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刺参体内RNA干扰方法的初步研究_论文

《 河北渔业》 2016年 第 9 期 ( 总 第 273期) ? 研究与探讨 DOI : 10.3 9 6 9 / j . issn . 1 0 0 4 - 6 7 5 5 . 2 0 1 6 . 0 9 . 0 0 2 刺 参 体 内 RNA干扰方法的初步研究 张宇鹏, 田 賧, 庚宸帆, 于海龙, 常亚青 (大连海洋大学, 农业部北方海水増养殖重点实验室, 辽 宁 大 连 116000) 摘 要 : 以 刺参 溶 菌 酶 基 因 ( lysozyme gen e , LYZ )为 觀 基 因 探 索 构 建 刺 参 体 内 R N A 干 扰 体 系 。构建了 3 个 刺参溶菌酶基因特异性的RN A 干扰重组质粒, 以刺参体腔液原代培养细胞为靶细胞进行筛选; 分别以口腔 注射和腹腔注射的方式以及不同的注射剂量对刺参LYZ进 行 体 内 R N A 干 扰 , 并 运 用 qPC R 技术测定刺参 L Y Z 的表达量; 最后, 对 刺 参 LYZ进 行 体 内 R N A 干扰, 并 分 别 运 用 q P C R 技 术 和 比 浊 法 测 定 刺 参 L Y Z 的表 达 量 及 其 酶 活 性 。结 果 显 示 : 3种1?^八干扰重组质粒的沉默效率分别为40%、 45%、 0 % ;体 腔 注 射 1 ? ^ 八 干 扰重组质粒时, 各 组 织 中 L Y Z 的表达量均出现了显著的上升( P < 0 . 05),而 从 口 腔 注 射 时 , 体腔液和肌肉中 L Y Z 的表达量均出现极为显著的下降( P < 0 . 0 1 ) , 而在 管足中 未出 现 明 显 变化 ; 当 其 注 射 剂 量 为 0.5 p g 和 5 ju g 时 未 对 L Y Z 的 表 达 产 生 有 效 的 抑 制 作 用 ; 当 注 射 剂 量 为 10 ju g 和 25 ju g 时 , 刺 参 体 内 L Y Z 的表达受到了 明显抑制, 但 是 注 射 剂 量 为 25 ju g 时 , 部分刺参个体出现吐肠现象; 在 转 染 12 h 后 , 刺参体腔液、 肌肉、 体壁、 疣足和 管足组织中L Y Z 的表达量开始下降, 到 第 四 天 后 开 始 回 升 。表 明 : 只 有 从 口 腔 注 射 R N A 干扰重组质 粒 且 注 射 剂 量 达 到 10 f i g 时 才 能 有 效 地 抑 制 靶 基 因 的 表 达 ; 刺 参 体 内 R N A 干扰具有系统性, 可以在各个组织 间相互传导。 关键词: 刺参; 溶菌酶基因; R N A 干扰 中图分类号: S 917. 1 文献标识码: A RNA 干 扰 ( R N A in te rfe re n ce ) 是 指 双 链 R N A ( dsR N A )在 细 胞 内 特 异 性 的 诱 导 与 之 同 源 ana T e ro v a 等 [5]分别通过电脉冲和注射的方式成 功 地 将 d s R N A 和 s h R N A 导 人 海 鲈 体 内 。 N ao ki 等[7]的 研 究 表 明 动 物 体 内 R N A 干 扰存在剂量和 时间依赖性的效应。 刺 参 _ / a />om' ca 5 ) 具 有 较 高 的 经 济 价 值 和 药 用 价 值 [8], 是目前中国水产养殖业 的 主 要 养 殖 品 种 之 一 。但 是 , 近年来刺参细菌性 和病毒性病害屡屡大面积发生, 给养殖业者带来 了巨大损失[ ? ^ ° ] 。故 提 升 刺 参 养 殖 业 者 的 防 病 和 治 病 能 力 显 得 愈 发 迫 切 。溶菌酶是生物体内极 为重要的一种非特异性免疫因子, 在机体免疫过 程中不仅能催化水解细菌细胞壁而导致细菌溶解 死亡[11_ 12], 还 可 诱 导 其 他 免 疫 因 子 。水生动物血 清溶菌酶活力的高低是衡量机体免疫状态的指标 之 一 。血 清 溶 菌 酶 活 力 提 高 , 其免疫能力也相应 互 补 的 m R N A 的降解, 从而使相应基因的表达关 闭, 最终引发基因转录后水平沉默的现象 (P T G S )[1_ 3]。到 目 前 为 止 , R N A 干扰是最准确 和有效的在“ 体外” 和“ 体内” 条件下抑制特异基因 表 达 的方法[4]。现 在 , R N A 干扰技术被越来越广 泛 地 应 用 于 水 生 动 物 基 因 组 学 的 研 究 中 。G enciana T erova 等[5]利用 d s R N A 和 s h R N A 抑 制 肌 肉生长抑制素( M STN)的表达, 从而验证该基因 的 功 能 。L i u 等 [6]使 用 d s R N A 使 Q M 表 达 沉 默 , 表 明 Q M 对于凡纳滨对虾和太平洋白虾的主动 防 御 起 到 了 正 向 调 节 作 用 。在 进 行 体 内 R N A 干 扰时, 可以通过浸泡、 饲喂和注射等方式将人工构 建 的 R N A 干 扰 序 列 导 人 实 验 动 物 体 内 。G enci- 基金项目: 国家自然科学基金资助项目( 3 1 0 7 2 2 3 0 ); 国 家 自 然 科 学 基 金 资 助 项 目 ( 41106128); 国家高技术研究发展计划( 8 6 3 计 划 )( 2010A A10A 401 ) 。 作者筒介: 张 宇 鹏 ( 1989 — ) , 男, 硕士研究生, 研究方向: 刺 参 盐 度 相 关 基 因 的 功 能 验 证 。 sxzhangyupeiig@ 163. com 通讯作者: 田 談 ( 1979 — ) , 女, 副教授, 研究方向: 水产动物遗传育种, E—m ail: tianyi @ dlou. edu. cn 。 《 河北渔业》 2016年 第 9 期 ( 总 第 273期) ? 研究与探讨 表 1 m iR N A 干

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