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DGGE技术在环境微生物多样性研究中的应用

生物技术通报
? 技术与方法?

B IO TECHNOLO G Y BULL E T IN

2009 年第 12 期

D GGE技术在环境微生物多样性研究中的应用
张珍妮
1, 2

  吴晓芙   陈永华

1

1, 2

  石卉

1

( 1中南林业科技大学环境科学与工程研究所 ,长沙 410004; 2中南林业科技大学生物环境科学与技术研究所 ,长沙 410004)

     :   摘 要 微生物是污水净化的主要作用者之一 。采用变性梯度凝胶电泳 ( denaturing gradient gel electrophresis, DGGE)方 法培育和鉴定土壤微生物具有可靠性强 、 重复性好 、 方便快捷等优点 , 已被广泛应用于环境科学和污染防治研究领域 。综述 了基于 PCR 2 DGGE技术的基本原理 、 关键环节及其在微生物多样性研究中的应用 ,同时就其自身存在的不足进行了评价并提 出了解决方案 。

环境中微生物的种类和数量是及其丰富的 ,微生 物能把有机质作为营养源转化为组成物质和能量 ,它 [ 1, 2 ] 们在污染物的吸附和降解起着核心作用 。所以在 分析环境样品时 ,了解微生物的群落结构 ,对鉴定和 分离处理系统中的优势菌很重要 。自 1985 年 Pace 等 利用核酸测序方法来研究微生物的进化问题以 来 ,分子生物学技术逐渐被引入到微生物多样性研究 [4] 中。 1993 年 Muyzer等 最初将变性梯度凝胶电泳 DGGE 技术引入微生物生态研究 , DGGE 技术是一种 DNA 指纹技术 ,是多态性分析技术的一种 ,可分辨出 相同长度但序列不同的 DNA 片段。这种方法可以有 效地避免在传统富集 、 、 培养 分离、 研究过程中造成的
[3]

收稿日期 : 2009 207 2 20 基金项目 : 国家水体污染控制与治理科技重大专项 ( 2008ZX07212 2001 ) , 国家科技部国际合作项目 ( 2007 2 DFA91420 ) , 湖南省博士后基金 (2008RS4027) ,中南林业科技大学校青年基金重点项目 (2008001A) ,中南林业科技大学生物环境科学与技术研究所开放基金 ,湖南省 环境科学学科建设项目 (2006180) 作者简介 : 张珍妮 ( 1985 2) ,女 ,在读硕士 ,研究方向 : 环境生物学 ; E 2 mail: zhangzhenni_2003@1631 com 通讯作者 : 吴晓芙 ( 1953 2) ,男 ,教授 ,研究方向 : 水土污染控制 ; E 2 mail: wuxiaofu530911@ vip 11631 com

per1 In comparison, the potential app lication areas of the DGGE technique and its li itations were also discussed1 m
Ke y wo rd s:  PCR 2 DGGE M icroorganis  D iversity m

  Ab s tra c t:   icroorganism p lays an important role in wastewater treatm ent1Accounted for by its high levels of reliability and rep ro2 M

ducibility as well as its convenience in operation, the denaturing gradient gel electrophoresis(DGGE) has been w idely used for cultiva2 tion and identification of m icrobial communities in the fields of environmental sciences w ith focus on pollution control1 The p rincip le of the DGGE technique and the concerned key factors in its app lication for analysis of m icrobial communities were described in this pa2

关键词 :  PCR 2 DGGE  微生物   多样性
1

Applica tion in Research on M icrob i l D iversity a of Env ironment by D GGE Techn ique
Zhang Zhenni  W u Xiaofu  Chen Yonghua  Shi Hui
1, 2 1 1, 2 1

( Institu te of Environm en t Science and Eng ineering, Cen tra l Sou th U n iversity of Forestry and Technology, Changsha 410004; Institute of B iology Environm en t S cience and Technology, Centra l S outh U n iversity of Forestry and Technology, Changsha 410004 )

