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RNA干扰技术


Introduction of small segments of doublestranded RNA leads to specific degradation of the corresponding mRNA.

RNA 干 扰 技 术

RNA 干扰(RNA interference, RNAi) 干扰( )
一些小的双链RNA(siRNA)可以通过促 可以通过促 一些小的双链 使特定基因的mRNA降解来高效、特异 降解来高效、 使特定基因的 降解来高效 的阻断体内特定基因表达, 的阻断体内特定基因表达,诱使细胞表 现出特定基因缺失的表型,称为RNA干 现出特定基因缺失的表型,称为 干 扰(RNAi)。 )。 RNAi的发现具有划时代的意义,它不 的发现具有划时代的意义, 的发现具有划时代的意义 仅深入揭示了细胞内基因沉默的机制, 仅深入揭示了细胞内基因沉默的机制, 而且它还是后基因组时代基因功能分析 而且它还是后基因组时代基因功能分析 的有力工具, 的有力工具,极大地促进了人类揭示生 命奥秘的进程;此外, 命奥秘的进程;此外, siRNA本身还是 本身还是 一种极具前景的基因靶向药物 基因靶向药物, 一种极具前景的基因靶向药物,可广泛 地用于诸如癌症等疾病的治疗。 地用于诸如癌症等疾病的治疗。鉴于 siRNA技术的巨大意义与广阔应用前景 技术的巨大意义与广阔应用前景 年美国《 ,2002年美国《科学》杂志将其评为全 年美国 科学》杂志将其评为全 球年度十大科学进展之首。

2006年的诺贝尔生理学奖获得者: 年的诺贝尔生理学奖获得者: 年的诺贝尔生理学奖获得者
Andrew Z. Fire Craig C. Mello

Glossary (术语 术语) 术语 RNAi----- RNA interference (RNA干扰 干扰) 干扰

siRNAs-----Small interfering RNAs (小干扰性 小干扰性RNA) 小干扰性 dsRNA------double strand RNA(双链 双链RNA) 双链 RISC------RNA-induced silencing complex (RNA诱导沉默复合物 诱导沉默复合物) 诱导沉默复合物 RdRP------- RNA-directed RNA polymerase (RNA指导 指导RNA聚合酶 聚合酶) 指导 聚合酶 Dicer------ RNAaseIII—related enzymes (RNAaseIII家族成员 家族成员) 家族成员 PTGS------Post-transcriptional gene silencing 转录后基因沉默

转录后沉默

Post-transcriptional gene silencing (PTGS)

RNAi 研 究 史
20多年前,在对矮牵牛花(petunias)进行的研究中 多年前,在对矮牵牛花( 多年前 牵牛花 ) 发现协同抑制现象"cosuppression",导入的基因和其相 发现协同抑制现象 , 似的内源基因同时都被抑制。 似的内源基因同时都被抑制 96年前后,研究发现 注入反义 年前后, 注入反义RNA及正义链 及正义链RNA都能 年前后 及正义链 都能 抑制线虫 线虫par-1 基因的表达;三年后,首次将双链 基因的表达;三年后,首次将双链RNA注入 抑制线虫 注入 到线虫中,结果表现出比单独注射正义链或者反义链都要强 到线虫中 结果表现出比单独注射正义链或者反义链都要强 得多的基因沉默效果 沉默效果, 得多的基因沉默效果,这种技术的成熟使得大规模筛选线 虫RNAi诱导的功能缺失突变体成为可能,并引发后继的大 诱导的功能缺失突变体成为可能, 诱导的功能缺失突变体成为可能 量针对这种模式生物基因敲除的研究 。 在果蝇的研究中同样发现 果蝇的研究中同样发现RNAi。通过显微注射或者通 的研究中同样发现 。 过基因枪将dsRNA注入果蝇胚胎中能够引发基因沉默。在 注入果蝇胚胎中能够引发基因沉默。 过基因枪将 注入果蝇胚胎中能够引发基因沉默 过去的几年中RNAi技术在果蝇的研究中成为一种反向遗传 过去的几年中 技术在果蝇的研究中成为一种反向遗传 工具,用于鉴定功能缺失表型。 工具,用于鉴定功能缺失表型。 2001年Elbashir等《 Nature》上首次报道通过 个核苷 年 等 》上首次报道通过21个核苷 酸的siRNA成功地在哺乳动物培养细胞中诱导特异性基因沉 成功地在哺乳 酸的 成功地在哺乳动物培养细胞中诱导特异性基因沉 随后,在小鼠等多种细胞中也取得了成功。 默。随后,在小鼠等多种细胞中也取得了成功。

牵牛花( 牵牛花(petunias) ) 协同抑制现象"cosuppression", , 协同抑制现象

线虫的RNAi 线虫的

(左)两线虫带有含普遍性表达的GFP报告基因重组质粒的 表达品系。 (右)喂食表达针对GFP的dsRNA的细菌后,整个虫体GFP 信号消失(头部区域有些神经元对该效应具有抗性)。

