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Reviewonattenuationofnanotoxicityandthe-中国科学杂志社_图文

Review on attenuation of nanotoxicity and the mechanisms
任朝秀, 胡献刚 and 周启星 Citation: 科学通报 61, 707 (2016); doi: 10.1360/N972015-01145 View online: http://engine.scichina.com/doi/10.1360/N972015-01145

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2016 年
进 展

第 61 卷

第 7 期: 707 ~ 717

《中国科学》杂志社
SCIENCE CHINA PRESS

降低纳米毒性的途径及其机理研究进展
任朝秀, 胡献刚*, 周启星*
南开大学环境科学与工程学院, 环境污染过程与基准教育部重点实验室 300071, 天津 * 联系人, E-mail: huxiangang@nankai.edu.cn; zhouqx@nankai.edu.cn 2015-11-09 收稿, 2015-11-28 修回, 2015-12-18 接受, 2016-01-26 网络版发表 教育部长江学者创新团队计划(IRT 13024)、国家自然科学基金重点项目(U1133006)和国家自然科学基金(31170473, 21307061)资助

摘要

纳米材料广泛应用在光照疗法、光声成像、癌症的早期诊断、药物转运和组织工程学等领域, 通过应用或

无意释放的形式进入植物、动物、人体和生态环境, 带来了潜在的环境和人类健康风险. 在纳米材料广泛应用或释放 到环境之前, 亟需探索降低其生物毒性的方法和机理. 本文通过对纳米颗粒的物理化学属性, 包括尺寸、纯度、表面 性质(表面电荷、亲疏水性和表面修饰)以及纳米材料与细胞相互作用的环境条件, 包括暴露剂量、暴露时间、反应/ 作用介质等的调整来探讨降低纳米毒性的方法. 同时从细胞及亚细胞结构的生理生化损伤、氧化应激、基因、蛋白质 和代谢5个方面来阐述纳米颗粒产生毒性及降低其毒性的途径、机理, 并对今后降低纳米毒性的相关研究进行展望. 关键词 纳米颗粒, 毒性降低, 代谢, 蛋白, 基因

纳米材料的合成、 应用以及对它们性质的探索已 经吸引了来自物理、化学、生物、医学和工程等各个 领域专家学者的关注 . 由于纳米材料特殊的化学特 性和物理结构 , 使其在生物医学领域具有巨大的潜 在应用价值 , 包括光照疗法 [1] 、光声成像 [2] 、癌症的 药物转运 和组织工程学 等 . 目前 , 纳 早期诊断 、 米材料已经应用于电子元件、涂料、运动器材、化妆 品、食品添加剂等诸多商业产品 . 纳米材料的大量 应用 , 导致其不可避免地进入环境、植物、动物和人 类体内 , 从而与环境和生物体发生相互作用 , 甚至产 生纳米毒性 , 影响环境和人类健康 [7,8]. 当前 , 纳米材料的毒性研究仍然存在争议 , 比如 对碳纳米管毒性的一些研究结果表明其没有明显的 毒性 , 而有一些研究却出现相反的情况 烯的研究也出现类似的矛盾报道
[11,12] [9] [10] [6] [3] [4] [5]

此该综述首先通过分析各因素如何影响纳米毒性来 探讨降低纳米毒性的途径 . 此外 , 纳米材料毒性的广 泛研究衍生出一个重要的分支学科 : 纳米毒理学 . 这 一领域主要研究纳米材料与生物体系 , 包括组织、器 官、细胞、亚细胞结构以及生物大分子的相互作用及 其引起的毒性效应 . 正确认识纳米材料毒性诱发机 制是降低纳米毒性的基础和前提 . 虽然纳米材料产 生组织、器官、细胞及生物大分子水平上的毒性研究 较多 , 但纳米材料诱发毒性的机制尚不明确 . 因此 , 综述进一步从生理生化损伤、 氧化应激、 基因、 蛋白、 代谢等角度探讨纳米材料产生毒性及其降低的机理 . 纳米毒性的控制或降低研究正处于迅速发展阶段, 本文将在最后对相关研究进行总结展望 .

. 对石墨

. 这是因为纳

1

降低纳米毒性的途径
纳米颗粒 (nanoparticles, NPs)本身的一些物理化

米材料的毒性由很多因素共同影响 , 如纳米材料的 尺寸、纯度、表面性质 (表面电荷、亲疏水性和表面 修饰 )、 暴露剂量、 暴露时间和反应 /作用介质等
[13]

学属性 (尺寸、纯度、表面性质 (表面电荷、亲疏水性 和表面修饰 )) 以及纳米材料与细胞相互作用的外在

. 因

引用格式 : 任朝秀 , 胡献刚 , 周启星 . 降低纳米毒性的途径及其机理研究进展 . 科学通报 , 2016, 61: 707–717 Ren C X, Hu X G, Zhou Q X. Review on attenuation of nanotoxicity and the mechanisms (in Chinese). Chin Sci Bull, 2016, 61: 707–717, doi: 10.1360/N972015-01145 ? 2016《中国科学》杂志社 www.scichina.com csb.scichina.com

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第 61 卷

第7期

环境条件 (暴露剂量、暴露时间和反应 /作用介质等因 素 ) 均会影响纳米颗粒产生的细胞毒性 , 如图 1 所示 . 通过优化纳米材料的物理化学属性 , 可以改善纳米 材料与生物的直接作用以及纳米材料在生物体内的 停留、转化及排泄状况 . 对这一过程的掌握将会促使 人们更加了解如何降低纳米材料的毒性 , 从而更好 地利用其潜在的价值 , 为纳米医学、纳米科技等领域 提供低毒甚至无毒的纳米材料 .

