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DGGE技术及其在海洋环境微生物_图文

第27卷第3期
2 0 0

海洋环境科学
MARINE ENVIRONMENTAL SCIENCE

V01.2 7,No.3

8年6月

June.2







DGGE技术及其在海洋环境微生物
多样性研究中的应用
张振冬1,王淑芬2,曹宇峰3
(1.国家海洋环境监测中心,辽宁大连116023;2.大连水产学院生命科学与技术学院,辽宁大连1160232;3.国家海洋局厦 门海洋环境监测中心站,福建厦门361002)

摘要:海洋环境中蕴藏着丰富的微生物资源,在海洋生物中显示出最丰富的生物多样性,在海洋生态系统中发挥着重要 的作用。由于传统研究方法的不足,目前对海洋微生物的认知只占其总量的l%。探索以及开发99%未知微生物的巨大资 源是一项艰巨而富有挑战性的任务,也具有广阔的前景。近年来,革新的分子生物学技术广泛应用于海洋微生物学研究领 域,推动了海洋微生物多样性研究的快速发展,扩展和加深了对海洋环境中微生物的认识。本文介绍了一种基于PCR技术 的现代分子生物学技术一DGGE的基本原理、关键环节及其在海洋微生物多样性研究中的应用,同时就其自身存在的缺点 进行了简单评价并提出了几点解决方案。 关键词:DGGE;海洋微生物多样性;微生物生态学;海洋极端微生物 中图分类号:Q178.53 文献标识码:A 文章编号:1007-6336(2008)03-0297-04

DGGE technique and its application in study
on

microbial diversity in marine environment
ZHANG

Zhen-don91,WANG Shu.fen2,CAO Yu.fen93
center,Dalian 116023,China;2.College
Monitoring Central of Life

(I.National

Marine

Envimnmantal

Monitoring

Science and Technology,Dalian

Fisheries University,Dalian 116023;3.Marine Environmental

Station ofXiamen,SOA,Xiamen 361002,Chi—

ha))

Abstract:The

microorganism is very

abundant

in

the

marine environment

and plays

important
to

role

in marine

ecological system.But

we

know little about methods.In

the marine microorganism

resoUl'tes

and

microbial waB

diversity,owing
in

the limitation of the traditional microbiology
marine

recent

years,the modem molecular bin—technique
of

widely used

the study of the
application of DGGE

microbial ecology,which
to

fa—

cilitates the development

microbial diversity.In the
are

present

paper,the principle and

of DGGE technique used
were

analyze

the microbial communities

described.Furthermore.the

potentials and disadvantages

a1日o discussed.

Key words:DGGE;marine

microbial diversity;microbial ecology;marine

extreme microorganism

海洋环境微生物学作为生命科学、环境科学及海洋 科学紧密渗透、相互交叉的新兴学科,近年来有着突飞猛 进的发展。近日,来自美国、荷兰和西班牙的科学家组成 的研究小组在《美国国家科学院院刊》上发表文章说,生 活在海洋中的微生物种类可能达到500—1000万种,占据 了海洋生命形态总数的98%之多。海洋环境中的微生物 不仅在种类上丰富,在基因组成和功能上同样具有多样 性,保证微生物能够适应海洋高盐、高压、低温、低营养和

无光照等特殊区域生态环境,使微生物能在特殊,甚至极 端环境中存活。微生物是海洋生物群落的一个重要组成 部分,作为分解者和次级生产者,某些种类还是初级生产 者,在海洋生态系的生源要素的循环中起着重要的作用。 因此开展海洋微生物多样性(marine
microbial

diversity)的

研究,不断加深对海洋微生物资源的认知,探讨典型微生 物的生态分布、群落结构特点以及动态变化规律,对于分 析微生物在海洋生态系统中物质循环和能量流动中的作

收稿日期:2007-04—16.修订日期:2008-03-03 基金项目:国家海洋局近岸海域生态环境重点实验室开放基金(200503) 作者简介:张振冬(1977一),男,河北省唐山市人,博士,助理研究员,主要从事海洋环境微生物学研究,E-mail:zdzhang@nmemc.
gov·cn

 