RNAi 应答的基本特征 应答的基本特征:
1、靶基因内源性序列不发生改变,即RNAi不引起稳定 、靶基因内源性序列不发生改变, 不引起稳定 的遗传改变。 的遗传改变。 2、发现细胞质中靶mRNA水平下降,但细胞核的 、发现细胞质中靶 水平下降, 水平下降 但细胞核的mRNA前 前 体数量未受影响。相应原核生物, 体数量未受影响。相应原核生物,位于操纵子的基因在 RNAi不发生交叉反应。说明 不发生交叉反应。 不发生交叉反应 说明RNAi是在转录后发挥 是在转录后发挥 作用(PTGS) 。 作用 3、RNAi效应可以在线虫体内传播 、 效应可以在线虫体内传播-------即传播效应。 即传播效应。 效应可以在线虫体内传播 即传播效应 4、每个细胞仅需要少量siRNA分子就可对大量 、每个细胞仅需要少量 分子就可对大量mRNA发挥 分子就可对大量 发挥 作用,提示存在某些放大 或催化活性的因素在起作用 放大和 作用,提示存在某些放大和/或催化活性的因素在起作用 例如: 依赖RNA的RNA聚合酶 (RdRP)的发现 例如: 依赖 的 聚合酶 ) 线虫中的随机降解性 随机降解性PCR模型 线虫中的随机降解性 模型

RdRP ----- 依赖 依赖RNA的RNA聚合酶 的 聚合酶
1、多种遗传学实验证实了RdRP在基因沉默中的重要作用, 其活性是基因沉默机制中不可缺少的组分。 (首先在线虫和果蝇中获证) 2、果蝇和线虫提取物中的siRNA可以作为RdRP的引物, 可以继续引导产生更多的dsRNA。这个过程成为---降解PCR (degradative PCR) 3、RdRP的功能似是产生以单链RNA引导的dsRNA的合成, 而dsRNA经dicer切割成siRNA,从而放大并维持PTGS 效应。

线虫中的随机降解性PCR模型 线虫中的随机降解性 随机降解性 模型

RNA-directed RNA polymerase

RICS
RNA-induced silencing complex

Gene silencing

哺乳动物细胞中的RNA干扰 干扰 哺乳动物细胞中的
大于30个核苷酸的双链 进入哺乳动物的成体细胞后, 大于 个核苷酸的双链RNA进入哺乳动物的成体细胞后,会非 个核苷酸的双链 进入哺乳动物的成体细胞后 特异的阻断基因的表达。这是由于当长的双链RNA进入哺乳动物成体 特异的阻断基因的表达。这是由于当长的双链 进入哺乳动物成体 细胞后,细胞内的病毒防御机制被激活, 细胞后,细胞内的病毒防御机制被激活,会引起非特异的基因表达抑 制。 这种抑制是通过以下两种途径之一进行的: 这种抑制是通过以下两种途径之一进行的:

A
激活 蛋白激酶(PKR) 失活 翻译起始因子eIF2a 翻译抑制 诱导细胞凋亡

长的dsRNA

B
激活
2’-5’寡聚腺苷酸合成酶

RNase L

非特异的RNA降解

哺乳动物细胞中的RNA干扰 干扰 哺乳动物细胞中的
研究发现不超过 个碱基的双链 研究发现不超过30个碱基的双链RNAs并不会激活 并不会激活PKR激酶途径 激酶途径 不超过 个碱基的双链 并不会激活 通过瞬时转染导入的siRNAs能够以序列专一的方式有效 能够以序列专一的方式有效 通过瞬时转染导入的 诱发培养的哺乳动物细胞的RNAi。 诱发培养的哺乳动物细胞的 。 siRNAs的效率各有区别 的效率各有区别——最有效的 最有效的siRNAs能使靶 能使靶RNA 的效率各有区别 最有效的 能使靶 和蛋白水平降低90%以上。 以上。 和蛋白水平降低 以上 研究发现最有效的siRNAs是21个碱基大小、3’端有两个 是 个碱基大小 个碱基大小、 端有两个 研究发现最有效的 突出碱基的双链RNA。 突出碱基的双链 。
(UU)dTdT dTdT(UU)

siRNA的序列专一性要求非常严谨,与靶mRNA之间一 的序列专一性要求非常严谨,与靶 的序列专一性要求非常严谨 之间一 个碱基错配都会显著削弱基因沉默的效果。 个碱基错配都会显著削弱基因沉默的效果。

The targets of the RNAi-directed gene silencing 干扰指导的基因沉默的结果): (RNA干扰指导的基因沉默的结果): 干扰指导的基因沉默的结果 1.Degradation of the target mRNA (引 引 起靶标mRNA的降解 , 的降解) 起靶标 的降解 2.Inhibition of translation of the target mRNA (抑制靶标 抑制靶标mRNA的翻译 , 的翻译) 抑制靶标 的翻译 3.Silencing the gene transcription from the target promoter (引起靶标启 引起靶标启 动子的转录沉默) 动子的转录沉默 .

The heart of the RNAi mechanism RNAi 机制的核心是: 机制的核心是:
1. Dicer: an RNaseIII-like multidomain ribonuclease that first processes input dsRNA into small fragments called short interfering RNAs (siRNAs) or microRNAs (miRNA). Dicer then helps load its small RNA products into RISC. 2. RISC (RNA induced silencing complexes) (RNA诱导的沉默复合物 a large multiprotein 诱导的沉默复合物): 诱导的沉默复合物 complex that direct the bound siRNA or miRNA to its target and inhibit the target gene expression.