同尺寸氧化石墨烯 (graphene oxide, GO)及还原氧化 石墨烯 (reduced graphene oxide, rGO)对人类间充质干 细胞活性的影响 , rGO的平均横向尺寸 (average lateral dimensions, ALDs)为 3.8±0.4 ?m时 , 细胞只有在最高 浓度 100 ? g/mL 下暴露 24 h 才引起显著的细胞毒性 ; rGO的 ALDs为 418±56 nm时 , 细胞在 10 ?g/mL下暴露 24 h 便可产生明显的细胞毒性 ; 而当 rGO 的 ALDs 为 为 11±4 nm( 纳米级 ) 时 , 细胞在 1 ?g/mL 下短期暴露 1 h便可产生显著的细胞毒性 , GO诱发的细胞毒性同 样也依赖于纳米材料的尺寸 [14] . 另外通过人类间充 质干细胞中活性氧自由基 (reactive oxygen species, ROS) 的产生同样得出 rGO 尺寸越小诱导细胞产生的 ROS 越多 , 即对细胞产生的毒性影响越大 [14] . 有研 究选取不同尺寸的银纳米颗粒 (Ag NPs) 进行人类肺 细胞的毒理学实验 , 发现粒径最小的银纳米颗粒 (10 nm)诱发的细胞毒性最大 , 且发现纳米颗粒粒径为 10 nm 时细胞内 Ag 离子的释放量最大 , 这也是其细胞毒 性最大的重要原因 [15] . Zhang 等人 [16] 通过改变 GO 纳 米片的尺寸来降低毒性 . 该研究利用改进的 Hummers 法合成了统一的超小 (纵向尺寸小于 50 nm)、具有荧 光特性的 GO纳米片 , 且在较大 pH范围内具有较好稳

1.1

调整纳米颗粒的尺寸
纳米颗粒的尺寸不同 , 将影响其与细胞发生的

反应、 进入细胞的方式 (内吞或吞噬 )、 进入后的分布、 清除以及能否进入细胞 , 进而影响其对细胞的毒性 . 纳米颗粒尺寸减小时 , 其表面面积会呈指数增长 , 从 而会有更多的原子或分子分布在纳米颗粒表面而不 是内部 , 纳米材料会变得更加活泼 , 更易与细胞发生 物理或化学反应 . 细胞通过内吞作用吸收纳米颗粒 依赖于纳米颗粒的尺寸 . 尺寸对于纳米颗粒在细胞 中的分布、 清除以及引发细胞的毒理效应发挥着重要 作用 , 因此可以通过改变纳米颗粒的尺寸来降低其 对细胞的毒性 . 利用荧光素二乙酸酯方法来评估不

图 1 影响纳米毒性的因素. GO, 氧化石墨烯; PEG, 聚乙二醇; Au NPs, 金纳米颗粒 Figure 1 Impact factors of nanotoxicity. GO, graphene oxide; PEG, polyethylene glycol; Au NPs, gold nanoparticles

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进 展

定性 . 与正常的大尺寸 GO 纳米片相比 , 该纳米片表 现出吸收量大、低毒等生物相容的特性 . 最终 , 该研 究通过改变 GO 纳米片的尺寸 , 既达到了将药物运送 到细胞的目的 , 又降低了载体纳米片诱发细胞毒性 . 大量实验结果表明 , 不同尺寸纳米颗粒产生的细胞 毒性相差较大 , 这可能是由于尺寸对纳米颗粒进入 细胞的方式、胞内蓄积以及与细胞的相互作用均会 产生影响 , 从而导致细胞对其产生的生物响应有所 差别 . 因此 , 为避免纳米材料诱发较大的生物毒性 , 需要在不影响纳米材料应用目的前提下 , 优化纳米 颗粒的尺寸 .

进入小鼠肺细胞后并没有引起任何炎症反应 . 因此 , 当 这 种 SWCNTs 将 药 物 输 送 到 目 的 组 织 或 细 胞 后 , 会很快地发生生物降解 , 降低了生物体的实际暴露 剂量和时间 . 利用萘终止 PEG 修饰的 GO 对斑马鱼鱼 卵进行毒理实验 , 结果表明斑马鱼可以在 GO 对它们 的发育尚未产生明显负面影响之前将其排出体外, 可见 GO经过修饰后可以降低其生物体内的暴露停留 时间 [20]. 上述研究表明纳米材料的暴露剂量和暴露 时间对于细胞毒性的重要影响 . 因此 , 在开发推广纳 米材料的应用时 , 降低纳米材料的暴露剂量和暴露 时间可以有效缓解纳米材料引起的不良效应 .