298

海洋环境科学

第27卷

用、丰富海洋生物基因资源库、开发海洋生物活性物质、 保护和修复海洋生态环境等方面的深入研究都具有极其 重要的意义。可目前只有约5000种海洋微生物获得官方 命名和描述。这主要是由于自然环境中绝大部分细菌 (>85%~99.999%)以目前的培养手段是不可培养 的11.2.3 J,以培养为基础的传统方法严重制约了海洋微生 物多样性研究的快速发展。 自1985年Pace等H1利用核酸测序方法来研究微生 物的进化问题以来,分子生物学技术逐渐被引入到海洋 微生物多样性研究中,包括PCR及相关技术、分子杂交技 术、基因指纹图谱技术、克隆基因文库技术以及多种方法 相结合的技术等。现代分子生物技术是在基因水平上研 究海洋微生物的多样性,打破了传统的以培养为基础的 微生物研究方法的制约,能够更快速、客观、精确地揭示 海洋微生物的多样性。 近几年来,变性梯度凝胶电泳(denaturing
gradient gel

些都决定了研究者必须选择高效、无偏差的DNA提取法。 使提取的DNA能很好地代表海洋微生物群落的真实性 和异质性。由于不同海洋生境的物理和化学特性的差 异,针对不同生境的微生物群落需要选择不同的DNA提 取方法”J。检验选择的DNA提取法是否合适主要有以 下标准:①DNA的得率。在DNA不发生降解的前提下, DNA的得率越高说明选择的DNA提取方法效率越高。 ②能否进行PCR扩增以及扩增的重复性好坏。PCR扩增 时模板浓度必须>0.5 ng,否则不能得到PCR扩增产 物旧1。Webster等"o在研究中发现JRM法(1ysozyme/pro-
teinase

K,phen01.chloroform)在提取海底沉积物中微生物

群落总DNA时,虽然DNA得率较高(10×104湿重沉积 物),但是PCR扩增重复性很差,因此也不能算是合适的 DNA提取法。③制备DNA花费时间的长短。有时需要 对样品进行快速、批量处理,这时就要选择试剂盒等省 时、易操作的DNA提取法。影响DNA的提取效率的主要 因素有:细胞是否充分裂解、核酸是否降解及DNA纯化过 程中损失程度等因素。细胞裂解法包括物理裂解法和化 学裂解法。物理裂解法包括反复冻融法和玻璃珠破碎法 等。化学裂解法有溶菌酶、去污剂和苯酚裂解法等。根 据实际情况可以选择一种或几种裂解法使微生物细胞充 分裂解。
2.2

electrophoresis,DGGE)技术作为一种基于PCR的基因指 纹图谱技术,在海洋微生物多样性的研究中得到越来越 广泛的应用。本文综述了DGGE的基本原理与关键环 节、其在海洋微生物多样性研究中的应用,同时就其自身 存在的缺点进行了简单评价并提出了几点解决方案。


DGGE的基本原理
DGGE技术不是基于核酸分子量的不同,而是根据序

PCR扩增偏差及其优化 DGGE是一种基于PCR的分子生物学技术,DGGE在

列的不同,将片段大小相同的DNA序列分开。因四种碱 基的组成和排列差异,不同序列的双链DNA分子具有不 同的融解温度,最终导致电泳迁移率的差异。当双链 DNA分子在含梯度变性剂(如尿素、甲酰胺)的聚丙烯酰 胺凝胶中进行电泳时,由于电泳迁移率的差异,使不同序 列的DNA片段滞留于凝胶的不同位置,从而形成相互分 开的带谱。理论认为,只要选择的电泳条件如变性剂梯 度、电泳时间、温度等足够精细,有一个碱基差异的DNA 片段都可被分开。 DGGE研究微生物群落的一般步骤:
样品预处理
l 核酸的提取

海洋微生物多样性研究中所使用的PCR一般为多重横板 PCR(multitemplate PCR),即DNA模板为多种序列的混合 物。在多重PCR中很容易产生PCR偏差和PCR假阳性, 这样就不能真实客观地反映微生物群落的多样性,甚至 显示实际上并不存在的微生物信息。下面就简要介绍一 下常见的PCR偏差和PCR假阳性及其排除方法。 ①由引物与模板的退火温度引起的PCR偏差。在多 重横板PCR中,引物不可能与所有的模板序列都完全互 补,两者之间会有一个或几个碱基的错配,大大降低了这 类模板的扩增效率,这样就会产生严重的PCR偏差。排 除这种PCR偏差的方法是适当降低退火温度¨o或使用简 并引物(degenerate primer)L9 J。简并引物是根据遗传密 码子的简并性而设计的一组多种引物序列的混合物,序 列的大部分是相同的,但在某些位点有所变化。不同的 引物与其互补性高的模板退火,从而提高PCR的扩增效 率。②在PCR最终产物中,不同序列浓度趋于1:1,掩盖 了模板起始浓度的差异。这是由于起始浓度低的模板经 扩增后其PCR产物又作为模板继续扩增,且在PCR的最 后几个循环其扩增效率高于PCR产物更为丰富的其他序 列(优先发生同源结合。而非引物与模板退火¨叫),使最 终产物浓度趋于l:1。排除这种PCR偏差的方法是减少 PCR循环数,提高从变性温度到退火温度的降温速率¨…。 ③异源DNA序列的产生。这是由于随着PCR扩增循环 数的增加,产物浓度逐渐增高,引物逐渐减少,异源单链 DNA分子退火的可能性大大增加,从而产生异源DNA分 子。在DGGE电泳中,就会产生多余的条带,得出错误的 关于微生物群落多样性的结论。排除这种PCR偏差的方 法是减少PCR循环数,或是将PCR产物稀释后,再作为

