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RT-PCR操作手册


RT-PCR 实验步骤
一.实验器具: 1.移液枪:1ml、200μl、20μl、10μl、2.5μl 2.吸头:1ml、200μl、20μl 3.匀浆管:5ml 4.EP 管:1.5ml、500μl、200μl 5.试剂瓶:棕色试剂瓶(广口,放 75%乙醇) 6.量筒:100ml 7.容量瓶:1000ml 8.试管架:5ml、1.5ml、20μl 9.铝制饭盒:1-2 个 10.大瓷缸:1 个 11.锡泊纸:一卷 12.卷纸:2 卷 13.三角烧瓶:带盖,稍大 二.实验器具处理 1.塑料制品:(包括枪头、EP 管、匀浆管等)先将 DEPC 水从容量瓶中倒入瓷缸中,将塑料制 品逐个浸泡其中(注意:小枪头要充分浸泡,必要时需要针筒打入 DEPC 水),过夜后取出(注意: DEPC 水很难自然晾干,所以建议先将刚取出的 DEPC 物品甩干,枪头装入枪头盒后甩干,EP 管和 匀浆管装入饭盒后甩干,然后在 37 度孵箱烘干)。高压后烤干备用。如果 DEPC 处理过的物品时 间已超过一个星期,再次使用前应再次高压。 2.玻璃制品:泡酸过夜,冲洗干净,先泡 1‰DEPC 过夜,再蒙锡纸烤干备用。 3.匀浆器:(包括剪刀、镊子)先洗净后,超声消毒即可(不需要泡 DEPC)。 三.试剂配制 1.DEPC 水:吸出 1ml DEPC 放在 1000ml 容量瓶中加双蒸水定容至 1000ml,配成 1‰DEPC 水, 并充分振荡混匀备用。 2.75%乙醇:用无水乙醇+DEPC 水配,然后放-20℃保存(DEPC 水需先高压,高压时注意:1. 装 DEPC 水的瓶子在盖子和瓶之间要放上线头;2.高压时间在 40-45 分钟,所以水要适当多加一 点;3.高压结束后,不要强行放气,要让压力自然下降,不然水会喷出)。 3.异丙醇:放入棕色瓶中。 4.氯仿:放入棕色瓶中。 5.琼脂糖 四.缓冲液配制 1.电泳缓冲液(5×TBE 贮存液):Tris 54g、硼酸 27.5g、0.5M EDTA 20ml pH8.0、加 蒸溜水至 1000ml。使用时,将 5×TBE 稀释 10 倍成 0.5×TBE 就可以在电泳时使用(工作浓度) 2.上样缓冲液(6×缓冲液,4℃保存):0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青 FF、30%甘油 五.琼脂糖凝胶配制 1.1.0%:1.0g 琼脂糖+100ml 电泳缓冲液,微波炉加热至沸腾(如果首次煮胶,一定要煮 透,以不出现泡沫为标志),熔化的琼脂物冷却至 60℃时加入 10mg/ml 溴化乙锭 2.5μl,充分混 匀,将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中,在室温下放置 30-45min(可以放入 4 度冰箱加快琼

脂糖凝固)后现进行电泳。 2.1.5%:同上,将琼脂糖的量改为 1.5g 六.需购置材料 Taq 酶(-20 度保存)(配 10×buffer 和 MgCl2):不需要使用高保真 Taq 酶,一般的就行。个 人感觉天为时代的普通 Taq 酶就很不错。 dNTP(4 度保存):向生物公司购买,原装和分装均可。 oligo(dT)15(-20 度保存):可以向生物公司购买 Invitrogen 合成的廉价货,每支 10 元,稀 释后使用(注意稀释浓度),也可以购买 Promega 的原装货,稀释 10 倍后使用,稀释液 4 度保存。 M-MLV(-20 度保存):向生物公司购买,推荐使用 Promega 的,当然有钱可以购买更好的 AMV。 RNasin(-20 度保存):向生物公司购买,推荐使用 Promega 的,原装分装均可。 DEPC(4 度保存):向生物公司购买,5 克足矣。 Trizol(4 度保存):有 50ml 和 100ml 规格,按照实验需要自己购买。国外进口的有 Invitrogen(Trizol)、罗氏(Tri Pure)、MRC(Tri Reagent);国内的也行,天为时代的就不错。 Marker(4 度保存):按照目的条带大小购买,推荐使用天为时代的 Marker(物美价廉,上样 2.5ul 就很亮了,较 3.0ul 的 Takara 同样品种 Marker 为亮),本人很喜欢它的 DL2000。 电泳 Loading Buffer(4 度保存):按照配方自己配制,不需要购买(购买的话价格挺贵)。 七.引物合成 1.内参照:GAPDH(452bp) 正义:5-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 反义:5-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3 2.退火温度计算:2(A+T)+4(G+C),正反义平均数,再上下波动 4-5 度。 3.引物 2 OD 已足够,每管 1 OD 分装。 4.引物稀释:加 DEPC 水量(μl)= X nmol/OD(合成的引物管上有标注) × 管上所标 OD 数(推 荐每管引物为 1 OD 分装,合成之前向公司说明这一点,切记! !)×100。最终引物浓度为 10pmol /μl。 八.PCR 产物电泳 取 1-10μl(一般取 5μl)PCR 产物,加已点在纸上的 6×上样缓冲液,反复吸打混匀后进行电泳, 一般用稳压状态进行电泳,100V 左右,电泳 20-30 分钟,紫外灯下观察,结果进行扫描保存。 九.注意点:1 逆转录后应立即冰水浴 2 RNA 抽提前,打开离心机预冷

