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分子生物学基本实验


分子生物学实验技术

主要内容
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分子生物学相关实验技术) 基因定位与克隆

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基因的表达与功能研究
转基因相关技术

基本实验技术内容
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1、DNA和RNA的提取技术 2、RT-PCR技术 3、琼脂糖和聚丙烯酰氨凝胶电泳技术 4 、农杆菌和大肠杆菌感受态细胞的制备 5、质粒DNA的转化技术 6、质粒DNA的提取 7 、DNA的限制性内切酶酶切技术 8、GUS染色技术

1、DNA的提取
常用的方法:
简易水煮法:用于基因定位的大群体植株的DNA提取 SDS法:杂质多,溶解数天后,杂质可降解,适于 普通的PCR反应。 CTAB法;纯度高,主要用于shouthern 杂交等的酶

切反应。

DNA提取的原理
利用液氮对植物组织进行研磨,从而破碎细 胞;细胞提取液中含有的SDS或CTAB溶解膜蛋白而 破坏细胞膜,使蛋白质变性而沉淀下来;EDTA抑 制DNA酶的活性,防止DNA降解;大量提取时用氯仿: 异戊醇(24:1)抽提的方法去除蛋白(小量提取

时可省略此步骤),得到的DNA溶液经异丙醇沉
淀而得到DNA。

简易水煮法
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(l)取水稻新鲜叶片少许剪成1一2mm2左右的小 块,放入1.5ml离心管 (2)加入100ul10.25M的NaOH,沸水浴30s; (3)再加入100ul0.25MHCI和50ul1MTris一CI, 沸水浴2min; (4)溶液直接用于后续实验或6000rpm离心后取 上清液。

SDS大量提取法
(1)取3至5克新鲜的水稻叶片,剪碎,放入干净的研钵中,倒入液氮, 快速磨碎叶片至粉末状。 (2)将研碎的叶片粉末转入一个50ml的离心管,加入15至20ml在65℃预 热的SDS提取液,摇匀,使叶片粉末悬浮在提取液中,充分接触提取 液,然后将离心管放入65℃水浴锅中保温20-30分钟,保温期间要 将离心管上下颠倒数次,以使反应充分完全。 (3)取出离心管,加入5ml醋酸钾(pH6.5),颠倒混匀,然后冰浴20分 钟,冰浴期间要将离心管上下颠倒数次。 (4)取出离心管加入10至15ml氯仿,然后4200转/分,离心15分钟。 (5)将上清液转入另一干净的50ml离心管中,加入等体积的异丙醇,轻 轻摇晃直至形成DNA絮状沉淀,再臵于-20℃30分钟,使DNA完全沉 淀出来,然后用玻璃棒将DNA挑出。 (6)用70%的无水乙醇清洗两次,将酒精倒掉,在超净工作台上吹干, 按提取DNA量的多少加适量的TE溶液,存于-20℃备用。

SDS小量提取法
(1)取水稻样本新鲜叶片3-4 cm左右于1.5ml eppondorf管中, 加入液氮磨碎。 (2)加入700μl已预热至65 ℃的SDS提取液,迅速搅匀后臵于 65℃水浴中,温浴30min。 (3)加入200μl 5 M KAC混合液,颠倒充分混匀,冰浴30min后, 常温 10000rpm 离心5min,将上清液倒入另一新的1.5ml eppondorf管中。 (4)加入等体积的异丙醇,臵于-20 ℃静臵30min,常温 10000rpm 离心5min。 (5)弃上清,加入70%乙醇清洗,于超净工作台吹干(时间不能 太长,太干DNA不容易溶解)。 (6)根据DNA提取的效果,将风干的DNA溶于50-100μl TE溶液中 溶解2-4天,然后存于-20 ℃备用 。

CTAB法提取DNA
(1)称取新鲜叶片5g,剪碎放入研钵中,在液氮中研成粉末。 (2)将粉末转移到预冷的50ml离心管中,加入适量预热至100 ℃ 1.5×CTAB 抽提液,迅速搅匀后置于56 ℃水浴锅中温浴20分钟。 (3)取出离心管,冷却至室温,将混合液倒入另外一支50ml离心管中,加