1.2

降低纳米颗粒的暴露剂量和暴露时间
另一个影响纳米材料细胞毒性的关键因素是生

1.3

提高纳米颗粒的纯度
有的纳米颗粒本身无毒或低毒 , 但其中含有的

物暴露纳米材料的剂量和时间 . 利用蜡状芽孢杆菌 进行 Ag NPs的细胞毒性分析 , 浓度梯度设置为 0~1.5 mg/L, 暴露时间设置为 24 h, 结果表明随着浓度上 升 , 细胞活性显著性降低
[17]

杂质会对细胞产生较大毒性 . 由于纳米颗粒在制备 和纯化的过程中总会掺杂不同的杂质 , 因此在纳米 颗粒推广应用之前 , 有必要研究纳米颗粒携带的杂 质对细胞产生的影响 . 木材完全燃烧后产生的微粒 物质 (particulate mass, PM)会富集挥发性的无机元素 , 如钾、硫和锌 . 对含有钾、硫和锌元素的 PM 进行毒 理研究 , 结果表明细胞毒性、细胞周期阻滞、ROS的 产生和肿瘤坏死因子 ? 的释放与 PM 中锌的含量密切 相关 , 而硫酸钾和碳酸钾存在的 PM 并没有对细胞产 生明显影响 [21]. GO 的细胞毒理学研究也表明在锰杂 质存在的条件下 , 细胞毒性会增强 [22]. 可见在应用 纳米材料时 , 为了降低风险 , 纯化是非常重要的一 步 . Zong等人 [23]研究了纯化纳米硅的方法 , 利用简单 可扩展的球磨和酸蚀的方法将 Si 的纯度由 84%( 质量 百分数 ) 提升到 99.999%(质量百分数 ), 发现随着纳米 硅尺寸的减小 , 其纯度逐渐升高 . Itoh 等人 [24] 研究了 一种利用单片硅磁盘快速、温和纯化纳米颗粒的方 法 , 通过过滤和离心 , 纳米颗粒可以从分散液中纯 化 . 该方法可以纯化多种纳米材料 , 不受纳米材料尺 寸 (20~100 nm)或者化学组成 (硅、聚乙二醇或聚乙二 醇脂质体 ) 的局限 . 无论通过哪种方法进行纯化 , 纳 米颗粒纯度的提高 , 均有望降低其产生的生物毒性 .

. 同时进行了不同暴露

时间条件下细胞毒性比较 ( 蜡状芽孢杆菌暴露在 0.05 mg/L Ag NPs下 0. 2~48 h), 发现在 0. 2和 3 h的暴露时 段里 , 与空白对照相比 , Ag NPs 对细胞几乎没有影 响 ; 而当暴露时间延长为 24和 48 h时 , 与空白对照相 比 , 其细胞活性显著降低 . 可见在该实验时间范围 内 , 暴露时间越长其细胞毒性越大
[17]

. 其他纳米颗

粒的细胞毒性同样表现出对暴露剂量和暴露时间的 依赖性 . Zhang等人 [18]将神经元细胞 PC12分别暴露在 0~100 ?g/mL石墨烯和单壁碳纳米管(single-wall carbon nanotubes, SWCNTs)下, 发现暴露在石墨烯或SWCNTs 下细胞的代谢活力都随着其浓度的增大而降低 ; 乳 酸脱氢酶 (lactate dehydrogenase, LDH)的释放量随着 浓度的增大而升高 , 表明浓度越大对细胞膜的损伤 也越严重 ; 暴露于 GO 24 h, ROS的产生量只有在浓 度为 10和 100 ?g/mL的条件下才有显著的增大 . 以上研究表明 , 纳米颗粒暴露剂量越大或暴露 时间越长 , 其产生的生物毒性越大 , 因此需要降低纳 米材料的暴露剂量及时间 , 这里所说的暴露剂量和 时间的降低 , 是指纳米颗粒进入生物体或细胞内后 暴 露 剂 量 和 时 间 的 降 低 . Kagan 等 人 [19] 研 究 表 明 SWCNTs 的 微 晶 结 构 可 以 通 过 酶 促 反 应 得 到 降 解 , 次氯酸盐和人类嗜中性粒细胞髓过氧化物酶的几个 活性自由基中间体在嗜中性粒细胞和巨噬细胞中均 可降解 SWCNTs. 被降解的碳纳米管是惰性的 , 并且

1.4

改变表面化学性质
表面电荷会影响纳米颗粒对离子和生物分子的

吸收 , 从而改变细胞对纳米颗粒的响应 . 另外 , 表面 电荷是胶体行为的主要决定因素 , 它会通过纳米颗 粒的聚集或团聚来影响纳米颗粒的尺寸和形貌 , 从
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2016 年 3 月

第 61 卷

第7期

而影响其对细胞的毒理效应 . 因此可以通过改变纳 米颗粒表面电荷属性来降低其诱发的细胞毒性 . 研究表明 , 带正电荷的纳米颗粒的细胞毒性强 于带负电的纳米颗粒 , 更容易引起溶血和血小板聚 集 , 而中性的纳米颗粒生物相容性最好 , 这可能与细 胞膜的磷脂头基和蛋白质结构带负电荷有关 , 正负 电荷相吸作用力较强 [25]. Leroueil等人 [26] 发现带阳离 子的纳米颗粒在破坏细胞膜时主要是在生物膜膜上打 孔 , 使 膜 变 薄 , 或 者 腐 蚀 膜 . Ruenraroengsak 和 Tetley
[27]