TRIzol 法抽提总 RNA
组织 100mg/细胞 1×10 ↓ 加 1mlTRIzol ↓ 组织:匀浆(彻底,分几次打,是匀浆时产生的热量能散出,后转至 EP 管) 细胞:用 1ml 加样器吹至液体澄清且无细胞团块 ↓ 颠倒混匀 10 下,室温 5 分钟 ↓
7

加氯仿 1/5 体积(0.2ml)(必须按总体积的 1/5) ↓ 颠倒混匀 10 下,室温 5 分钟 ↓ 4℃,离心 12000g,15 分钟 ↓ 转上层水相(约 400μl)于另一 1.5mlEP 管中 ↓ 加等体积异丙醇(约 400μl),混匀室温 10 分钟 ↓ 4℃,离心 12000g,10 分钟 ↓ 弃上清 ↓ 加冰预冷的 75%乙醇(DEPC 水配)1ml ↓ 4℃离心 7500g,5 分钟 ↓ 弃上清,空气干燥 5-10 分钟(不能完全干燥) ↓ 溶于 DEPC 水中 注意:1.RNA 若用于核酸转移应溶解于样本缓冲液中,否则 DEPC 溶解。 2.细胞组织加 TRIzol 匀浆后,可在-60℃放置至少一个月(甚至可一年以上)。 3.RNA 在 75%乙醇中,2-8℃至少可保存一周,-20℃至少可保存一年。 4.弃上清的操作,我们一般将 EP 管倒置在平铺于桌面的卷纸上,吸干。 5.最后一步弃酒精,将 RNA 溶于 DEPC 水的操作,我们的做法是:先按 4 的步骤吸干酒精,其实 这样还是不彻底的,再将 EP 管小离心后用 20μl 小枪头(DEPC 处理过的)吸出多余的酒精。最后 用 200μl 中枪头(DEPC 处理过的)吸 11.5μl(20μl 体系,如果是 40μl 体系则加倍)的 DEPC 水 至 EP 管中,吹打助溶,然后转移至 200μl 的 EP 管(这些 EP 管中可以事先加好 Oligo(dT)15,以 节省枪头)中。

两步法 RT-PCR
(第一步:逆转录反应:20μl 体系,如果是 40μl 体系则加倍) 试剂 RNA Oligo(dT)15 浓度 0.05μg/μl 体积 11.5μl 2μl 终浓度 0.005μg/μl

(0.05μg/μl Oligo(dT)15 为 Oligo(dT)15 原液稀释 10 倍的浓度) ↓ 混匀,离心,70℃ 5min ↓ 立即冰水浴,稍离心 ↓

试剂 M-MLV Buffer dNTP RNasin M-MLV

浓度 5× 10mM 40U/μl 200U/μl

体积 4μl 1μl 0.5μl 1μl

终浓度 1× 0.5mM 20μ 200U

总体积 20μl ↓ 混匀,离心,42℃ 60min ↓ 95℃ 10min(破坏 M-MLV) ↓ 4℃保存 (第二步:PCR 反应:总体积 20μl,如果 50μl 体系,相应加倍) 试剂 Taq Buffer MgCl2 dNTP 上游引物 下游引物 cDNA 模板 DEPC 水 Taq 酶 浓度 10× 25mM 10mM 10pmol/μl 10pmol/μl 体积 2μl 1.2μl 0.2μl 0.4μl 0.4μl 1μl 14.7μl 0.1μl ↓ 混匀 ↓ 95℃ 94℃ X℃ 72℃ 72℃ 5分 30 秒 30-40 秒 30 秒 7分 (28-36 循环,4℃保存) 注意:1.Taq 酶、M-MLV、Rnasin 等-20℃保存,操作时置于冰上。 2.dNTP 保存在 4 度即可,勿反复冻融。 3.如果一次做很多管,可以先将共同需要的部分一起加(稍微多算一点,例如 20 管分装,可以加 入 21-22 管的量,因为枪头会吸附一定的液体,可能有人认为这样会浪费试剂,其实不然,因为 每管分开加的话试剂用量更多,枪头吸附的试剂的量其实也是很可观的,特别是国产的枪头,这 样做同时还能降低加样误差),然后各管分装,再加各自不同的部分。 4.如果 200μl 的 EP 管在 PCR 过程中盖子容易炸开,解决方法有:(1)用封口膜将管口密封、(2) 最后每管加入液体石蜡进行液封。 预变性 变性 退火 延伸 终末延伸 终浓度 1× 1.5mM

2.5U/μl


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