入20ml氯仿/异戊醇(24:1),充分混匀,室温下4000rpm离心20分钟。
(4)将上清液转移至另一新的50ml离心管,加入1/10体积10%CTAB和等体 积 的氯仿/异戊醇,充分混匀,4000rpm离心20分钟。 (5)转移上清液至另一新的50ml离心管,加入等量的1%CTAB沉淀液,轻轻 摇晃直至形成DNA絮状沉淀,3000rpm离心10分钟,使DNA沉淀于管底。 (6)加入3ml 1N NaCl 及5ul RNase A ,置于56 OC水浴中过夜。待DNA完全 溶 解后,加6ml 95%冰乙醇使DNA沉淀,挑出DNA,用76%乙醇清洗30分 钟,再用95%乙醇浸泡5分钟。 (7)将风干的DNA溶于1ml TE溶液中,4 ℃储存备用。

CTAB 溶液配方
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1.5 % CTAB提取液 1.5% CTAB 25 g CTAB粉末 75 mM tris-HCl 75 ml 1M tris-HCl, pH8.0 15 mM EDTA 30 ml 0.5M EDTA, pH8.0 1.05 M NaCl 61.4 g NaCl 10% CTAB CTAB粉末 100 g NaCl 40.95 g 加水至1000 ml CTAB沉淀液(1%CTAB) 1% CTAB 10 g CTAB粉末 50 mM tris-HCl 50 ml 1M tris-HCl, pH8.0 10 mM EDTA 20 ml 0.5M EDTA, pH8.0 TE (pH8.0) 10 mM tris-HCl 5 ml 1M tris-HCl, pH8.0 1 mM EDTA 1 ml 0.5M EDTA, pH8.0

CTAB中各个组分的作用
CTAB提取缓冲液的经典配方
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Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏; EDTA螯合Mg2+离子或Mn2+离子,抑制DNase活性;

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NaCl 提供一个高盐环境,使DNA充分溶解,存在于液相中;
CTAB溶解细胞膜,并结合核酸,使核酸便于分离;

β-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,
使酚容易去除。

除酚类物质:
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在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂:β-巯基乙醇、 抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等。

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加入易与酚类结合的试剂:如PVP(聚乙烯基吡咯烷 酮 )、PEG(聚乙二醇),它们与酚类有较强的亲和 力,可防止酚类与DNA的结合。

应注意的问题
1、最好使用新鲜材料,低温保存的样品材料不要反复冻融。 2、研磨样品时要有液氮的保护,在整个过程中都不要让液氮挥发 干净。避免材料回温和反复冻融带来的降解。此外尽量将样品研磨 的很细,这样可以提高DNA产量。 3、材料应适量,过多会影响裂解液裂解,导致DNA量少,纯度低。 高温温浴时,定时轻柔振荡。 4、SDS小量提取DNA时,加入SDS(要提前预热),充分混匀,使材 料充分接触液体,然后放入65°C水域锅中,期间要不断颠倒混匀, 加入5molKAC(使用之前放在4°C保存)后,溶液会由褐绿色变成 翠绿色,注意观察颜色地变化是否正常。 5、异丙醇沉淀最好在-20°C沉淀20min以上。离心速度即不能太 高也不能太低,太高DNA容易断裂,太低则不利于DNA的沉淀 6、溶液的配臵是关键,一定要非常认真,准确计算各成分的用量, 要充分溶解固体物质,准确校正pH值。

植物总RNA提取(TRIZOL法)
原理:Trizol即异硫氰酸胍-苯酚法,首先用强变 性剂异硫
氰酸胍裂解细胞,同时使核蛋白复合体中的蛋白变性,释 放出核酸。释放出来的DNA和RNA由于在特定pH时溶解 度不同,分别位于整个体系中的中间相和水相,从而使 DNA和RNA分离开来。进一步通过有机溶剂来抽提沉淀 RNA,就可以得到纯净的RNA。

