当前位置:首页 >> 农林牧渔 >>

DGGE技术及其在海洋环境微生物多样性研究中的应用

第 27 卷   3 期 第
2 0 0 8年 6月

海 洋 环 境 科 学 MAR I E ENV IRONM EN TAL SC IENCE N

Vol. 2 7 , No . 3 June . 2 0 0 8

DGGE技术及其在海洋环境微生物

多样性研究中的应用
张振冬 ,王淑芬 ,曹宇峰
门海洋环境监测中心站 ,福建 厦门 361002) 摘   : 海洋环境中蕴藏着丰富的微生物资源 ,在海洋生物中显示出最丰富的生物多样性 , 在海洋生态系统中发挥着重要 要 的作用 。由于传统研究方法的不足 ,目前对海洋微生物的认知只占其总量的 1% , 探索以及开发 99%未知微生物的巨大资 源是一项艰巨而富有挑战性的任务 ,也具有广阔的前景 。近年来 , 革新的分子生物学技术广泛应用于海洋微生物学研究领 域 ,推动了海洋微生物多样性研究的快速发展 ,扩展和加深了对海洋环境中微生物的认识 。本文介绍了一种基于 PCR 技术 的现代分子生物学技术 —DGGE 的基本原理 、 关键环节及其在海洋微生物多样性研究中的应用 , 同时就其自身存在的缺点 进行了简单评价并提出了几点解决方案 。 关键词 : DGGE; 海洋微生物多样性 ; 微生物生态学 ; 海洋极端微生物 中图分类号 : Q178. 53    文献标识码 : A    文章编号 : 1007 2 6336 ( 2008) 03 2 0297 2 04
1 2

3

1

2

3

(1. 国家海洋环境监测中心 ,辽宁 大连 116023; 2. 大连水产学院 生命科学与技术学院 ,辽宁 大连 1160232; 3. 国家海洋局厦

D GGE techn ique and its applica tion in study on m icrob ia l d iversity in mar in e env ironm en t
ZHANG Zhen2dong ,WANG Shu 2fen , CAO Yu 2feng
3

   ( 1. National Marine Environmantal Monitoring center, Dalian 116023, China; 2. College of L ife Science and Technology, Dalian
na) ) Fisheries University, Dalian 116023; 3. Marine EnvironmentalMonitoring Central Station of Xiamen, SOA , Xiamen 361002, Chi2

Abstract: The m icroorganis is very abundant in the marine environment and p lays important role in marine ecological system. But we m

know little about the marine m icroorganism resources and m icrobial diversity, owing to the lim itation of the traditional m icrobiology

   海洋环境微生物学作为生命科学 、 环境科学及海洋 科学紧密渗透 、 相互交叉的新兴学科 , 近年来有着突飞猛 进的发展 。近日 ,来自美国 、 荷兰和西班牙的科学家组成 的研究小组在《美国国家科学院院刊 》 上发表文章说 , 生 活在海洋中的微生物种类可能达到 500 ~1000 万种 ,占据 了海洋生命形态总数的 98%之多 。海洋环境中的微生物 不仅在种类上丰富 , 在基因组成和功能上同样具有多样 性 ,保证微生物能够适应海洋高盐 、 高压 、 低温 、 低营养和

gov cn .

3  收稿日期 : 2007 2 2 修订日期 : 2008 2 2 04 16, 03 03

  基金项目 : 国家海洋局近岸海域生态环境重点实验室开放基金 ( 200503)   作者简介 : 张振冬 ( 1977 2) ,男 ,河北省唐山市人 , 博士 , 助理研究员 , 主要从事海洋环境微生物学研究 , E 2 mail: zdzhang@ nmemc.

methods. In recent years, the modern molecular bio2technique was widely used in the study of the marine m icrobial ecology, which fa2 cilitates the development of m icrobial diversity In the p resent paper, the p rincip le and app lication of DGGE technique used to analyze . the m icrobial communities are described. Furthermore, the potentials and disadvantages of DGGE were also discussed. Key words: DGGE; marine m icrobial diversity; m icrobial ecology; marine extreme m icroorganis m