的 方 式 也 不 同 , 例 如 PEG 主 要 通 过 产 生 ROS, 而 MUA 和 PMA 则 通 过 影 响 整 个 细 胞 的 骨 架 来 诱 发 毒 性 [30]. Wan等人 [31]对金纳米棒 (gold nanorods, GNRs) 进行表面修饰 , 发现溴化十六烷基三甲铵 (CTAB) 修 饰的 GNRs 通过损害线粒体和产生 ROS 来引起细胞凋 亡 和 自 噬 , 然 而 溴 化 十六 烷 基 三 甲铵 /聚 磺 苯 乙 烯 (CTAB/PSS)、溴化十六烷基三甲铵 /聚烯丙基氯化铵 (CTAB/PAH)、 CTAB/PSS/ PAH或 CTAB/PAH/PSS修 饰的金纳米棒表现出较低的毒性 , 且并未引起细胞 死 亡 . 与 CTAB/PSS 和 CTAB/PSS/PAH 相 比 , CTAB/ PAH 修饰的金纳米棒引起的细胞形态异常较小 . 另 外 , 将无机纳米颗粒与交联聚合物组装 , 在纳米颗粒 表面形成一个聚合物外壳 , 可以保护纳米颗粒不被 环境降解 , 同时降低细胞毒性 [32]. 上述方法可以将 药物定向投放到需治疗的组织中 , 且在不显著改变 原材料性能的前提下保证其安全应用 . 由此可见 , 将 有毒的纳米颗粒应用于生物医学时 , 可以通过改变 其表面性质来降低其毒性 , 或增强其生物相容性 , 从 而实现更好地利用 .

比较了表面电荷为中性、阳性和阴性纳米颗

粒对肺泡上皮细胞的细胞毒性 , 发现阳性纳米材料 处理的细胞活性显著降低 , 产生较多的 ROS, 线粒体 损伤严重 ; 中性和阴性纳米材料处理的细胞虽然也 产生了一些 ROS, 但几乎没有细胞毒性和导致的线 粒体损伤也较弱 . 另外 , 纳米颗粒表面的亲疏水性也 影响其诱 发的细胞毒 性 . 文献 [28] 进行了疏水 性的 Au NPs 与细胞之间的相互作用的实验 , 结果表明疏 水性的金纳米颗粒诱发较为明显的膜破坏和自噬现 象 . 因此 , 可以通过改变纳米颗粒的表面电荷来降低 其生物毒性 . 研究表明多聚物 - 药物配合体经常作为 纳米药物载体 (nano drug vehicles, NDVs)输送抗癌药 物 , 直接利用两性离子聚合物作为 NDVs 时 , 其电荷 平衡会被配合药物或功能团附加的带电基团破坏, 导致其失去抵抗蛋白吸附的能力 , 最终非特异性蛋 白吸附到药物载体上将会被血液系统快速清除 , 引 起 免 疫 反 应 , 甚 至 严 重 的 生 物 系 统 毒 性 . Wang 等 人 [29]通过改变 NDVs的表面电荷克服了这一弊端 , 利 用一种带负电荷的成分修饰两性离子聚合物多聚羧 酸甜莱碱甲基丙烯酸酯 (poly(carboxybetaine methacrylate), pCBMA)来中和模式药物阿霉素 (doxorubicin, DOX) 带来的阳离子 , 通过形成带有少量表面负电荷 的水合 pCBMA 外壳 , DOX 与这种 NDVs 结合可以显 著抵御非特异性蛋白吸附 , 降低细胞毒性、延长循环 时间 , 且在弱酸条件下加速了药物的释放 . 纳米颗粒表面可修饰多种基团 , 以改变纳米颗 粒的有关特性 , 起到降低细胞毒性的作用 , 但有些修 饰基团本身存在细胞毒性 . 用巯基烷酸 (mercaptoundecanoic acid, MUA) 、 异 丙 烯 和 马 来 酸 酐 共 聚 物 , (PMA) 或者 PEG-PMA 对 Ag NPs 进行表面修饰 , 发 现 PEG 修饰 Ag NPs 会降低纳米材料的细胞毒性 , 而 MUA修饰的 Ag NPs倾向于在复杂的环境中凝聚 , 诱 发的纳米毒性也较为明显 . 修饰基团不同产生毒性
710

1.5

调整纳米颗粒的反应 /作用介质
细胞暴露在不同的介质中也会影响纳米颗粒的

毒性 . 阳离子多聚糖纳米颗粒与人类气道上皮细胞 (16HBE14o-)分别为血清、无血清、牛血清白蛋白中 发生交互作用 , 发现该纳米颗粒的细胞吸收、诱发的 DNA 损伤和微核 (micronucleus, MN) 的产生在上述 3 种介质中均不相同 [33]. Corradi等人 [34]研究了二氧化硅 纳米颗粒 (Lys-SiO2 NPs) 、二氧化钛纳米颗粒 (TiO2 NPs) 、氧化锌纳米颗粒 (ZnO NPs) 和多壁碳纳米管 (MWNTs) 在 10% 血清或无血清的情况下 , 对人类肺 上皮癌细胞 (A549) 的毒理效应 . 在有血清的情况下 , ZnO NPs 使细胞中 MN 量增多 ; 对于 Lys-SiO2 NPs 来 说, 在无血清的条件下细胞分裂障碍增殖指数 (cytokinesis-block proliferationindex, CBPI)显著降低 , 而在 100%的血清中 CBPI 又得到了修复 . 上述结果表 明血清可降低 Lys-SiO2 NPs 诱发的细胞毒性 . Prasad 等人 [35] 评估了 TiO2 NPs 在 3 种不同介质 ( 角化细胞生 长介质加 0.1%的牛血清白蛋白 (KB)、 含有 PBS, 0.06% 的血清白蛋白和 0.001% 表面活性剂的支气管肺泡灌 洗 液 (DM) 和 角 化 细 胞 生 长 介 质 加 10% 牛 胎 儿 血 清 (KF)) 中对人类肺上皮细胞的细胞毒性和基因毒性 . 在 纳 米 材 料 暴 露 下 , 仅 有 KF 中 细 胞 形 成 了 MN, 在

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进 展

KF 中产生的 TiO2 NPs 凝聚最少 , 细胞与纳米颗粒的 相互作用最强烈 , 而且在 S 相细胞中纳米材料的累积 也最多 . 上述研究结果表明介质组成、颗粒吸收和细 胞与纳米颗粒相互作用之间的相互关联 , 也说明了 反应介质在纳米材料毒性调控上的潜在作用 .

