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刺参体内RNA干扰方法的初步研究


《 河北渔业》 2016年 第 9 期 ( 总 第 273期) ? 研究与探讨 DOI : 10.3 9 6 9 / j . issn . 1 0 0 4 - 6 7 5 5 . 2 0 1 6 . 0 9 . 0 0 2 刺 参 体 内 RNA干扰方法的初步研究 张宇鹏, 田 賧, 庚宸帆, 于海龙, 常亚青 (大连海洋大学, 农业部北方海水増养殖重点实验室, 辽 宁 大 连 116000) 摘 要 : 以 刺参 溶 菌 酶 基 因 ( lysozyme gen e , LYZ )为 觀 基 因 探 索 构 建 刺 参 体 内 R N A 干 扰 体 系 。构建了 3 个 刺参溶菌酶基因特异性的RN A 干扰重组质粒, 以刺参体腔液原代培养细胞为靶细胞进行筛选; 分别以口腔 注射和腹腔注射的方式以及不同的注射剂量对刺参LYZ进 行 体 内 R N A 干 扰 , 并 运 用 qPC R 技术测定刺参 L Y Z 的表达量; 最后, 对 刺 参 LYZ进 行 体 内 R N A 干扰, 并 分 别 运 用 q P C R 技 术 和 比 浊 法 测 定 刺 参 L Y Z 的表 达 量 及 其 酶 活 性 。结 果 显 示 : 3种1?^八干扰重组质粒的沉默效率分别为40%、 45%、 0 % ;体 腔 注 射 1 ? ^ 八 干 扰重组质粒时, 各 组 织 中 L Y Z 的表达量均出现了显著的上升( P < 0 . 05),而 从 口 腔 注 射 时 , 体腔液和肌肉中 L Y Z 的表达量均出现极为显著的下降( P < 0 . 0 1 ) , 而在 管足中 未出 现 明 显 变化 ; 当 其 注 射 剂 量 为 0.5 p g 和 5 ju g 时 未 对 L Y Z 的 表 达 产 生 有 效 的 抑 制 作 用 ; 当 注 射 剂 量 为 10 ju g 和 25 ju g 时 , 刺 参 体 内 L Y Z 的表达受到了 明显抑制, 但 是 注 射 剂 量 为 25 ju g 时 , 部分刺参个体出现吐肠现象; 在 转 染 12 h 后 , 刺参体腔液、 肌肉、 体壁、 疣足和 管足组织中L Y Z 的表达量开始下降, 到 第 四 天 后 开 始 回 升 。表 明 : 只 有 从 口 腔 注 射 R N A 干扰重组质 粒 且 注 射 剂 量 达 到 10 f i g 时 才 能 有 效 地 抑 制 靶 基 因 的 表 达 ; 刺 参 体 内 R N A 干扰具有系统性, 可以在各个组织 间相互传导。 关键词: 刺参; 溶菌酶基因; R N A 干扰 中图分类号: S 917. 1 文献标识码: A RNA 干 扰 ( R N A in te rfe re n ce ) 是 指 双 链 R N A ( dsR N A )在 细 胞 内 特 异 性 的 诱 导 与 之 同 源 ana T e ro v a 等 [5]分别通过电脉冲和注射的方式成 功 地 将 d s R N A 和 s h R N A 导 人 海 鲈 体 内 。 N ao ki 等[7]的 研 究 表 明 动 物 体 内 R N A 干 扰存在剂量和 时间依赖性的效应。 刺 参 _ / a />om' ca 5 ) 具 有 较 高 的 经 济 价 值 和 药 用 价 值 [8], 是目前中国水产养殖业 的 主 要 养 殖 品 种 之 一 。但 是 , 近年来刺参细菌性 和病毒性病害屡屡大面积发生, 给养殖业者带来 了巨大损失[ ? ^ ° ] 。故 提

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