无光照等特殊区域生态环境 , 使微生物能在特殊 , 甚至极 端环境中存活 。微生物是海洋生物群落的一个重要组成 部分 ,作为分解者和次级生产者 , 某些种类还是初级生产 者 ,在海洋生态系的生源要素的循环中起着重要的作用 。 因此开展海洋微生物多样性 (marine m icrobial diversity)的 研究 ,不断加深对海洋微生物资源的认知 , 探讨典型微生 物的生态分布 、 群落结构特点以及动态变化规律 , 对于分 析微生物在海洋生态系统中物质循环和能量流动中的作

  298

海          洋 环 境 科 学

第 27 卷

用、 丰富海洋生物基因资源库 、 开发海洋生物活性物质 、 保护和修复海洋生态环境等方面的深入研究都具有极其 重要的意义 。可目前只有约 5000 种海洋微生物获得官方 命名和描述 。这主要是由于自然环境中绝大 部分细菌 ( > 85% ~ 99. 999% ) 以 目 前 的 培 养 手 段 是 不 可 培 养 的 [ 1, 2, 3 ] ,以培养为基础的传统方法严重制约了海洋微生 物多样性研究的快速发展 。 自 1985 年 Pace等 [ 4 ]利用核酸测序方法来研究微生 物的进化问题以来 , 分子生物学技术逐渐被引入到海洋 微生物多样性研究中 ,包括 PCR 及相关技术 、 分子杂交技 术、 基因指纹图谱技术 、 克隆基因文库技术以及多种方法 相结合的技术等 。现代分子生物技术是在基因水平上研 究海洋微生物的多样性 , 打破了传统的以培养为基础的 微生物研究方法的制约 , 能够更快速 、 客观 、 精确地揭示 海洋微生物的多样性 。 近几年来 ,变性梯度凝胶电泳 ( denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)技术作为一种基于 PCR 的基因指 纹图谱技术 ,在海洋微生物多样性的研究中得到越来越 广泛的应用 。本文综述了 DGGE 的基本原理 与关键环 节、 其在海洋微生物多样性研究中的应用 , 同时就其自身 存在的缺点进行了简单评价并提出了几点解决方案 。

1  DGGE 的基本原理
DGGE技术不是基于核酸分子量的不同 ,而是根据序 列的不同 ,将片段大小相同的 DNA 序列分开 。因四种碱 基的组成和排列差异 , 不同序列的双链 DNA 分子具有不 同的融 解 温 度 , 最 终 导 致 电 泳 迁 移 率 的 差 异 。当 双 链 DNA 分子在含梯度变性剂 (如尿素 、 甲酰胺 ) 的聚丙烯酰 胺凝胶中进行电泳时 ,由于电泳迁移率的差异 , 使不同序 列的 DNA 片段滞留于凝胶的不同位置 , 从而形成相互分 开的带谱 。理论认为 , 只要选择的电泳条件如变性剂梯 度、 电泳时间 、 温度等足够精细 , 有一个碱基差异的 DNA 片段都可被分开 。

2  DGGE 技术的关键环节及系统优化
2. 1  DNA 的提取

群落总 DNA 的提取是 DGGE 研究微生物群落的基 础 。某些海洋生境如洋底底层和海洋极端环境中微生物 含量极低 , 而且取样难度很大 , 样品非常珍贵和有限 , 这