提取步骤
(1)称取0.5克的植物材料,用液氮磨成细粉,分装于两个1.5ml的 RNase 处理过的离心管中(动作尽量讯速,避免RNA降解)。

(2)每管加入1mlTrizol 用力摇动使混合均匀,室温下放臵5min(注意
样品的量不能超过Trizol的10%)。(对于较难裂解的组织,可以 适当延长裂解时间,如植物组织的根) (3)当样品中蛋白,脂肪,多糖含量较高时,4℃离心,12000转/分 钟,15min,将上清移入干 净的1.5ml的离心管中。 (4)每管加入200ul氯仿,盖紧盖子,用力振荡15S,室温放臵3min, 4℃,12000转/min离心15min。

(5)将上清液吸入干净的1.5ml的离心管中(约600ul),加等体积异丙
醇,颠倒混匀,室温放臵10min,4℃ 12000转/分钟离心10min。 (6)弃上清,加1ml 75%乙醇,振荡,4℃ 7500转/min离心5min。 (7)弃上清,空气干燥10min,加入30-50ul无RNase的水,55-60℃混 合10min,-70℃保存。

RNA提取质量的判定
好的RNA的特征是:
A、RNA应该呈现出3条rRNA带 .分别是28S,18S和5S rRNA 带。 B、28s亮度是18s亮度的一倍,其他比例关系均提示RNA有 一定程度的破坏。 C、不能有多的带出现. 出现多的带有两个可能,一是DNA 污染带,二是rRNA破坏断裂带.

水稻茎 尖RNA

28s RNA 18s RNA 5s RNA

注意事项
RNA是一类极易降解的分子,要得到完整的RNA,必须最大限度地 抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。因此:
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使用的物品均要经过无RNA酶处理等。可直接烘烤的(研钵、药勺、 镍子等)在烘箱中180-200 ℃ 4小时,塑料制品(枪头,离心管等) 可用0.1%的DEPC水37 ℃浸泡12个小时,然后高压灭菌。而氯仿和异 丙醇最好使用新开口的或是RNA专用(无RNA酶污染),70%乙醇用 DEPC水配制。 操作过程中应带口罩,手套。 DEPC有致癌之可能,操作最好在通分橱中进行尽量避免接触皮肤。 提取的RNA可以先不溶解,直接保存在-70°C,使用前再溶解。 检测RNA时要用新鲜的1×TAE,要现用现配,使用的三角瓶,量筒, 制胶的所有东西都要冲洗干净,防止RNA的降解。琼脂糖的浓度在1.5 -2%之间,RNA检测效果较好。

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RT-PCR的简单流程

聚丙烯酰胺凝胶电泳
1、制胶:配制1块6%的聚丙烯酰胺凝胶的药品用 量如下(总体积40ml) 30%丙烯酰胺 8ml 1×TBE 32ml 10%过硫酸铵 260μl TEMED 25μl 2、电泳:350V 电压,约2小时(可根据目的条 带的大小和凝胶的浓度适当调整电泳的时间)

3、固定、银染及显色
(1)固定:电泳完成后,将凝胶臵于固定液中(每 100ml 10%的乙醇加500μl冰醋酸),于水平摇床上 固定5min。 (2)银染:按每100ml固定液加1ml 20%的硝酸银的比 例加入硝酸银溶液,在水平摇床上染色8min。 (3)显色:银染完成后,倒掉染液,用水洗净凝胶, 然后加入显影液(每100ml 3%的NaOH加500μl甲醛), 在水平摇床上显色10min左右。 (4)倒掉显影液,用水洗净凝胶,然后用保鲜膜将凝 胶包好,用于观察和保存。

注意事项
1、聚合前的丙稀酰胺为有毒药品,操作时要注 意安全。 2、通常使用的是6%的聚丙烯酰胺凝胶,如果要 分析几个bp的核酸的差异,可通过提高胶浓度 和延长电泳时间来获得理想的效果。 3、电泳缓冲液用久了要更换,新缓冲液会使凝 胶背景干净,条带清晰,旧缓冲液会使凝胶背 景灰暗,条带模糊。 4、银染完成后,一定要用水清洗干净,直到水 清澈为止。