在起始步骤,加入的dsRNA被Dicer酶切割为 21-23核苷酸长的小分子干扰RNA片段

RNAi 机制 模式图

在RNAi效应阶段,siRNA双链结合一个核 酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物 (RNA-induced silencing complex, or RISC)

激活RISC需要一个ATP依赖的将siRNA解双 链的过程

激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA 转录本上

并在距离siRNA3'端12个碱基的位置切割 mRNA

RNA干扰研究的一般流程 干扰研究的一般流程
确定目的基因

根据相对应的核酸序列设计出 siRNA的序列 的序列

获得siRNA 获得

用siRNA转染细胞 转染细胞

分析RNA干扰的效果 干扰的效果 分析

siRNA的设计--I 的设计-- 的设计--
siRNA的一般结构: 的一般结构: 的一般结构 哺乳动物: 哺乳动物:21-23bp dsRNA
(UU)dTdT dTdT(UU)

非哺乳动物:长片段 非哺乳动物:长片段dsRNA

siRNA的设计--II 的设计-- 的设计--
如何选择siRNA靶位点: 如何选择 靶位点: 靶位点 1、从转录本AUG起始密码子开始,搜寻下游 序列, 、从转录本 起始密码子开始, 序列, 起始密码子开始 搜寻下游AA序列 记录跟每个 每个AA 3’端相邻的 个核苷酸作为候选的 端相邻的19个核苷酸 记录跟每个 端相邻的 个核苷酸作为候选的 siRNA靶位点。 靶位点。 靶位点 2、研究结果显示GC含量在 、研究结果显示 含量在30%—50%左右的siRNA要 左右的 含量在 左右 要 比那些GC含量偏高的更为有效。 含量偏高的更为有效。 比那些 含量偏高的更为有效 3、在设计siRNA时不要针对 和3’端的非编码区 、在设计 时不要针对5’和 ’ (untranslated regions,UTRs),原因是这些地方有丰 , , 富的调控蛋白结合区域,而这些UTR结合蛋白或者翻译 富的调控蛋白结合区域,而这些 结合蛋白或者翻译 起始复合物可能会影响RISC结合 结合mRNA,从而影响 从而影响siRNA 起始复合物可能会影响 结合 从而影响 的干扰效果。 的干扰效果。

序列同源性分析: 序列同源性分析: 序列和相应的基因组数据库( 将siRNA序列和相应的基因组数据库(人,或者小 序列和相应的基因组数据库 大鼠等等)进行比较, 鼠,大鼠等等)进行比较,排除那些和其他编码序列 / EST同源的序列。例如进行 同源的序列。 同源的序列 例如进行BLAST搜索分析 搜索分析 ( www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) ) 选出合适的目标序列进行合成 并非所有符合条件的siRNA都一样有效,其原因还不 都一样有效, 并非所有符合条件的 都一样有效 清楚,可能是位置效应的结果, 清楚,可能是位置效应的结果,因此对于一个目的基 一般要选择3-5个靶位点来设计 个靶位点来设计siRNA 因,一般要选择 个靶位点来设计 设计阴性对照 通常的做法是将选中的siRNA序列打乱,同样要检查 序列打乱, 通常的做法是将选中的 序列打乱 结果以保证它和其他基因没有同源性。 结果以保证它和其他基因没有同源性。或者用 housekeeping genes 作对照 作对照.

补充: 补充:
Whitehead 研究所已研发了siRNA的自动选择方法,并于 网站:http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNA/home.php 上向公 众开放.这个软件允许使用者定义序列基序和G/C含量, 并自动在人和鼠的基因组数据库中搜索siRNA序列,以 防错配。 http://www.genesil.com/docs/index.asp?toPage=1&mySort=5

疑难解答: 疑难解答:
? 假如siRNA不起作用,应首先确定所使用的靶序列和细胞是 否来源于相同的组织。是否使用了错误的细胞系。 ? 应确定用于进行RNAi的siRNA双链对选择的mRNA序列是否 可靠的,因后者可能包含序列上的错误、突变(如在癌细胞 中)或存在多态性。

siRNA的合成 的合成
体外转录法合成 siRNA
双链 RNA合成 合成 非特异siRNA合成 合成 非特异

体内转录合成 siRNA
siRNA表达载体在细胞中表达 表达载体在细胞中表达siRNAs 表达载体在细胞中表达 制备siRNA表达框进行体内转录 以PCR制备 制备 表达框进行体内转录 利用病毒系统实现体内表达siRNA 利用病毒系统实现体内表达 优点:不需要直接操作 优点:不需要直接操作RNA

siRNA construction procedure
引导序列

T7启动引物 启动引物

通过高效的体外转录合成siRNA 通过高效的体外转录合成
DuraScribe? T7 Transcription Kit
使用了特殊的T7 RNA 聚合酶,可以2’-F-UTP 和 2’-F-CTP为底物,生成带有氟修饰的RNA--- DuraScribe RNA

? 这种带有修饰的RNA可以很好的 抵抗RNase A ? 双链的DuraScribe RNA可以被 RNase III 消化。 ? DuraScribe RNA不需要转染试 剂就可进入细胞,并且无需去除 血清。 ? 双链oligo DNA, 线形质粒, PCR产物都可以用作转录模板。 产量,50ug/20ul
Inhibition of HIV-1 Infection by Small Interfering RNA-Mediated RNA Interference1 John Capodici*, Katalin Karikó and Drew Weissman2,* The Journal of Immunology, 2002, 169: 5196-5201.