些都决定了研究者必须选择高效 、 无偏差的 DNA 提取法 , 使提取的 DNA 能很好地代表海洋微生物群落的真实性 和异质性 。由于不同海洋生境的物理和化学特性的差 异 ,针对不同生境的微生物群落需要选择不同的 DNA 提 取方法 [ 5 ] 。检验选择的 DNA 提取法是否合适主要有以 下标准 : ①DNA 的得率 。在 DNA 不发生降解的前提下 , DNA 的得率越高说明选择的 DNA 提取方法效率越高 。 ② 能否进行 PCR 扩增以及扩增的重复性好坏 。 PCR 扩增 时模板浓 度必 须 > 0. 5 ng, 否 则 不 能 得 到 PCR 扩 增 产 物 [ 6 ] 。W ebster等 [ 7 ]在研究中发现 JRM 法 ( lysozyme /p ro2 teinase K, phenol2chloroform )在提取海底沉积物中微生物 群落总 DNA 时 , 虽然 DNA 得率较高 ( 10 × 29湿重沉积 10 物 ) ,但是 PCR 扩增重复性很差 , 因此也不能算是合适的 DNA 提取法 。 ③ 制备 DNA 花费时间的长短 。有时需要 对样品进行快速 、 批量处理 , 这时就要选择试剂盒等省 时、 易操作的 DNA 提取法 。影响 DNA 的提取效率的主要 因素有 : 细胞是否充分裂解 、 核酸是否降解及 DNA 纯化过 程中损失程度等因素 。细胞裂解法包括物理裂解法和化 学裂解法 。物理裂解法包括反复冻融法和玻璃珠破碎法 等 。化学裂解法有溶菌酶 、 去污剂和苯酚裂解法等 。根 据实际情况可以选择一种或几种裂解法使微生物细胞充 分裂解 。 2. 2  PCR 扩增偏差及其优化 DGGE是一种基于 PCR 的分子生物学技术 , DGGE 在 海洋微生物多样性研究中所使用的 PCR 一般为多重横板 PCR (multitemp late PCR ) ,即 DNA 模板为多种序列的混合 物 。在多重 PCR 中很容易产生 PCR 偏差和 PCR 假阳性 , 这样就不能真实客观地反映微生物群落的多样性 , 甚至 显示实际上并不存在的微生物信息 。下面就简要介绍一 下常见的 PCR 偏差和 PCR 假阳性及其排除方法 。 ① 由引物与模板的退火温度引起的 PCR 偏差 。在多 重横板 PCR 中 ,引物不可能与所有的模板序列都完全互 补 ,两者之间会有一个或几个碱基的错配 , 大大降低了这 类模板的扩增效率 , 这样就会产生严重的 PCR 偏差 。排 除这种 PCR 偏差的方法是适当降低退火温度 [ 8 ]或使用简 并引物 ( degenerate p rim er) [ 9 ] 。简并引物是根据遗传密 码子的简并性而设计的一组多种引物序列的混合物 , 序 列的大部分是相同的 , 但在某些位点有所变化 。不同的 引物与其互补性高的模板退火 , 从而提高 PCR 的扩增效 率 。 ② PCR 最终产物中 ,不同序列浓度趋于 1 ∶ 掩盖 在 1, 了模板起始浓度的差异 。这是由于起始浓度低的模板经 扩增后其 PCR 产物又作为模板继续扩增 ,且在 PCR 的最 后几个循环其扩增效率高于 PCR 产物更为丰富的其他序 列 (优先发生同源结合 , 而非引物与模板退火 [ 10 ] ) , 使最 终产物浓度趋于 1 ∶。排除这种 PCR 偏差的方法是减少 1 [ 10 ] PCR 循环数 ,提高从变性温度到退火温度的降温速率 。 ③ 异源 DNA 序列的产生 。这是由于随着 PCR 扩增循环 数的增加 , 产物浓度逐渐增高 , 引物逐渐减少 , 异源单链 DNA 分子退火的可能性大大增加 ,从而产生异源 DNA 分 子 。在 DGGE电泳中 ,就会产生多余的条带 , 得出错误的 关于微生物群落多样性的结论 。排除这种 PCR 偏差的方 法是减少 PCR 循环数 , 或是将 PCR 产物稀释后 , 再作为