2

微生物多样性丢失 ,种群构成发生变化等弊病 ,能够 更直 接、 靠 地 反 映 出 微 生 物 的 原 始 组 成 情 况 。 可 [4] Muyzer 研究表明占整个群落细菌数量约 1%或以上 的类群就能够通过 DGGE监测到 ,而传统方法只能分 离出占环境微生物总数 011% ~10%的微生物 。 因此 ,综述了 DGGE 的基本原理与关键环节 、 及其在微生物多样性研究中的应用 , 同时就其自身 存在的缺点进行了评价并提出了解决方案 。

1  D GGE 技术的原理

DGGE 技术是使用具有化学变性剂梯度的聚丙

烯酰胺凝胶对 DNA 进行电泳 ,该凝胶电泳时能够有 区别地解链 PCR 扩增产物 。在进行变性梯度凝胶

2009 年第 12 期

张珍妮等 : DGGE技术在环境微生物多样性研究中的应用

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电泳时 ,长度相同而在碱基序列上存在差异的 DNA 双链的解链需要不同的变性剂浓度 。序列不同的 DNA 片段就会在各自想用的变性剂浓度下变性 ,发 生空间构型的变化 。起初双链 DNA 以现状向正极 移动 ,随着变性剂浓度的增加 , DNA 中具有低 G + C 含量的序列的部分被打开 , 而高 G + C 含量的部分 仍保持双链 。DNA 双链一旦解链 , DNA 分子形成端 部的叉状或中间的环节 (即 DNA 部分熔化 ) 。其在 聚丙烯酰胺凝胶中的电泳速度将会急剧下降 , 以至 停留在其相应的不同变性剂梯度位置 , 染色后可以 在凝胶上呈现为分开的条带 。如此使能将具有相同 长度而序列有差异的 DNA 分子分离开 (图 1 ) 。

2  D GGE 技术的关键环节和优化
样品群落总 DNA 的 提取 是 D GGE 研究 微生 物群落的基础 。人工湿地样品中细菌种类复杂且 混杂有大量有毒物质 、 腐殖质 , 如何使所有细胞 裂解 、 充分释放 DNA、 有效去除杂质 , 建立高效 、 可 靠的 DNA 提取方法成为研究者关注的热点 。从土 [6] 壤中提取 DNA 的方法可以分为两类 , 一类是直 接提取 法 , 在 土 壤 中 直 接 裂 解 微 生 物 体 , 再 提 取 。另一类是间 接提 取法 , 先 将微 生物 菌体 [8] 与土壤颗 粒分开 , 再 提 取 DNA , 其 优 缺 点 见 表 1。采用直接提取法的较多 , 包括 3 种方法 , 且样 品总 DNA 提取质量的高低多以获得量大 、 能用于 后续分子操作和尽可能地包含样品中所有微生物
DNA
[7] [5]

类群的遗传信息为指标 。DNA 提取过程中一般用 乙醇 、 异丙醇和聚乙二醇 ( PEG) 等有机溶剂沉淀 DNA 分子 , 这些有机溶剂对样品的 DNA 均有一定 [ 12 ] 的优先选择性 。 Porteous等 认为异丙醇沉淀核 [ 13 ] 酸量较高 ,且腐殖酸污染较少 。M iller 认为 SD S
图 1  D GGE研究微生物多样性的一般步骤

结合 氯 仿 或 苯 酚 进 行 玻 璃 研 磨 可 以 优 化 DNA 提取量 。

表 1  土壤微生物 D NA 提取方法的比较
类型 原理 将样品直接悬浮 在 直接 提取法 裂解缓冲液中处理 , 使其 释 放 DNA , 继 而抽提纯化 方法
SDS2 盐 高

SDS高盐提取 DNA 得率较高 ; SDS酚氯仿抽提 DNA 得率较低 , 且会造成 DNA 的

提取法 [ 11 ]
SDS2 氯仿抽提法 酚 Nycodenz法 [ 15 ] B lending法 [ 16 ] CTAB 2SDS法

剪切 [ 9 ] 研究 [ 10 ]