非特异性siRNA合成 合成 非特异性
----ShortCut RNAi Kit
大肠杆菌RNase III是一种识别双链 RNA的内切酶,产物为 3’ 的内切酶, 大肠杆菌 是一种识别双链 的内切酶 ’ 端外悬2-3个碱基的双链短片段 个碱基的双链短片段, 在真核生物RNAi途径中相 端外悬 个碱基的双链短片段,与 Dicer在真核生物 在真核生物 途径中相 利用RNase III 消化得到的 消化得到的siRNA混合物直接转染细胞,通常能 混合物直接转染细胞, 同。利用 混合物直接转染细胞 够保证目的基因被有效地抑制。 够保证目的基因被有效地抑制。

优点: 优点:可以跳过检测和筛选有效 siRNA序列的步骤,为研究人员节 序列的步骤, 序列的步骤 省时间和金钱。 省时间和金钱。

缺点: 缺点:有可能引发非特异的基因沉 默,特别是同源或者是密切相关的 基因。 基因。

消化长片断双链RNA制备 制备siRNA 用RNase III 消化长片断双链 制备
Figure 2: siRNA production by ShortCut RNase III: (A) Varying amounts of ShortCut RNase III were incubated with 2 ?g of a 500 bp dsRNA for 20 minutes. (B) dsRNA fragments (1 kb and 175 bp) were digested with ShortCut RNase III. Digests were analyzed by 20% TBE polyacrylamide gel electrophoresis.

Figure 3: GFP Silencing in COS-7 Cells: COS-7 cells cotransfected with a plasmid expressing GFP in the absence (control) or the presence of 30 ng (4 nM) of GFP siRNA prepared using the ShortCut RNAi Kit. Cells were photographed 48 hours post-transfection.
Control ShortCut siRNA (4 nM)

体内转录合成 siRNA
siRNA表达载体在细胞中表达 表达载体在细胞中表达siRNAs 表达载体在细胞中表达 制备的siRNA表达框进行体内转录 以PCR制备的 制备的 表达框进行体内转录 利用病毒系统实现体内表达siRNA 利用病毒系统实现体内表达 优点:不需要直接操作 优点:不需要直接操作RNA

siRNA表达载体 表达载体
BD Knockout RNAi vectors

The DNA vector-based RNA interference (RNAi) technology

BD? Knockout Adenoviral RNAi Systems
?BD? Knockout Adenoviral RNAi Systems 系统能快速、方便的形成表达 发夹结构的siRNA的重组腺病毒,从而有效的侵染到各种宿主细胞。 ?BD Knockout Adenoviral RNAi System 1使用RNAi-ready pSIREN Shuttle vector,通过酶切连接构建腺病毒DNA质粒。可感染分裂及非分裂 细胞,宿主细胞范围广,可实现高水平表达。能感染难以转染的细胞。

User defined sequence for RNAi

Sense U6 Pro

Anti Sense

TTTTT
Spacer

I-Ceu I

PI-SceI

pSIREN-Shuttle
Kan R pUC ori

siRNA表达载体 表达载体
BD Knockout RNAi vectors

pSIREN 载体分为两种:pSIREN-Shuttle和pSIREN-RetroQ。pSIREN 载体带有U6启动 子,均为线性载体,pSIREN-RetroQ载体带有真核筛选标记----嘌呤霉素抗性基因

pSIREN-Shuttle可以进一步应用于构建腺病毒载体; pSIREN-RetroQ可以进一步应用于构建逆转录病毒载体,应用于感染难以转 染的细胞。

pSIREN vectors: PlasmidViralDual Plasmid- and Viral-based shRNA Vectors pSIRENShuttle pSIRENRetro Q pSIRENDNR

5.0E+06

1: CMV-Luc only 2: + αLuc shRNA 3: + Neg control n=3

RUL Luciferase

4.0E+06 3.0E+06 2.0E+06 1.0E+06 0.0E+00

1 2 1 Luciferase β-actin 2

3 3

1 1

2 3 2 3 1

1 2

2

3 3

siRNA表达框进行体内转录 表达框进行体内转录
siRNA表达框架 表达框架(siRNA expresion casetes,SECs)是 表达框架 , 是 一种由PCR得到的 得到的siRNA表达模板,能够直接导入细 表达模板, 一种由 得到的 表达模板 胞进行表达而无需事前克隆到载体中。 胞进行表达而无需事前克隆到载体中。

表达框架包括: 表达框架包括: 一个RNA pol III启动子
一段发夹结构siRNA 一个RNA pol III终止位点
优点: 不需要载体克隆、 优点:SECs不需要载体克隆、测序等颇 不需要载体克隆 为费时的步骤,可以直接由PCR得到。 得到。 为费时的步骤,可以直接由 得到 SECs成为筛选 成为筛选siRNA最有效工具。 最有效工具。 成为筛选 最有效工具 缺点: 产物难以转染入细胞、 缺点:PCR产物难以转染入细胞、不适合大规模制备。 产物难以转染入细胞 不适合大规模制备。