第 3期

张振冬 ,等 : DGGE技术及其在海洋环境微生物多样性研究中的应用

299  

模板进行 PCR 扩增 [ 11 ] 。 ④ 由于 DNA 序列的不完全延伸 造成的 PCR 假阳性 。在这种情况下 , DGGE 电泳图谱中 条带数明显增加 。适当延长最后的延伸时间即可排除这 种 PCR 假阳性 [ 12 ] 。 ⑤ 由于 DNA 延伸过程中模板转换而 造成的 PCR 假 阳 性 。这 种 PCR 假 阳 性 也 是 易 发 生 在 [ 13 ] PCR 最后几个循环模板浓度变的足够高时 。⑥ 引物与 模板随机退火引起的 PCR 假阳性 。这可能是由于模板起 始浓度和退火温度比较低造成的 。 2. 3  GC 夹板 ( GC 2clamp )技术 GC 夹板技术是通过 PCR 技术将一段含有 30 ~ 50 bp、 具有较高解链温度的 GC 片段引入到模板 DNA 扩增 产物的一端 ,使 DNA 序列的原有部分处于低温解链区从 而得到更好的分离 。 GC 夹板技术可使 DGGE 技术对于 50 ~1000 bp 的 DNA 序列多态性的检出率由原来的 50% 提高到 100% [ 14 ] 。 GC夹板的长度没有严格的规定 , 30 ~ 50 bp 都可以 。其核苷酸序列虽没有严格的规定 ,但是应 避免含有间接重复序列 , 且由于 DNA 合成酶对于连续多 个 G 碱基的加入存在困难 , 其序列大部分由 C 碱基组 成 [ 14 ] 。 2. 4  DGGE最佳电泳条件的选择 DGGE电泳条件选择包括变性剂梯度 、 电泳时间和温 度的确定 。理论认为 ,只要选择的电泳条件足够精细 , 有 一个碱基差异的 DNA 片段都可被分开 。DGGE 电泳条件 一般通过经验数据或反复实验来确定 。一般用垂直变性 梯度实验来确定所要研究的 DNA 片段的解链性质 、 变性 剂浓度梯度 。在垂直变性梯度实验中 , DNA 分子的运动 方向与变性剂梯度线性增加方向垂直 。电泳完成后用 EB 染色 , DNA 片段经凝胶成像系统呈现出一条清晰的“S” 型 曲线 。变性剂梯度范围应选在垂直实验曲线斜率较大的 部分 ,此时多数分子处于部分变性状态 , 这使得落入低温 解链区的不同分子达到最佳分离状态 [ 15 ] 。对绝大多数天 然的 DNA 片段 50 ℃~65 ℃是比较适合的 。最佳解链温 度是由平行凝胶电泳实验确定的 。电泳时间 则是根据 DNA 片段的分离情况来确定 。

的群落结构 。DGGE研究了古菌群落随深度的动态变化 , 结果显示 , 古菌群落的复杂程度与深度成正比 。 Steven 等 [ 20 ]应用 DGGE技术研究了太平洋沿岸多个位点海藻病 毒群落的多样性及其空间动态变化 , 结果显示不同位点 几乎具有相同的海藻病毒群落多样性 , 说明海藻病毒在 自然界中分布广泛 。

3  DGGE 在海洋微生物多样性研究中的应用
1993 年 M uyer等
[ 16 ]

首次将 PCR 2 DGGE 引入到微生 物生态学的研究中 。近几年来 , DGGE 已广泛用于分析生 活在高盐 、 高压 、 低温 、 低营养 、 无光照和污染等海洋区域 生态环境 , 甚至极端环境中的细菌 、 古菌 、 微微型真核生 物和病毒群落多样性及其动态变化 。 [ 17 ] A lexander等 应用定量 竞 争 PCR 2 DGGE ( quantita2 tive competitive PCR 2 DGGE, QC 2PCR 2 DGGE ) 技术对波罗 的海 (Baltic Sea)和斯卡格拉克海峡 ( Skagerrak Sea) 海水 中弧菌 (V ibrio ) 群 落 进 行 了 定 性 和 定 量 检 测 。 Beatriz 等 [ 18 ]应用 DGGE技术研究了地中海东南海域不同深度和 不同位点海洋微微型真核生物 ( p icoeukaryotic) 群落多样 性 。其结果与克隆文库和 RFLP ( restriction fragment length polymorphism )技术分析相同样品所得结果基本一致 , 证 明 DGGE是一种行之有效的研究自然环境中微微型真核 生物群落多样性的分子生物学方法 。 Costantino 等 [ 19 ] 应 用多种分子生物学方法研究了大西洋深海沉积物中古菌