人 [40] 用 CCK-8(2-(2- 甲氧基 -4-硝基苯基 )-3-(4-硝基苯 基 )-5-(2,4- 二磺酸苯 )-2 H - 四唑单钠盐 , 又称 WST-8) 测定 GO对 GLC-82肺腺癌细胞活性的影响 , 发现随着 暴露时间和 GO 浓度的增大 , 细胞活性降低 , 而且细 胞开始变成圆形或者不规则的形状 , 细胞的边界也 变得模糊 . 另外为了探索 GO 影响细胞活性的机制 , 通 过 细胞 内 LDH 的 测 定对 细 胞膜 完整 性 进行 表征 , 结果表明 LDH 渗漏随着 GO 浓度增大而增大 , 表明膜 的完整性也在逐渐降低 , 影响了细胞活性 . Ruenraroengsak 和 Tetley [27] 研究了肺泡上皮细胞 AT2 暴露在 表面电荷为阳性的聚苯乙烯纳米颗粒 (nanoparticles modified with amine, ANPs) 后的毒理效应 , 发现 ANPs会引起细胞线粒体膨胀、损害线粒体膜的完整 性 , 而且分解了线粒体间的网状物 . Edmund 等人 [41] 利用自组装的纳米乳剂 (self-assembling nanoemulsion, SANE) 封装硒化镉量子点 (CdSe QDs), 研究其 对海拉细胞活性的影响 , 结果表明相同浓度的 SANE 封装 CdSe QDs处理的细胞存活数比未封装 CdSe QDs 高得多 , 但并未改变 CdSe QDs 的发射波长 , 故仍能 发挥其特异性功能 , 因此 , 可以通过 SANE 封装来降 低 CdSe QDs 的生物毒性 . 另外 , 研究表明在纳米凝 胶上负载胞嘧啶核苷 5 ′ - 三磷酸盐与不负载时相比 ,

2

纳米颗粒产生毒性及其毒性降低机理
探明纳米颗粒产生的毒性机理是开展纳米毒性

降低研究的基础和前提 . 纳米材料在与生物体系发 生反应过程中 , 会造成不同程度的损伤 , 如组织水 平、器官水平、细胞水平、亚细胞水平以及生物大分 子 (糖类、脂质、蛋白质和基因 )水平的损伤 2是对其产生纳米毒性机制的阐述 .
[36~38]

. 图

2.1

生理生化损伤
纳米颗粒对细胞产生一些生理生化损伤 , 如影

响细胞活性和细胞形态、细胞膜通透性发生变化、对 细胞膜损坏以及对线粒体形态的损伤等 , 造成细胞 功能障碍甚至失活 . Cronholm 等人
[39]

用台盼蓝染色

法 依 据 细 胞 膜 的 完 整 性 鉴 别 人 类 肺 细 胞 系 A549 和 BEAS-2B 暴 露 氧 化 铜 纳 米 颗 粒 后 的 死 亡 率 , 发 现 A549 和 BEAS-2B 细 胞 死 亡 率 均 有 显 著 增 加 . Li 等

图 2 纳米颗粒的毒性作用机理. TCA, 三羧酸循环 Figure 2 Mechanism of nanotoxicity. TCA, tricarboxylicacidcycle

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细胞的 LDH 释放量显著减少 , 这说明负载后的纳米 材料对细胞膜完整性的破坏减小
[42]

氧化应激 , 可能是由金属离子的释放引起的 . 磁性纳 米颗粒中的铁离子与其他过渡金属离子共同存在时 会诱导细胞产生 ROS, 引起细胞膜脂质过氧化 , 非定 型硅修饰的 MNPs 可以减少铁离子的释放 , 从而减少 ROS的产生和脂质过氧化 [46].

.

2.2

氧化应激
从细胞水平来看 , 由于纳米颗粒属于超细颗粒

物的范畴 , 因此有学者认为某些纳米材料可能首先 作用于细胞内的氧化还原细胞器线粒体 , 从而使线 粒体产生大量 ROS. 过多的 ROS 在体内如果得不到 及时的清除 , 会导致氧化系统和抗氧化系统失衡 , 从 而使得细胞发生氧化应激 . 氧化应激机制也存在多 种解释 , 一方面 , 氧化应激可以增加细胞膜的通透 性 , 释放出一系列细胞因子 , 激发炎症反应 . 刺激间 隙巨噬细胞和炎症细胞释放前炎症介质 , 引发间隙 的炎症 . 另一方面可以激活信号通路 , 引起细胞调 亡 . 它们可与其邻近的任何生物分子反应 , 引起脂 质、蛋白质和核酸分子的氧化损伤 , 导致细胞结构的 损伤与破坏或引起肿瘤的发生 , 还能使蛋白质、核酸 等大分子交联 , 影响其正常功能 , 导致组织损伤 . Urner 等人
[43]