总结5种不同的制备 的方法。 总结 种不同的制备siRNA的方法。 的方法
化学合成 体外转录 RNase III降解 降解 dsRNA 转录模版 (2001000bp,两侧带 T7 启动子) 1 天 + 转录模版制 备时间 中等 不需要 siRNA 表达载体 PCR 表达框

比较项目

材料需求

21-mer RNA oligos(一对)

29-mer DNA oligos( 一对) 24 小时 + DNA oligo合成时间 中等 需要

55-60-mer DNA oligos(一对) 5天以上 + DNA oligo合成时间 多 需要

~50-mer DNA oligos(一对)

全部制备/合成时间所需时 间 个人所需操作时间 是否需要验证和寻找最有 效siRNA 能否标记siRNA (例如用于 荧光显微镜分析siRNA进入 细胞过程或者在细胞中的 定位) 转染的相对难易程度 可筛选性 (例如抗生素筛选) 能否用于长效抑制 能否大规模制备 检测总体转染效率 每个基因的相对费用(不 包含人力)

4天—2周 几乎不需要* 需要

~ 6 小时 + DNA oligo合成时间 中等 需要







不能

不能

好 不可以 不可以 可以 不可以 高

好 不可以 不可以 有限 不可以 中等

好 不可以 不可以 有限 不可以 低

差 可以 可以(抗生素筛 选) 可以 可以 中等

差 不可以 不可以 有限 不可以 中等

*取决于合成后是否包含纯化、去保护,以及厂家提供的是已经退火的即用型双链还是冻干的单链

Nitrite amount
JNK siRNA Interferen in IMG Cell LIne(08/06/03)
0.4 control 0.35 Nitrite Amount in OD570 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 JNK-1 JNK-2 JNK-3 GAPDH Mock LI

iNOS

SiRNA 的 转 染

RNAiFect Transfection Reagent
siRNA 转染专用试剂,使用简单。 转染专用试剂,使用简单。

磷酸钙共沉淀; 电穿孔法; 转染方法: 1 磷酸钙共沉淀 2 电穿孔法 3 DEAE-葡聚糖 葡聚糖 4 机械法 5 阳离子脂质体试剂

注意事项: 注意事项:
1 3 纯化 siRNA ; 细胞培养和操作严格 2 4 6 避免RNA酶污染 酶污染 避免 避免使用抗菌素 合适的阳性对照

5 选择合适的转染试剂

7 通过标记 通过标记siRNA来优化实验 来优化实验

Fig 3. Effects of mex-3 RNA interference on mexlevels of the endogenous mRNA (in situ
hybridization in embryos) (胚胎的原位杂交 胚胎的原位杂交). 胚胎的原位杂交
No hybridization and staining + hybridization (endogenous mex-3 RNA)

+antisense +hybridization

+ds mex-3 RNA +hybridization

adult body wall at

RNAi的应用
一、研究基因功能

二、研究信号传导通路

三、基因治疗

MicroRNAs

MicroRNA (miRNA): A New Class of Small RNA Molecules
? siRNA—小干扰RNA ? stRNA--- 小时序RNA ? miRNA--- microRNA It appears that “ tiny RNA world” may not be so tiny after all

What is miRNAs
miRNAs的研究起始于时序调控小 的研究起始于时序调控小RNA(stRNAs)。 的研究起始于时序调控小 ( )。 miRNAs参与生命过程中一系列的重要进程,包括发育进程 参与生命过程中一系列的重要进程, 参与生命过程中一系列的重要进程 造血过程,器官形成,凋亡,细胞增殖, ,造血过程,器官形成,凋亡,细胞增殖,甚至是肿瘤发生 (Kim, 2005)。 。

miRNAs具有稳定的特异性序列以调节基因表达。2001 具有稳定的特异性序列以调节基因表达。 具有稳定的特异性序列以调节基因表达 年,miRNAs作为线虫生长发育过程中的调节器而被发现 作为线虫生长发育过程中的调节器而被发现 在病毒、植物和动物体中, ,在病毒、植物和动物体中,miRNAs已被公认为主要的 已被公认为主要的 调控基因家族之一,通过mRNA靶向作用降解或抑制其翻 调控基因家族之一,通过 靶向作用降解或抑制其翻 译。

What is miRNAs
miRNAs 的特点: 的特点:
1、miRNAs是一种 -25nt长的单链小分子 、 是一种18- 长的单链小分子RNA,广泛存 是一种 长的单链小分子 广泛存 在于真核生物中,是一组不编码蛋白质的短序列RNA, 在于真核生物中,是一组不编码蛋白质的短序列 , 它本身不具有开放阅读框( 它本身不具有开放阅读框(ORF); ); 2、成熟的miRNAs,是由具有发夹结构的约70-90个碱基大 、成熟的 ,是由具有发夹结构的约 个碱基大 发夹结构的约 小的单链RNA前体经过 前体经过Dicer酶加工后生成,成熟的 酶加工后生成, 小的单链 前体经过 酶加工后生成 miRNAs 5’-端的磷酸基团和 ?-端羟基是它与相同长度的 端的磷酸基团和3? 端的磷酸基团和 端羟基是它与相同长度的 功能RNA降解片段的区分标志。 降解片段的区分标志。 功能 降解片段的区分标志 3、miRNA基因常以单拷贝、多拷贝或基因簇等多种 、 基因常以单拷贝、 基因常以单拷贝 形式存在于基因中。 位于基因间隔区, 形式存在于基因中。70%~90% 位于基因间隔区, ~ 其余在内含子,极少数在蛋白编码区。 其余在内含子,极少数在蛋白编码区。
(参阅:“中国生物化学与分子生物学报”2010,26:1) 参阅: 中国生物化学与分子生物学报” 参阅 , :