I一引物设计
PCR扩增 l

DGGE电泳一克隆
l I

目的基因测序.--PER扩增


序列同源性比较


系统进化树分析 2
2.1

DGGE技术的关键环节及系统优化
DNA的提取 群落总DNA的提取是DGGE研究微生物群落的基

础。某些海洋生境如洋底底层和海洋极端环境中微生物 含量极低,而且取样难度很大,样品非常珍贵和有限,这

 

第3期

张振冬,等:DGGE技术及其在海洋环境微生物多样性研究中的应用

299

模板进行PCR扩增¨“。④由于DNA序列的不完全延伸 造成的PCR假阳性。在这种情况下,DGGE电泳图谱中 条带数明显增加。适当延长最后的延伸时间即可排除这 种PCR假阳性¨“。⑤由于DNA延伸过程中模板转换而 造成的PCR假阳性。这种PCR假阳性也是易发生在 PCR最后几个循环模板浓度变的足够高时¨3|。⑥引物与 模板随机退火引起的PCR假阳性。这可能是由于模板起 始浓度和退火温度比较低造成的。
2.3

的群落结构。DGGE研究了古菌群落随深度的动态变化, 结果显示,古菌群落的复杂程度与深度成正比。Steven 等Ⅲo应用DGGE技术研究了太平洋沿岸多个位点海藻病 毒群落的多样性及其空间动态变化,结果显示不同位点 几乎具有相同的海藻病毒群落多样性,说明海藻病毒在 自然界中分布广泛。


DGGE技术的发展--DG—DGGE技术
在原有的单一变性梯度的基础上引进凝胶梯度,形

GC夹板(GC—clamp)技术 GC夹板技术是通过PCR技术将一段含有30一50

成双梯度DGGE(double

gradient denaturing gradient gel

e—

bp、具有较高解链温度的GC片段引入到模板DNA扩增 产物的一端,使DNA序列的原有部分处于低温解链区从 而得到更好的分离。GC夹板技术可使DGGE技术对于
50—1000

lectrophoresis,DG—DGGE)技术,进一步减缓条带的迁移, 提高分离效果。James等。2u应用DG-DGGE分析了植被、 沉积层厚度和季节对海草沉积层中细菌群落结构的影 响。Petri等忸。应用DG—DGGE研究了西波罗的海海冰垂 直成层结构中细菌群落的遗传多样性。结果显示。每层 海冰中都有特征菌,这些细菌分别属于能够进行发酵作 用的Propionibacterium属和Bacteroides属细菌以及能够 进行光合作用的紫硫光合细菌。


bp的DNA序列多态性的检出率由原来的50%

提高到100%¨“。GC夹板的长度没有严格的规定,30~
50

bp都可以。其核苷酸序列虽没有严格的规定,但是应

避免含有间接重复序列,且由于DNA合成酶对于连续多 个G碱基的加入存在困难,其序列大部分由c碱基组

成㈨。
2.4

DGGE最佳电泳条件的选择 DGGE电泳条件选择包括变性剂梯度、电泳时间和温

DGGE的缺点
DGGE在海洋微生物多样性研究中显示了巨大的优

度的确定。理论认为,只要选择的电泳条件足够精细,有 一个碱基差异的DNA片段都可被分开。DGGE电泳条件 一般通过经验数据或反复实验来确定。一般用垂直变性 梯度实验来确定所要研究的DNA片段的解链性质、变性 剂浓度梯度。在垂直变性梯度实验中,DNA分子的运动 方向与变性剂梯度线性增加方向垂直。电泳完成后用EB 染色,DNA片段经凝胶成像系统呈现出一条清晰的“S”型 曲线。变性剂梯度范围应选在垂直实验曲线斜率较大的 部分,此时多数分子处于部分变性状态,这使得落人低温 解链区的不同分子达到最佳分离状态¨“。对绝大多数天 然的DNA片段50℃~65℃是比较适合的。最佳解链温 度是由平行凝胶电泳实验确定的。电泳时间则是根据 DNA片段的分离情况来确定。