SDS法 提 取 的 DNA 中 含 有 较 多 腐 殖 酸 等 杂 质 , 要 经 过 纯 化 才 能 用 于 后 续

DNA 纯度较高 ,片段完整 ,可以直接用于后续一般的操作 [ 10 ]

间接 提取法

先将微生物菌体 与 土壤颗粒分开 , 再提 取 DNA

间接提取法的 DNA 得率明显低于直接提取法 , Nycodenz介质密度梯度离心可得 到相对干净的菌泥 ,且细胞分离效率较高 , 可达 20% ~50% [ 14 ] , 但其价格昂贵 , 操作复杂 ; 而 B lending法操作简单快速 , 成本低 , 但分离出的菌泥中含有非细胞 物质和土壤污染物

骤之一 。通常采用 16S rDNA 中的保守区作为引物 进行 PCR 反应 。这是由于 16S rDNA 具有以下几个 特点 : ( 1 ) 16S rDNA 约为 1 540 个核苷酸长 ,序列长 [ 17 ] 短适中 ,适合用作分类学上的研究 ; ( 2 ) 原核生 物体都具有 16S rDNA; ( 3 ) 16S rDNA 非常保守 , 不

212  PCR 的扩增及其偏差和优化

PCR 扩增是 PCR 2 DGGE 技术中至关重要的步

会在不同的个体间进行基因交换 , 各物种具自己的 [ 18, 19 ] 独特序列 ; ( 4 )目前已有相当完备的 16S rDNA 基因资 料库 , 经 过 GenBank 和 R ibosomal Database Project ( RDP )基因资料库作对比分析 , 并可进行亲 源关系分析 、 鉴定等 。目前被广泛被广泛使用的细 菌 16S rDNA 通用引物是 338f /518 r ( V3 区 ) 、 341f / 926 r ( V3 ~V5区 ) 和 968f /1401 r ( V6 ~V8 区 ) 。 Yu

211   提取 DNA 的方法的比较
优缺点

50
[ 20 ]

生物技术通报 B io techno logy B u lle tin

2009 年第 12 期

等 认为扩增 V3 区及 V3 ~V5 区的引物为最佳引 物选择 , V3 区的 PCR 2 DGGE条带数最多、 分离效果最 好。如果需要较长的扩增产物 ,则选择 V3~V5 区。 PCR 技术主要由高温变性 、 低温退火和适温延 伸 3 个步骤反复的循环构成 , 是在一种特异耐热酶
Taq DNA 聚合酶的催化下完成的由 DNA 聚合酶催
[ 21, 22 ]

要低于样品解链区域的 Tm 值 。土壤样品相对而言 比较复杂多样 ,其解链温度通常选择在 60 ℃ 左右进 [ 25 ] 行优化 。电泳时间取决于样品的片段大小 、 凝胶 浓度 、 变性剂梯度和电泳时的电压等因素 ,一个条件 的改变都可能引起电泳时间的不同 , 可以用时间进 程法优化出最佳电泳时间 。 [ 26 ] M uyer和 Smalla 建议利用时间进程试验确定 最佳的电泳时间 。具体方法是将待测样品以恒定的 时间间隔在同一块凝胶上电泳 , 以获得样品最大分 [ 23 ] 辨率的时间为最佳电泳时间 。在 Sigler 的研究中 发现 ,较长时间的电泳会改变 DGGE 胶中变性剂梯 度 ,导致电泳图谱的变化 , 3 个不同的样品 , 同样在 电压 1 000 V 的体系下进行电泳分离 , 随着电泳时 间的减少 ,分离的效果变好 。 为了更好的显示 DGGE 条带 , 可以选择不同的 染色方式 ( EB、 SYBR Green I和银染 ) 。其中 , SYBR Green Ⅰ 染色的优点是背景色低 , 可以观察到尽可 能多的条带 ; 银染的灵敏度最高 ,但银染过后的条带 [ 27 ] 不能用于杂交分析 。