在原有的单一变性梯度的基础上引进凝胶梯度 , 形 成双梯度 DGGE ( double gradient denaturing gradient gel e2 lectrophoresis, DG2 DGGE) 技术 , 进一步减缓条带的迁移 , 提高分离效果 。 James等 [ 21 ]应用 DG2 DGGE 分析了植被 、 沉积层厚度和季节对海草沉积层中细菌群落结构的影 响 。 Petri等 [ 22 ]应用 DG2 DGGE研究了西波罗的海海冰垂 直成层结构中细菌群落的遗传多样性 。结果显示 , 每层 海冰中都有特征菌 , 这些细菌分别属于能够进行发酵作 用的 Prop ionibacterium 属和 Bacteroides 属细菌以及能够 进行光合作用的紫硫光合细菌 。

DGGE在海洋微生物多样性研究中显示了巨大的优 越性 , 但其自身也存在一些缺点 。 ① 只能分离较小的片 段 ( < 500 bp ) ,对于大片段的分离效率下降 。因此给引物

设计和系统发育分析带来一定困难 。 ②DGGE 图谱中单 一的条带并不总是代表单一的菌株 , 或是在不同的泳道 中移动到同一位置的条带可能由不同的细菌组成 。 Se2 [ 23 ] higuchi等 在实验中发现 DGGE 图谱中的单一条带不 能被测序 ,对带中 DNA 进行克隆和基因文库研究发现 ,此 条带中包含多条不同的 DNA 序列 。 ③DGGE 通常显示群 落中优势种类的 rDNA 片段 [ 24 ] 。只有占整个群落细菌数 量约 l%或以上的类群能够通过 DGGE 检测到 [ 16 ] 。 ④ 由 于某些种类的 16S rDNA 不同拷贝之间的多态性问题 ,可 能导致自然群落中细菌数量的过多估计 [ 25 ] 。 ⑤DGGE 技 术对微生物的分类鉴定依赖于基因数据库 , 若数据库中 基因序列信息不够丰富 ,将会限制 DGGE的使用 。

对于以上存在的缺陷 ,除从上面提到的 DNA 提取方 法 、 扩增条件 、 PCR DGGE 电泳条件和引入 GC 夹板结构 等方面进行系统优化外 ,还可以从以下两点着手解决 : ① 选择合适的目的基因片段 。根据研究目的的不同 , 选择 合适的目的基因片段可将微生物鉴定到类 、 、 、 属 种 菌株 [ 26, 27 ] 等不同分类层次 。② 与克隆 、 测序 、 核酸杂交 、 RFLP 等技术联用 [ 19 ] ,不仅可以克服单一技术存在的缺陷 ,对实 验结果进行交叉验证 , 还可以更准确的从不同方面反映 环境中微生物多样性信息 。

综上所述 , PCR 2 DGGE在研究海洋微生物多样性方面 是非常有效的 ,能够提供更多微生物之间或微生物与周 围环境之间相互关系的信息 , 同时作为一种有效的遗传 指纹图谱技术已经被广泛应用于海洋微生物生态学研究

4  DGGE 技术的发展 —DG2 DGGE 技术 5  DGGE 的缺点 6  减少实验偏差的方法 7    展 望

  300

海          洋 环 境 科 学

第 27 卷

的其他方面 ,如检测 rRNA 编码基因的异质性 、 比较不同 DNA 提取法的效率 、 评估 PCR 和克隆偏差等 。预期在以 后的海洋微生物生态学研究中 , 该方法还会得到更进一 步完善和广泛应用 。