2.3

基因
纳米颗粒产生基因毒性的机制可以分为直接和

间接 2 种 . 直接基因毒性主要表现为纳米颗粒对基因 的物理作用 , 如影响 DNA 碱基的堆积力 , 造成 DNA 双链的断裂 , 影响磷酸化作用 , 引起加合物的生成或 者改变基因的表达 . 间接基因毒性主要表现为降低 DNA的修复功能, 或者与细胞的组成部分(线粒体、 细 胞膜等 ) 发生反应而产生较多的 ROS, 导致抗氧化酶 活性的降低以及基因表达的改变. 纳米颗粒引起 DNA损伤的途径如图 3所示 . Chen 等人 [47] 进行了 GO 对斑马鱼胚胎发育及基 因 毒 性 的 研 究 , 发 现 8- 羟 化 脱 氧 鸟 苷 (8-OhdG ) 和 DNA 甲基化水平均因 GO 暴露而出现异常 . 进一步 , DNA 甲基化水平的变化会导致基因表达发生变化 , 从而引起斑马鱼胚胎发育的异常 , 如畸形 , 甚至死 酵母和人类 亡 . Lan等人 [48]将 3种生物细胞 (大肠杆菌、 细 胞 ) 分 别 暴 露 在 4 种 纳 米 颗 粒 (TiO 2 NPs 、 炭 黑 、 SWCNT和富勒烯 ), 发现 TiO 2 NPs 在 3 个物种中均引 起一系列的 DNA 损伤 , 同时在酵母和人类细胞中均 出 现 8- 羟 基鸟 嘌 呤 DNA 糖 苷 酶基 因 1(OGG1) 上调 . OGG1上调是为了修复纳米颗粒诱发的氧化损伤 . 相 对大肠杆菌 , 上述纳米颗粒造成真核生物 ( 酵母和人 类细胞 )DNA双链结构较为明显的断裂 , 表明真核生 物对纳米颗粒敏感性更强烈 , 这是由真核生物与原 核生物细胞结构以及防御系统不同造成的. 而 SWCNT 处理的真核细胞中并没有出现 OGG1 上调 , 说明其 DAN 损伤并不是氧化应激引起的 , 可能是膜 损伤引起了细胞凋亡 / 坏死 . 同样富勒烯造成的 DNA 损伤也不是氧化应激引起的 , 通过实验发现 C 60 引起 的真核细胞 DNA 损伤激活了一个 DNA修复通路非同 源末端连接 (non-homologous end joining, NHEJ)通路 , 它通过直接的结扎法将断裂的 DAN 双链结构修复 , 说明富勒烯可能是通过将 DNA 双链直接分裂而引起 的 DNA 损伤 . Calarco 等人 [49] 发现乙酰化的聚乙烯亚 胺 - 乳酸羟基乙酸共聚物纳米颗粒 (acetylated PEIPLGA nanoparticles, AcPEI-NPs)可以降低聚乙烯亚

将小鼠肺泡巨噬细胞 (MAC) 暴露在

含有一定浓度 Mn3O4纳米材料的培养液中 24 h, 用二 氯荧光素法测定 ROS水平 . 结果显示 , 与空白对照相 比巨噬细胞产生的 ROS 增加了 346%, 上皮细胞中也 增加了 84%, 同时降低了其代谢活性 , 减少了炎性调 解物的分泌 . Shi等人
[44]

测定了暴露在 TiO2 NPs 条件

下的 HepG2细胞产生的 ROS, 发现 ROS水平随着 TiO2 NPs 浓 度 的 增 大 而 显 著 提 高 , 丙 二 醛 含 量 随 着 TiO2 NPs含量的升高而显著增加 , 超氧化物歧化酶和谷胱 甘肽过氧化物酶水平却显著降低 , 同时 DNA 损伤显 著增大 , 而相关的 mRNA 及蛋白质的表达出现上调 . 说明 ROS 累积过多会造成生物大分子的氧化损伤 ( 脂 质、蛋白质和 DNA 的过氧化 ), 同时 ROS 又是细胞内 信号传导的第二信使 , 因此 ROS 过多的产生可能会 影响 DNA表达的调节 , 最终会导致 DNA损伤 . 以上研究表明ROS的产生会引起炎症或生物大分 子损伤, 因此, 需要控制ROS的过度生成. Worthington 等人
[45]

用失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯醚 (tween-80,

Tw) 和 壳 聚 糖 (chitosan, Ch) 共 同 修 饰 的 Cu NPs(Cu NPs+Tw+Ch) 来降低 Cu NPs 诱导人类肺泡上皮细胞 A549产生的细胞毒性 , 发现与 Cu NPs相比 , Cu NPs+ Tw+Ch 降低了细胞 ROS 的产生 . 毒性降低的可能原 因是由于壳聚糖修饰的 Cu NPs 降低了细胞的环境压 力 , 增加了细胞活性 . 金属纳米颗粒诱导细胞产生的
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进 展

图 3 纳米颗粒引起DNA损伤的途径 Figure 3 Paths of DNA damage induced by nanoparticles

胺 - 乳酸羟基乙酸共聚物纳米粒 (PEI-PLGA nanoparticles) 产生的基因毒性 , 进一步证实乙酰化并没有减 少细胞对纳米粒的吸收 , 也没有改变其生物相容性 , 但 AcPEI-NPs减少了 ROS的产生 , 从而减少了 DNA氧 化损伤 . 另外 , 研究表明非定型 SiO2 修饰 ZnO NPs, 可以降低未修饰的 ZnO NPs对人类类淋巴母细胞 TK6 的 DNA 损伤
[50]