4、miRNA不仅在结构上保守,而且在物种间具有高度 、 不仅在结构上保守, 不仅在结构上保守 的进化保守。( 端的2—8个核苷酸有一定保守性) 。(5’端的 个核苷酸有一定保守性) 的进化保守。( 端的 个核苷酸有一定保守性

5、miRNA具有明显的时空特异性及组织特异性。目前 具有明显的时空特异性及组织特异性。 具有明显的时空特异性及组织特异性 呈时间特异性表达; 研究较清楚的 lin-4与lin-7呈时间特异性表达;miR-1 与 呈时间特异性表达 在肌肉组织中特异表达,并且调控肌肉组织的生长、 在肌肉组织中特异表达,并且调控肌肉组织的生长、 分化。 分化。

与siRNA的比较 的比较
1、共同之处:长度(22nt);依赖 、共同之处:长度( );依赖 酶加工; );依赖Diser酶加工;由双 酶加工 前体形成; 链RNA或RNA前体形成;都形成 或 前体形成 都形成RISC;作用方式相同。 ;作用方式相同。
(参阅:“中国生物化学与分子生物学报”2010,26:1) 参阅: 中国生物化学与分子生物学报” , : 参阅

2、miRNA和siRNA的差异: 和 的差异: 的差异 来源区别: 内源; ⑴ 来源区别: miRNA----内源; siRNA---外源 内源 外源 结构区别: 前体miRNA→折叠发夹结构 ⑵ 结构区别:miRNA----前体 前体 折叠发夹结构 siRNA---完全互补的双链切断,也可发夹结构 完全互补的双链切断, 完全互补的双链切断 作用位点: 靶基因3’-UTR区、ORF内 ⑶ 作用位点:miRNA----靶基因 靶基因 区 内 siRNA-----可设计或改变,mRNA任何部位 可设计或改变, 任何部位 可设计或改变 作用方式: 与靶序列互补低, ⑷ 作用方式:miRNA----与靶序列互补低,阻止 与靶序列互补低 阻止mRNA翻译 翻译 siRNA----与靶序列互补高,助于 与靶序列互补高, 与靶序列互补高 助于mRNA降解 降解 ⑸ 功能区别:miRNA----调节生物体的生命过程(生长、发育 功能区别: 调节生物体的生命过程(生长、 调节生物体的生命过程 代谢、应激、凋亡等等) 代谢、应激、凋亡等等) siRNA----生物体抵抗外来核酸侵入的意义 生物体抵抗外来核酸侵入的意义
(参阅:“中国生物化学与分子生物学报”2010,26:1) 参阅: 中国生物化学与分子生物学报” , : 参阅

siRNA 与miRNA的比较 的比较
相同点/联系点 相同点 联系点 长度及特征 合成的底物 siRNA miRNA

都约在22nt左右,5’端是磷酸基,3'端是羟基 左右, 端是磷酸基 端是磷酸基, ' 都约在 左右 miRNA和siRNA合成都是由双链的 和 合成都是由双链的RNA或RNA前体 合成都是由双链的 或 前体 形成的 依赖Dicer酶的加工,是Dicer的产物,所以具有 酶的加工, 的产物, 依赖 酶的加工 的产物 所以具有Dicer 产物的特点 都需要Argonaute家族蛋白参与 家族蛋白参与 都需要 二者都是RISC组分,所以其功能界限变得不清晰, 组分,所以其功能界限变得不清晰, 二者都是 组分 如二者在介导沉默机制上有重叠;产生了on target和 如二者在介导沉默机制上有重叠;产生了 和 off target的问题 的问题 都可以阻遏靶标基因的翻译,也可以导致 都可以阻遏靶标基因的翻译,也可以导致mRNA降 降 解,即在转录水平后和翻译水平起作用 可能的两种推论: 的补充, 可能的两种推论:siRNA是miRNA的补充,miRNA 是 的补充 在进化过程中

Dicer酶 酶 Argonaute家族蛋白 家族蛋白 RISC组分 组分

作用方式

进化关系

不同点/分歧点 不同点 分歧点 机制性质

siRNA 往往是外源引起的, 往往是外源引起的,如病毒感染 和人工插入dsRNA之后诱导而产 和人工插入 之后诱导而产 生,属于异常情况 长链dsRNA 长链 siRNA是双链 是双链RNA,3‘端有 个非 端有2个非 是双链 , 端有 配对碱基,通常为UU 配对碱基,通常为 较高,一个突变容易引起 较高,一个突变容易引起RNAi沉 沉 默效应的改变 RNAi途径 途径 酶切割下产生; 由dsDNA在Dicer酶切割下产生 在 酶切割下产生 发生在细胞质中

miRNA 是生物体自身的一套正常的调控机 制 发夹状pre-miRNA 发夹状 miRNA是单链 是单链RNA 是单链 相对较低,一个突变不影响 相对较低,一个突变不影响miRNA 的效应 miRNA途径 途径 pri-miRNA在核内由一种称为 在核内由一种称为 Drosha酶处理后成 酶处理后成60nt的带有茎环 酶处理后成 的带有茎环 结构的Precursor miRNAs (pre结构的 miRNAs);这些 ;这些pre-miRNAs在转运 在转运 到细胞核外之后再由Dicer酶进行处 到细胞核外之后再由 酶进行处 酶切后成为成熟的miRNAs;发 理,酶切后成为成熟的 ; 生在细胞核和细胞质中 各有不同的AGO蛋白质 蛋白质 各有不同的 不完全互补, 不完全互补,存在错配现象 miRISCs/miRNP