参考文献 :
[ 1 ] KUSKE C, BARNS S, BUSCH J. D iverse uncultivated bacterial group s from soils of the arid southwestern United States that are p resent in many geographic regions [ J ]. App lied and environ2 mental m icrobiology, 1997, 63 ( 9) : 3614 2 3621. [ 2 ] R ; LEKE S, MUYZER G, WAW ER C, et a l Identification of . Bacteria in a biodegraded wall painting by denaturing gradient gel electrophoresis of PCR 2 Amp lified gene fragments coding for 16S rRNA [ J ]. App lied and Environmental M icrobiology, 1996, 62 ( 6) : 2059 2 2065. [ 3 ] TORSV IK V , GOKS YR J, DAAE F L. H igh diversity in DNA of soil bacteria [ J ]. App lied and Environmental M icrobiology, 1990, 56 ( 3) : 782 2 787. [ 4 ] PACE N R. A molecular viewer of m icrobial diversity and the bi2 osphere[ J ]. Science, 1997, 276: 734 2 740. [ 5 ] LA I X T, ZENG X F, FANG S, et al Denaturing gradient gel . electrophoresis (DGGE) analysis of bacterial community compo2 1345. [ 6 ] MUTTER G L , BOYNTON K A. PCR bias in amp lification of androgen recep tor alleles, a trinucleotide repeat marker used in clonality studies [ J ]. Nucleic Acids Research, 1995, 23 ( 8 ) : 1411 2 1418. [ 7 ] W EBSTER G, NEWBERY C J, FRY J C, et a l A ssessment of . bacterial community structure in the deep sub 2seafloor biosphere by 16S rDNA 2based techniques: a cautionary tale[ J ]. Journal of M icrobiological Methods, 2003, 55 ( 1) : 155 2 164. [ 8 ] ISH II K, FUKU IM. Op tim ization of annealing temperature to re2 duce bias caused by a p rim er m ismatch in multitemp late PCR [ J ]. App lied and Environmental M icrobiology, 2001, 67 ( 8 ) : 3753 2 3755. [ 9 ] POLZ M F, CAVANAUGH C M. B ias in Temp late2to 2Product Ratios in Multitemp late PCR [ J ]. App lied and Environmental M icrobiology, 1998, 64 ( 10) : 3724 2 3730. [ 10 ] KURATA S, KANAGAWA T, MAGAR IYAMA Y, et al Re2 . evaluation and reduction of a PCR bias caused by reannealing of temp lates[ J ]. App lied and EnvironmentalM icrobiology, 2004, 70 ( 12) : 7545 2 7549. [ 11 ] THOMPSON J R, MARCEL I O L A , POLZ M F. Heterodu2 N

p lexes in m ixed 2temp late amp lifications: formation, conse2 quence and elim ination by ’reconditioning PCR ’ [ J ]. Nucleic Acids Research, 2002, 30 ( 9) : 2083 2 2088. [ 12 ] JANSE I, BOK J, Z WART G A simp le remedy against artifac2 . tual double bands in denaturing gradient gel electrophoresis [ J ]. Journal of M icrobiological Methods, 2004, 57 ( 2 ) : 279 2 281. [ 13 ] PATEL P, L I C, LANEY M , et al Formation of chim eric N . DNA p rim er extension p roducts by temp late switching onto an annealed downstream oligonucleotide [ J ]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1996, 93 ( 7) : 2969 2 2974. [ 14 ] SHEFF IELD V C, COX D R, LERMAN L S, et a l A ttach2 .