或细胞后会与生物分子 , 尤其是蛋白质结合生成一 个相对稳定的蛋白冠 , 它会与细胞和生物障碍物发 生复杂的相互作用 , 而且还会参与复杂的生物信号 通路 , 影响其生物过程 [51]. 从纳米材料的安全性使 用来看 , 积累和总结有关纳米粒子与蛋白质的相互 作用是非常重要的 , 这有利于优化设计具有良好生 物相容性的纳米材料 . 文 献 [52] 研 究 了 在 人 类 结 肠 癌 细 胞 LoVo 中 Ag NPs 与蛋白质的相互作用 , 纳米颗粒粒径为 100 nm 时 , 纳米颗粒通过间接方式产生影响 , 如影响丝氨酸 / 苏氨酸蛋白激酶 , 促分裂原活化蛋白激酶和磷酸酶 2A等通路 . 纳米颗粒粒径为 20 nm时 , 细胞对其做出 直接的应激反应 , 包括 ROS 的生成 , 蛋白羰基化 , 另 外小泛素相关修饰物 (small ubiquitin-related modifier, SUMO)修饰的蛋白质也出现上调 . Pisani等人 [53]结合 转录组学和蛋白组学来研究二氧化硅气相纳米材料 对人类肺泡上皮细胞 A549 细胞水平和分子水平的影 响 , 发现纳米硅引起了细胞中 Rho 信号级联放大 , 肌 动蛋白细胞骨架和网格蛋白调节的吞噬作用 , 另外 还引起了炎性介质的上调 , 诱发了凝固系统通路 . Liu 等 人 [54] 比 较 了 羟 基 化 的 多 壁 碳 纳 米 管 (MWCNTs-OH) 和原始碳纳米管 (p-MWCNTs) 的细胞
713

. 出现上述现象的可能原因是 SiO2 包

裹在 ZnO NPs 周围显著地减少了纳米颗粒与细胞的 接触 , 抑制了 ZnO的溶解 , 同时这种修饰过程并没有 改变 ZnO本身的光电特性 .

2.4

蛋白质
纳米材料引起的蛋白质水平的响应主要研究蛋

白质的结构、表达、细胞定位、生化活性以及蛋白质 间的相互作用等 . 由于蛋白质是细胞内各种功能的 最终执行者 , 因此 , 综合蛋白质与基因的研究结果可 更深入地阐明纳米材料对各种细胞功能的影响机理 . 纳米材料与蛋白质的相互作用 , 既可能导致蛋白质 结构发生改变、功能丧失等负面效应 ; 也可能由于蛋 白质分子在纳米材料表面的吸附 , 从而提高材料的 生物相容性 , 产生正面效应 . 然而有关产生这种正面 效应的机理的研究较少 . 另外 , 纳米颗粒进入生物体

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毒 性 , 结 果 表 明 MWCNTs-OH 的 细 胞 毒 性 比 pMWCNTs 低 , 主要是由于 MWCNTs-OH 可以抑制凋 亡蛋白 caspases 的活性 , 从而限制了线粒体介导的凋 亡通路 , 降低了细胞毒性 . 另外 , 研究表明与不含铁 的 ZnO NPs相比 , 铁掺杂的 ZnO NPs可以引起小鼠肺 部细胞血红素氧化酶 1(HO-1) 表达的下调 , 说明减少 了氧化应激作用 , 炎症反应也得到了缓解
[55]

发现GO可以通过尸胺、葡萄糖酸、乌头酸等代谢物的 上调影响小麦根部形态和叶绿体的合成 , 但是添加腐 殖酸可以调节代谢物肌糖、苯基丙氨酸、硬脂酸等的 水平, 从而降低了GO产生的植物毒性.

3

总结与展望

. 也有

研究表明蛋白冠可以降低纳米硅与细胞的黏附性, 减轻纳米硅对细胞膜的破坏 [56]. 但将蛋白冠上的多 糖移除后 , 发现纳米颗粒细胞黏附性增强 , 且细胞对 纳米颗粒的吸收增多 , 引起炎症 [57]. 可见蛋白冠上 的多糖对降低纳米颗粒毒性具有重要作用 .

本文阐述了降低纳米毒性的途径以及产生和降 低纳米毒性的机理 . 不同研究中纳米材料表现出不 同的甚至是相反的毒性效应 , 这是由于纳米材料的 毒性是由各种因素共同影响而导致的 . 因此 , 可以通 过对影响纳米毒性的各因素进行调控来降低纳米毒 性 , 如纳米材料尺寸的改变、纯度的提高、表面性质 (表面电荷、亲疏水性和表面修饰 )的改变、暴露剂量 的降低、暴露时间的减少、反应 /作用介质的调整等 . 另外本文还归纳了纳米材料产生和降低毒性的机理 , 包括细胞及亚细胞结构的生理生化损伤 ; 氧化应激 反应引发细胞膜通透性和信号通路的变化 ; 代谢紊 乱及代谢的调控与纳米毒性的密切关系 ; 纳米颗粒 导致蛋白的结构、表达和活性等发生变化 , 以及蛋白 冠的形成对纳米颗粒的生物相容性和生物信号通路 产生影响 ; 纳米颗粒可以通过直接的物理作用 , 如双 链断裂等造成 DNA 损伤 , 或者通过产生 ROS 来造成 DNA 的氧化损伤 . 需要注意的是 , 纳米材料一旦进 入环境或者生物体内 , 必将发生一系列的物理化学 或生理生化的转化 , 甚至产生一些转化后的副产物 . 如何科学评估这些转化后纳米材料的生态健康风险 以及如何有效降低转化后纳米材料的生态健康风险 是未来研究的难点和重点 . 此外 , 纳米颗粒在生物体 或细胞内摄取、吸收、分布、作用和清除的整个过程 一直是纳米毒性控制的一个重要研究内容 . 然而 , 一 些碳纳米材料 , 例如碳纳米管、石墨烯等纳米材料在 生物体内的定性、定量仍然存在一些技术上的难题 . 整体上分析 , 纳米毒理的阐明以及相关控制方法技 术的发展涉及到医学、化学、物理、生物学及环境科 学等多个学科领域 , 迫切需要多领域学科的专家学 者协同合作 , 以保证纳米科学事业的健康发展 .