越性,但其自身也存在一些缺点。①只能分离较小的片 段(<500 bp),对于大片段的分离效率下降。因此给引物 设计和系统发育分析带来一定困难。②DGGE图谱中单 一的条带并不总是代表单一的菌株,或是在不同的泳道 中移动到同一位置的条带可能由不同的细菌组成。Se. higuchi等旧。在实验中发现DGGE图谱中的单一条带不 能被测序,对带中DNA进行克隆和基因文库研究发现,此 条带中包含多条不同的DNA序列。③DGGE通常显示群 落中优势种类的rDNA片段ⅢJ。只有占整个群落细菌数 量约I%或以上的类群能够通过DGGE检测到¨“。④由 于某些种类的16S rDNA不同拷贝之间的多态性问题,可 能导致自然群落中细菌数量的过多估计旧J。⑤DGGE技 术对微生物的分类鉴定依赖于基因数据库,若数据库中 基因序列信息不够丰富,将会限制DGGE的使用。

DGGE在海洋微生物多样性研究中的应用
1993年Muyer等¨钊首次将PCR.DGGE引入到微生

6减少实验偏差的方法
对于以上存在的缺陷,除从上面提到的DNA提取方 法、PCR扩增条件、DGGE电泳条件和引入GC夹板结构 等方面进行系统优化外,还可以从以下两点着手解决:① 选择合适的目的基因片段。根据研究目的的不同,选择 合适的目的基因片段可将微生物鉴定到类、属、种、菌株 等不同分类层次Ⅲz川。②与克隆、测序、核酸杂交、RFLP 等技术联用¨引,不仅可以克服单一技术存在的缺陷.对实 验结果进行交叉验证,还可以更准确的从不同方面反映 环境中微生物多样性信息。

物生态学的研究中。近几年来,DGGE已广泛用于分析生 活在高盐、高压、低温、低营养、无光照和污染等海洋区域 生态环境,甚至极端环境中的细菌、古菌、微微型真核生 物和病毒群落多样性及其动态变化。 Alexander等¨川应用定量竞争PCR.DGGE(quantita.
tive competitive

PCR—DGGE,QC—PCR-DGGE)技术对波罗

的海(Baltic Sea)和斯卡格拉克海峡(Skagerrak Sea)海水 中弧菌(Vibrio)群落进行了定性和定量检测。Beatriz 等¨划应用DGGE技术研究了地中海东南海域不同深度和 不同位点海洋微微型真核生物(picoeukaryotic)群落多样 性。其结果与克隆文库和RFLP(restriction
fragment

len昏h

7展望
综上所述,PCR—DGGE在研究海洋微生物多样性方面 是非常有效的,能够提供更多微生物之间或微生物与周 围环境之间相互关系的信息,同时作为一种有效的遗传 指纹图谱技术已经被广泛应用于海洋微生物生态学研究

polymorphism)技术分析相同样品所得结果基本一致,证 明DGGE是一种行之有效的研究自然环境中微微型真核 生物群落多样性的分子生物学方法。Costantino等¨引应 用多种分子生物学方法研究了大西洋深海沉积物中古菌

 

海洋环境科学 的其他方面,如检测rRNA编码基因的异质性、比较不同 DNA提取法的效率、评估PCR和克隆偏差等。预期在以 后的海洋微生物生态学研究中,该方法还会得到更进一 步完善和广泛应用。
ment nomie in of

第27卷
of


40·base·pair G+C-rich
fragments

DNA

by

the

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DGGE技术及其在海洋环境微生物多样性研究中的应用
作者: 作者单位: 张振冬, 王淑芬, 曹宇峰, ZHANG Zhen-dong, WANG Shu-fen, CAO Yu-feng 张振冬,ZHANG Zhen-dong(国家海洋环境监测中心,辽宁,大连,116023), 王淑芬,WANG Shufen(大连水产学院,生命科学与技术学院,辽宁,大连,1160232), 曹宇峰,CAO Yu-feng(国家 海洋局厦门海洋环境监测中心站,福建,厦门,361002) 海洋环境科学 MARINE ENVIRONMENTAL SCIENCE 2008,27(3) 3次

刊名: 英文刊名: 年,卷(期): 引用次数:

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相似文献(0条)

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