sition in deep 2sea sedim ents of the South China Sea [ J ]. World Journal of M icrobiology & B iotechnology, 2006, 22 ( 12 ) : 1337 2

ment of a 40 2base2 pair G + C 2rich sequence ( GC 2clamp) to ge2 nom ic DNA fragments by the polymerase chain reaction results in imp roved detection of single2base changes[ J ]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of A 2 merica, 1989, 86 ( 1) : 232 2 236. [ 15 ] 宫曼丽 ,任南琪 , 邢德峰 . DGGE / TGGE 技术及其在微生物 分子生态学中的应用 [ J ]. 微生物学报 , 2004, 44 ( 6 ) : 845 2 848. [ 16 ] MUYZER G, ELLEN C D W , ANDRE G U. Profiling of com 2 p lex m icrobial population by denaturing gradient gel electropho2 resis analysis of polymerase chain reaction 2amp lified genes enco2 ding for 16S rRNA [ J ]. App lied and EnvironmentalM icrobiolo2 gy, 1993, 59 ( 3) : 695 2 700. [ 17 ] E I ER A , BERTI SSON S Detection and quantification of L L . V ibrio populations using denaturant gradient gel electrophoresis [ J ]. Journal of M icrobiological Methods, 2006, 67 ( 2 ) : 339 2 348. [ 18 ] D IEZ B , PEDROS2 I C, MARSH T L , et al App lication of AL O . denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) to study the di2 versity of marine p icoeukaryotic assemblages and comparison of [ 19 ] VETR I N I C, JANNASCH H W , MACGREGOR B J, et al A . population structure and phylogenetic characterization of marine benthic archaea in Deep 2Sea[ J ]. Sedim ents App lied and Envi2 ronmental M icrobiology, 1999, 65 ( 10) : 4375 2 4384. [ 20 ] SHORTS M , SUTTLE C A. Sequence analysis of marine virus communities reveals that group s of related algal viruses are widely distributed in nature [ J ]. App lied and Environmental M icrobiology, 2002, 68 ( 3) : 1290 2 1296. [ 21 ] JAMES J B , SHERMAN T D , DEVEREUX R. Analysis of bacterial communities in seagrass bed sedim ents by double2gra2 [ 23 ] SEKIGUCH I H, TOM I KA N , NAJAGARA T A single band O . does not alw ays rep resent single bacterial strains in denaturing gradient gel electrophoresis analysis[ J ]. B iotechnology Letters, 2001, 23 ( 15) : 1205 2 1208. [ 24 ] FERR IS M J, WARD D M. Seasonal distributions of dom inant 16S rDNA 2defined populations in a hot sp ring m icrobial mat ex2 am ined by denaturing gradient gel electrophoresis[ J ]. App lied and Environmental M icrobiology, 1997, 63 ( 4) : 1375 2 1381. [ 25 ] 马悦欣 , HOLMSTROM C, W EBB J, 等 . 变性梯度凝胶电泳 (DGGE) 在微生物生态学中的应用 [ J ]. 生态学报 , 2003, 23 ( 8) : 1561 2 1569. [ 26 ] PARK H S, KI BANE J J. Rap id detection and high2resolution L discrim ination of the genus Strep tomyces based on 16S2 23S r 2 D NA spacer region and denaturing gradient gel electrophoresis [ J ]. Journal of Industrial M icrobiology & B iotechnology, 2006, 33 ( 4) : 289 2 297. [ 27 ] YANG C H, CROWLEY D E, ANTHONY G, et a l Strain level . identification of p seudomonads using denaturing gradient gel e2 lectrophoresis of 16S2 23S spacer region rDNA [ J ]. Journal of General Plant Pathology, 2000, 66 ( 3) : 225 2 233. dient denaturing gradient gel electrophoresis of PCR 2 Amp lified 16S rRNA Genes[ J ]. M icrobial Ecology, 2006, 52 ( 4) : 655 2 661. [ 22 ] PETR I R , I HOFF J F. Genetic analysis of sea2ice bacterial M communities of the western Baltic sea using an imp roved double gradient method[ J ]. Polar B iology, 2001, 24 ( 4) : 252 2 257. DGGE with other molecular techniques[ J ]. App lied and Envi2 ronmental M icrobiology, 2001, 67 ( 7) : 2942 2 2951.