直接来源 分子结构 对靶RNA特异性 特异性 对靶 作用方式 生物合成, 生物合成,成熟过程

Argonaute (AGO) 蛋白质 互补性complementarity) ) 互补性 RISCs的分子量不同 的分子量不同 (Martinez and Tuschl, 2004; Martinez et al., 2002; Nykanen et al., 2001; Pham et al., 2004)

各有不同的AGO蛋白质 蛋白质 各有不同的 一般要求完全互补 siRISCs

各自的生物学 功能不同

ⅰ抵抗病毒的防御机制(Pfeffer et al., 2004; 抵抗病毒的防御机制 Ding et al., 2004);ⅱ沉默那些过分表达的 ; mRNA;ⅲ保护基因组免受转座子的破坏 ; (Mello and Conte, Jr., 2004; Hannon, 2002; Tabara et al., 1999)-9; ; 高度特异性 单链的siRNA结合到 结合到RISC复合物中,引导复 复合物中, 单链的 结合到 复合物中 合物与mRNA完全互补,通过其自身的解旋 完全互补, 合物与 完全互补 酶活性,解开siRNAs,通过反义 酶活性,解开 ,通过反义siRNA链识 链识 别目的mRNA片段,通过内切酶活性切割目 片段, 别目的 片段 的片段, 的片段,接着再通过细胞外切酶进一步降解 目的片段。同时, 也可以阻遏3′UTR 目的片段。同时,siRNA也可以阻遏 也可以阻遏 具有短片断互补的mRNA的翻译(off target 的翻译( 具有短片断互补的 的翻译 )。

对有机体的生长发育有重要作用 (Rhoades et al., 2002)

重要特性 作用机制

高度的保守性、 高度的保守性、时序性和组织特异性 成熟的miRNAs则是通过与 则是通过与miRNP核 成熟的 则是通过与 核 蛋白体复合物结合,识别靶mRNA, 蛋白体复合物结合,识别靶 , 并与之发生部分互补, 并与之发生部分互补,从而阻遏靶 mRNA的翻译。在动物中,成熟的单 的翻译。 的翻译 在动物中, 与蛋白质复合物miRNP结 链miRNAs与蛋白质复合物 与蛋白质复合物 结 合,引导这种复合物通过部分互补结 合到mRNA的3′UTR(非编码区域) 合到 的 (非编码区域) 从而阻遏翻译。除此之外, ,从而阻遏翻译。除此之外,miRNA 也可以切割完全互补的mRNA。 也可以切割完全互补的 。 miRNA是不对称加工,miRNA仅是剪 是不对称加工, 是不对称加工 仅是剪 的一个侧臂, 切pre-miRNA的一个侧臂,其他部分 的一个侧臂 降解。 降解。 代谢的各个层面进行调控; 在RNA代谢的各个层面进行调控;与 代谢的各个层面进行调控 mRNA的稳定性无关 的稳定性无关 miRNA主要作用于靶标基因 ?-UTR区 主要作用于靶标基因3? 主要作用于靶标基因 区 miRNA主要在发育过程中起作用,调 主要在发育过程中起作用, 主要在发育过程中起作用 节内源基因表达

加工过程

siRNA对称地来源于双链 对称地来源于双链RNA的前体的两侧 对称地来源于双链 的前体的两侧 臂 降解目标mRNA;影响mRNA的稳定性 ;影响 降解目标 的稳定性 siRNA可作用于 可作用于mRNA的任何部位 可作用于 的任何部位 siRNA不参与生物生长,是RNAi的产物,原 不参与生物生长, 的产物, 不参与生物生长 的产物 始作用是抑制转座子活性和病毒感染

对RNA的影响 的影响 作用位置 生物学意义

miRNAs 作用 原 理:

(RNA聚合酶 转录 聚合酶II转录 初产物) 聚合酶 转录miRNA初产物 初产物

(转运蛋白) 转运蛋白)

(siRNA)

miRNA 的作用方式: 的作用方式:
1、负向调节—沉默基因表达: 、负向调节 沉默基因表达 沉默基因表达: 发生在哺乳动物系统) 发生在哺乳动物系统 模式: ) 模式:(1)翻译抑制 (发生在哺乳动物系统 发生在植物系统) (2)靶基因降解 (发生在植物系统) ) 2、正向调节: (不常见) 、正向调节: 不常见)
例如:人类肝脏特异表达的miRNA(miR-122),可 例如:人类肝脏特异表达的miRNA(miR-122),可 miRNA ), 结合到肝炎病毒基因组的5 -UTR, 结合到肝炎病毒基因组的5’-UTR,引起病毒 RNA的剧增 但其机制仍不明。 的剧增, RNA的剧增,但其机制仍不明。

miRNAs的表达调控: 的表达调控: 的表达调控
RNA聚合酶II催化产生的miRNA有帽子、polyA尾巴 有帽子、 有帽子 尾巴 及具有相应的剪接方式。部分miRNA与mRNA一样 及具有相应的剪接方式。部分 与 一样 也处于转录因子的控制下,并受内外环境影响。 也处于转录因子的控制下,并受内外环境影响。 例如:目前研究热点: 例如:目前研究热点 转录因子“缺氧诱导因子( 转录因子“缺氧诱导因子(hypoxia induce fector HIF) 参与调控40%-50% miRNA的启动子 参与调控 的启动子