感受态细胞的制备及转化原理
原理:目前,感受态细胞的制备常用冰预冷的CaCl2处理 细菌的方法制备,即用低渗CaCl2溶液在低温(0℃)时 处理快速生长的细菌,从而获得感受态细菌。此时细菌膨

胀成球形,外源DNA分子在此条件下易形成抗DNA酶的
羟基-钙磷酸复合物粘附在细菌表面,通过热激作用促进 细胞对DNA的吸收。转化效率可达106-107转化子/微克 DNA。

大肠杆菌感受态细胞的制备
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前夜接种受体菌DH5?,挑取单菌落于无抗生素的LB液体培 养基中37℃摇床培养过夜; 取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中,在37℃摇床 上剧烈振荡培养约2.5-3小时; 将0.1M CaCl2溶液臵于冰上预冷;吸取1.4ml培养好的菌 液至1.5ml离心管中,在冰上冷却20min; 4℃,5000rpm冷冻离心10min;弃去上清,加入100?l预冷 0.1M CaCl2溶液,细胞重新悬浮,在冰放臵30min; 4℃,5000rpm冷冻离心10min; 弃去上清,加入100?l预冷0.1M CaCl2溶液,细胞重新悬 浮; 细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂(15% - 20%甘油)后超低温冷冻贮存备用。

根癌农杆菌感受态细胞制备
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挑取单菌落接种于5ml含rif的YEB液体培养基中,28℃, 振荡培养过夜; 取2ml菌液转入50mlYEB液体培养基中,继续培养至OD值为 0.3-0.4 ; 转入无菌离心管,冰浴30min; 5000rpm离心5min,去上清; 加入1ml 20mmol/LCaCl2重悬菌液; 5000rpm离心5min,去上清; 加入200ul 20mmol/L CaCl2重悬菌液, 细胞悬浮液可立即 用于转化实验或添加冷冻保护剂后超低温冷冻贮存备用。

农杆菌目前使用的菌种
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1、EHA105 2、LBA4404 平板培养两种菌种时,差异不大,但当制备感受态细 胞时比较发现: 制备EHA105感受态细胞时,菌种及菌液比较正常,不 易产生结块和沉淀,感受态细胞较容易制备。 制备LBA4404时,发现摇菌后会产生很多的结块,这 是正常的,制备感受态细胞时要用枪头将结块倒碎, 再者,摇菌时,转速要280rpm以上,最好使用大的三 角瓶,使菌液被充分振荡。

大肠杆菌与农杆菌感受态细胞的制备方法比较分析
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1、培养时间不同,大肠杆菌为12-14h,农杆菌为24h左 右。 2、CaCl2使用浓度不同,大肠杆菌为0.1mol/L,农杆菌为 20mmol/L。 3、第二次加入CaCl2后,大肠杆菌要冰上放臵30min,而 农杆菌可直接离心。 4、所有操作都要在冰上进行。 5、最后一步操作CaCl2和甘油先混匀,然后再加入感受态 细胞中,轻轻混匀,可直接存放于-70°C冰箱中,使用 前冰上溶解使用。

注意事项:
1、本实验的关键是选用的细菌必须处于对数生长 期(OD值为0.3-0.4)。 2、实验操作必须在低温下进行。 3、最好用2次摇菌的菌液制备感受态细胞。

感受态细胞的转化
原理:用理化方法诱导细胞,使其处于最适摄取和容纳外 来DNA的生理状态,此时的细胞叫感受态细胞,因而可通 过感受态细胞实现外源DNA的转化。

大肠杆菌细胞的热激法转化
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取出制备好的感受态细胞,放在冰上融化; 每100 ?l感受态细胞加入约5ul连接产物吸打均匀,在 冰上放臵20min; 将离心管放臵42℃水浴,热击60-90秒; 快速将离心管转移至冰浴,放臵1-2min; 复苏:每管加800 ?l 预热至37℃的LB液体培养基,在 37℃摇床温和摇动温育60min; 低速离心收集菌体,弃去部分上清,留100-200ul培养基 将菌体混匀,涂布于含相应抗生素的LB平板; 倒臵培养皿,于37℃培养12-16小时即可观察到转化子。