2.5

代谢
纳米颗粒与代谢物的相互作用研究通过对代谢

物的整体评价 , 提供生物学作用的瞬时情况 , 并反映 出基因表达在受到环境刺激后的长期生物学变化 , 从 而分析纳米颗粒对细胞代谢水平的影响 , 为建立下游 代谢物变化与信号通路变化的关系提供有效数据 , 以 期对其毒性效应的全面理解 . 将人类胚胎肾 293 细胞 暴露在含有异硫氰酸罗丹明 B的二氧化硅修饰的磁性 纳米颗粒中 , 研究这一过程对细胞代谢活性的影响 , 发现与空白对照相比谷氨酸含量增多了 2 倍 , 与谷氨 酸代谢途径相关的基因表达也受到影响[58]. 上述研究 进一步证实与三羧酸循环有关的有机酸也受到干扰 , 处理过的细胞合成三磷酸腺苷的能力下降 . 谷氨酸代 谢和三羧酸循环的变化均说明在这一过程中线粒体功 能受到损伤 , 细胞暴露在磁性纳米颗粒中会造成细胞 转录组学和代谢组学的干扰 . Hu等人 [59]进行了 GO与 羧基单壁碳纳米管 (C-SWCNT) 对小球藻细胞代谢组 学的影响实验 , 结果表明烷烃、赖氨酸、十八碳二烯 酸和缬氨酸等的代谢与 ROS的产生相关 , 这可能是其 潜在纳米毒理学机制之一 . 另外 GO和 C-SWCNT抑制 了脂肪酸、氨基酸和小分子酸的代谢 , 这也是纳米材 料导致细胞毒性的重要机制 . 近期研究表明 , 可以通 过调节生物体或细胞代谢来降低纳米毒性. Hu等人
[60]

参考文献
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进 展

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进 展

Review on attenuation of nanotoxicity and the mechanisms
REN ChaoXiu, HU XianGang & ZHOU QiXing
Key Laboratory of Pollution Processes and Environmental Criteria, Ministry of Education, College of Environmental Science and Engineering, Nankai University, Tianjin 300071, China

Nanoparticles (NPs) with excellent properties have been rapidly developed and applied in various fields such as phototherapy, early cancer diagnosis, drug carriers, electronic components, cosmetics, food additives, water treatment, and soil remediation. Humans could be directly exposed to these NPs via these applications. These NPs or NP-containing products could also be released into the environment, leading to potential environmental risks. Therefore, the environmental and health risks of nanomaterials urgently need to be assessed, especially for the development of control methodologies. Methods for control or regulation of nanomaterial risks are still in the developmental stages, and some knowledge gaps and ambiguities still exist. To address these knowledge gaps and to guarantee the sustainable development of nanotechnology, this review discusses the attenuation of nanotoxicity and mechanisms thereof. Physicochemical properties of NPs, such as size, purity, and surface properties (surface charge, hydrophilicity, and surface modification) influence their interactions with biological systems. Environmental conditions during the interaction of NPs with cells, such as exposure dose and time and reaction media, also affect nanotoxicity. Optimization of these physicochemical properties and environmental conditions is expected to aid the design of ideal NPs and control adverse effects of NPs. Nanotoxicity has been reported to be reduced by adjusting size, purity, surface properties (surface charge, hydrophilicity, and surface modification), exposure dose and time, and reaction media of NPs. Herein, the corresponding progress and challenges are also discussed individually. Moreover, this review elaborates on toxic mechanisms and attenuation of nanotoxicity involving five aspects: chemophysiological damage of cellular and subcellular structures, oxidative stress, genes, proteins, and metabolism. Understanding mechanisms underlying the interaction of NPs with biological systems would be conducive to the prediction of nanotoxicity and the design of experiments to attenuate this nanotoxicity. Currently, further studies need be conducted to explore NP uptake, absorption, distribution, interaction, and elimination in biological systems or cells. Globally, the methods of nanotoxicity attenuation remain immature, and well-corroborated methods are unavailable. Finally, perspectives on future research in nanotoxicity attenuation are proposed. An understanding of nanotoxicology and the development of related control methods affect multiple disciplines, including medicine, chemistry, physics, biology, and environmental science. Therefore, multidisciplinary experts need to urgently work together to ensure the sustainable development of nanotechnology. nanoparticles (NPs), attenuation of toxicity, metabolism, protein, gene doi: 10.1360/N972015-01145

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