(参阅:“中国生物化学与分子生物学报”2010,26:1) 参阅: 中国生物化学与分子生物学报” 参阅 , :

预测:人类基因组, 预测:人类基因组,约30%mRNA有miRNA 有 参与其调控; 参与其调控; 人类已有600多种 多种miRNA被鉴定(参阅 人类已有 多种 被鉴定 httpa://microrna.sanger.ac.uk),且每个 ) miRNA可结合多个靶 miRNA可结合多个靶mRNA。 可结合多个靶mRNA。

(参阅:“中国生物化学与分子生物学报”2010,26:1) 参阅: 中国生物化学与分子生物学报” 参阅 , :

RNAi技术的应用展望 RNAi技术的应用展望
一. 外源RNA诱导RNAi的应用
基因功能研究 蛋白表达调控,信号传导通路,发育过程 … 基因治疗及药物筛选探索 基因治疗及药物筛选探索 治疗细胞异常增殖相关的疾病,抗病毒治疗 药物靶位点鉴定 制备功能缺失表型

二、待解决的问题: 待解决的问题
1, 短干扰性 短干扰性RNA(siRNA)指导基因沉默到达靶序列 但它 指导基因沉默到达靶序列,但它 指导基因沉默到达靶序列 对转录组和基因组是如何起效应的? 对转录组和基因组是如何起效应的 2, RNA 介导沉默复合物中哪种蛋白质与 介导沉默复合物中哪种蛋白质与siRNA发生作用 哪 发生作用, 发生作用 种成分是催化和功能性的核心? 种成分是催化和功能性的核心 3, siRNA生成是 生成是Dicer酶的作用 但Dicer如何受到调节 如何识别 酶的作用,但 如何受到调节,如何识别 生成是 酶的作用 如何受到调节 不同结构的dsRNA底物 如何促使 底物,如何促使 形成效应复合物? 不同结构的 底物 如何促使siRNA形成效应复合物 形成效应复合物

展望: 展望
三. 内源RNAi机制及功能研究 1. 抗病毒功能 4. 转座子沉默 2. 基因调控 5. 基因组重组 3. 染色质浓缩

? 作为实验工具使生物学研究发生革命性变化 ? siRNA 文库的建立,将能快速高效地研究几乎每一个决定特异 生物学表型的基因的功能. ? 作为传统遗传学工具的补充,提供更快速高效的方法以减少 成活动物的亚效等位基因突变效应 ? 实现RNA干扰作为分析和构建疾病模型的工具向疾病治疗 工具的转变等.

Thank you

寡腺苷酸合成酶

获得RNAi生物化学通路的大致过程 获得 生物化学通路的大致过程: 生物化学通路的大致过程
1、检测RNAi 每一步的ATP依赖性 2、使用通路中的中间物启动RNAi 3、用经典的生化分级分离方法分离RNAi所需的蛋白 酶和蛋白-RNA复合物 4、将通路分割成若干个部分,最终提示出RNAi的关 键步骤。

RNAi的关键步骤:
体外实验证实: 1、dsRNA确实能识别并破坏相应的mRNA。无细胞 抽提物研究表明,RISC相关活性能完全破坏mRNA 分子。 2、长的dsRNA进入果蝇胚胎中即被剪切成含21-23 个 核苷酸的小的干扰性RNA(siRNA)。 3、siRAN是RNAi通路的真正中间体,它能指导 RISC 破坏靶 mRNA。 4、siRNA指导的RISC能指导核酸内切酶切割RNA分子 中的某一磷酸二酯键,而该磷酸二酯键在靶分子上 的位置可根据siRAN 来确定。

线虫中的随机降解性PCR模型 线虫中的随机降解性 随机降解性 模型
由于少量的双链RNA就能阻断基因的表达,并且这种 就能阻断基因的表达, 由于少量的双链 就能阻断基因的表达 效应可以传递到子代细胞中,细胞内存在RNAi效应的 效应可以传递到子代细胞中,细胞内存在 效应的 扩增系统。 扩增系统。 真核细胞中存在能以 聚合酶, 真核细胞中存在能以RNA-指导的 RNA 聚合酶, 指导的 (RNA-directed RNA polymerase,RdRP)。 , ) 的作用下, 通过Dcier 在RdRP的作用下,进入细胞内的双链 的作用下 进入细胞内的双链RNA,通过 通过 形成siRNA, siRNA可以作为 形成 可以作为RdRP的引物 通过类似 的引物, 可以作为 的引物 PCR的反应过程,呈指数级的数量扩增 产生 的反应过程, 的反应过程 呈指数级的数量扩增, 产生siRNA。 。 降解性PCR (degradative PCR). 即降解性


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