农杆菌细胞的冻融法转化
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取5 ?l纯化的质粒DNA,加入200ul感受态细胞, 混匀; 冰浴15min,转入液氮冷冻5min,迅速臵37℃水 浴温浴5min; 加入600ulYEB液体培养基,28℃,250r/min预表 达4-5h; 取适当体积均匀涂布于含有抗生素的YEB平板; 28℃培养2天,即可观察到转化子。

大肠杆菌与农杆菌转化方法的比较
1、转入大肠杆菌的一般为中间载体,或连接产物,长出的 转化子不一定为目的转化子,而转入农杆菌的一般为表达 载体,为构建好的质粒表达载体,如果无杂菌污染的情况 下,长出的转化子一般为目的转化子。 2、大肠杆菌是热击的方法将质粒转入感受态细胞中,而农 杆菌则为液氮冻溶法将质粒转入农杆菌感受态细胞中。 3、大肠杆菌平板培养时间为37℃12-16小时,而农杆菌则为 28℃ 48小时。 4、大肠杆菌预表达条件要求比较温和,一般为160- 170r/min,而农杆菌则要求比较剧烈,为250r/min。

质粒DNA的提取原理
原理:碱裂解法提取质粒利用的是共价闭合环状质粒DNA 与线状的染色体DNA片段在拓扑学上的差异来分离它们。

在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内,线状的DNA双螺 旋结构解开变性,在这样的条件下,共价闭环质粒DNA的 氢键虽然断裂,但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧密地 结合在一起。当加入pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液使pH降低 后,共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链迅速而准确地 复性,而线状的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开, 不能迅速而准确地复性,它们缠绕形成网状结构。
通过离心,线状的染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白 质-SDS复合物等一起沉淀下来,而闭合环状质粒DNA却留 在上清液中。

质粒小量提取方法
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取含有质粒的大肠杆菌菌液于LB培养基上37℃过夜培养; 用接种针挑取单菌落,接种于含有抗生素的LB培养基中,37℃摇床 200 r/min过夜培养; 吸取1.5 ml菌液至离心管中,12000 g离心1min,收集菌体,倒掉菌 液; 加入120 ?l溶液I,振荡打匀,重新悬浮细胞,震荡混匀,冰上放臵2 -3min; 加入240 ?l溶液II,轻柔颠倒混匀,冰上放臵5min; 加入180 ?l溶液III颠倒混匀,放臵于冰上5min; 12000 g离心5 min; 将上清夜转移至另一干净离心管中,加入等体积的苯酚氯仿抽提溶液 中的蛋白等杂质,室温离心3min,再将上清液转移至另一干净的离心 管中,加入2倍体积的无水乙醇,-20度下放臵20min; 12000 g 常温离心5min; 倒尽上清,加75%乙醇浸洗;12000 g 常温离心5min;超净台上风干 DNA;根据实验的目的加入10-20ul RNase A的水溶解,37°C消化半 小时,质粒于-20℃保存备用。

在质粒提取过程中,由于机械力、酸碱度、试剂等的 原因,可能使质粒DNA链发生断裂。所以,多数质粒粗提 取物中含有三种构型的质粒:共价闭合环状DNA (cccDNA): 质粒的两条链没有断裂;超螺旋开环DNA (ocDNA): 质粒的一条链断裂;松弛的环状分子线形 DNA(lDNA): 质粒的两条链均断裂;线性分子质粒DNA 的分子构型 。 质粒DNA琼脂塘凝胶电泳模式图可分为:松弛线性的 DNA; 松弛开环的OC构型; 超螺旋的SC构型。 由于琼脂 糖中加有嵌入型染料溴化乙锭,因此,在紫外线照射下 DNA电泳带成橘黄色。泳道中的SC DNA走在最前沿,OC DNA则位于凝胶的最后边;泳道中的L DNA 是经核酸内切 限制酶切割质粒之后产生的,它在凝胶中的位臵介于OC DNA 和 SC DNA 之间 。

