,置于考马斯亮蓝染料中染色4h以上 6、取出,放入脱色液中脱色数次,每次30-60min。脱色完全后,取 出观察分析。

SDS-PAGE检测结果
M:蛋白Ladder 1:pET-30a(+)空载体诱导5h 2: pET-30a-P未诱导 3: pET-30a-P诱导3h

目的蛋白

4: pET-30a-P诱导4h 5: pET-30a-P诱导5h 6: pET-30a-P诱导6h

实验基本原理的思考题:
1、质粒提取中各种缓冲液的作用 2、原核表达载体的原件 3、制备SDS-PAGE胶的各种缓冲液成分及作用 4、常用表达系统的特点

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