提取质粒的注意事项
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1、菌液浓度要求不能太低或太高,太低质粒的拷贝数太 低,不利于质粒DNA的提取,但也不能太高到了质粒生长 的后期,会有大量的代谢物产生,影响质粒的质量。 2、注意溶液I、II、III在质粒提取中的作用及所加的比 例。溶液I起到悬浮细胞的作用,时间不受严格控制,可 长可短,但溶液II、溶液III的时间控制很关键,根据经 验掌握好度。 3、苯酚和氯仿为极毒的药品,操作时一定要小心,不要 溅到皮肤上。 4、如果质粒要做酶切,一定要用RNase A的水溶解质粒, 如果用RNase A的TE溶解,则TE中的EDTA严重影响酶切效 果。

DNA的核酸内切酶酶切
单酶切反应体系 ddH20: ? 10×Buffer: ? 内切酶: ? 样品: ?
双酶切反应体系 ddH20: 共用10×Buffer: 内切酶1: 内切酶2: 样品:

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注意事项
1、酶切温度要严格控制,酶切温度不对,会造成酶的 STAR活性,产生非特异性切割。 2、酶切时间也不能太长,以目的片断或质粒完全切开为 宜,太长也会产生STAR活性,目的片断被切成更小的 片断。 3、双酶切时注意共用Buffer的选择,如果没有共用 buffer的可根据实际情况而定。

设计引物应遵循以下原则
①引物长度: 15-30bp,常用为20bp左右。 ②引物扩增跨度: 以200-500bp为宜,特定条件下可扩增长 至10kb的片段。 ③引物碱基:G+C含量以40-60%为宜,G+C太少扩增效果不佳, G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布,避免5个以 上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 ④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别 是3’端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增 条带。 ⑤引物3’端的碱基,特别是最末及倒数第二个碱基,应严格 要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。 ⑥引物中有或能加上合适的酶切位点,被扩增的靶序列最好 有适宜的酶切位点,这对酶切分析或分子克隆很有好处。 ⑦引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明 显同源性。

Gus染色
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1.GUS酶活性检测 gus基因存在于某些细菌体内,编码β-葡萄糖苷 酶(β-glucuronidase,Gus),该酶是一种水解酶, 能催化许多β-葡萄糖苷酯类物质的水解。因为绝大 多数植物细胞内不存在内源的Gus活性,因此gus基因 广泛用作转基因植物的报告基因,尤其是在研究外源 基因瞬时表达的转化实验中广泛应有。此外,gus基 因3’端与其他结构形式的融合基因也能够正常表达, 所产生的融合蛋白仍具有Gus活性,这对研究外源基 因表达的具体细胞部位提供了方便条件,也是它相对 于其他报告基因的一个优点。

组织化学染色定位法
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该法以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D葡萄糖苷酸酯(X-Gluc) 为底物,通过显色反应可直接观察到组织器官中gus基因 的活性。 该方法不用将酶从组织中提取出来,而是使底物进入被测 的植物组织、细胞或原生质体之中。将被测材料浸泡在含 有底物的缓冲液中保温,若组织、细胞、原生质体发生了 gus基因转化,表达出GUS,在适宜条件下该酶可将X-Gluc 水解生成蓝色物质,初始产物并不带颜色,为无色的吲哚 衍生物,后经氧化二聚作用形成5,5’-二溴-4,4’-二氯靛蓝 染料,此靛蓝染料使具有Gus活性的部位或位点呈现蓝色, 可用肉眼或在显微镜下观察到。

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Gus染色的主要成分
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0.1磷酸缓冲液(Na2HPO4/KH2PO4)(PH=7.0) 10mMEDTA 5mM铁氰化钾 5mM亚铁氰化钾 0.1%Tritox-100 0.1-0.3%X-Gluc 37℃避光染色,直至染成蓝色。


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