化反应 。总结不同的 PCR 扩增反应体系 ,然后 根据土壤微生物总 DNA 的特性 , 依据常规的 PCR 反应体系 , 试验不同的反应程序 , 得出效果较好的 PCR 条带 。其反应程序如下 : 94 ℃ 1 m in; 50 ℃ 1m in 和 72 ℃ 1 m in,共 33 个循环 ,然后 72 ℃5 m in为最后 的延伸阶段 。对基本组成以外的其它变化再进行描 述 : 在 90 ~96 ℃ 内每间隔 2 ℃ 设系列变形温度 ,结果 表明 , 90 ℃ 无区带 , 最适变性温度为 94 ℃。在 40 ~ 60 ℃ ,每隔 5 ℃ 内 设系列退火温度 。结果表明 , 最适 温度为 45 ℃ 50 ℃。当其它扩增条件确定后 ,设扩 和 增的循环次数分别为 25、 、 和 40 个 。结果表 30 35 明 ,以 35 个循环的产物较为理想 。从研究的结果可 看出 ,任何试验条件偏离最佳试验条件将导致扩增 无产物 或 非 特 异 性 产 物 , 将 影 响 PCR 试 验 的 可 靠性 。 213   最佳电泳条件的选择 电泳条件的选择在整个分析过程中具有至关重 要的作用 ,电泳条件的优劣直接关系到条带分离的 好坏 ,影响后续分析工作 。DGGE 电泳条件不同 ,即
[ 23 ]

3  D GGE 在环境治理中的应用
刘新春等 应用 PCR 2 DGGE 方法 , 对在相同 的操作条件下分别用低温菌和常温菌接种的两套活 性污泥系统中的微生物群落结构的动态变化进行了 追踪 。由于工艺相同 , 使得接种的低温菌和常温菌 群在相同的操作条件下 , 产生了相似的微生物群落 结构 。随着运行时间的增加 , 其菌群结构相似程度 也越来越高 ,说明环境的变化是决定微生物群落结 [ 29 ] 构的关键因子 。赵兴青等 采用 PCR 2 DGGE 分子 指纹图谱技术比较南京玄武湖 、 莫愁湖和太湖不同 位置的表层沉积物微生物群落结构 ,研究结果表明 , 三湖泊沉积物微生物的 16S rDNA 的 PCR 扩增结果 约为 626 bp , 为 16S rDNA V3 ~V5 区特异性片段 。 三湖泊除具有特征性的微生物种属外 , 还分布约 5 [ 30 ] 个相同的细菌种群 。赵继红等 用 PCR 2 DGGE 技 术分析啤酒废水处理系统的微生物区系 , 对 SBR 池
[ 28 ]

使是相同的样品所得的图谱也会有差异 。DGGE 电泳条件选择包括变性剂梯度 、 电泳温度和时间 、 显 影的效果的确定 。理论认为 , 只要选择的电泳条件 足够精细 , 有 1 个碱基差异的 DNA 片段都可被分 开 。DGGE 电泳条件一般通过经验数据或反复试验 来确定 。 通常根据基因片段的大小来确定聚丙烯酰胺凝 胶浓度 ,当片段大小在 200 bp 左右时 ,一般采用 8% 的凝胶 。变性剂的梯度范围要根据垂直 DGGE 试 验来确定 ,垂直试验曲线斜率较大的部分代表解链 区域的 Tm (解链温度 ) 值 , 此时低温解链区的不同 分子达到最佳分离状态 。通常选择水平胶的的 变性剂梯度范围为 30% (相当于 Tm 范围 10 ℃左 右 ) ,对于不同的样品还需要进行调整 。对大多数 DNA 片段 50 ~65 ℃ 是比较适合的 ,通常电泳的温度
[ 24 ]

活性污泥细菌多样性进行比较 ,得出 SBR 池不同深 度和不同曝气量的微生物种群结构完全一致 , 不同 处理时段和不同时间的微生物种群结构一致 , 但优 势菌群不同 。说明水解酸化池的活性污泥微生物多

311  DGGE 技术在废水生物处理研究中的应用

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张珍妮等 : DGGE技术在环境微生物多样性研究中的应用

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样性受深度的影响变化较大 , 在结构组成和种群数 [ 31 ] 量上均有较大的差异 。吴卿等 应用 PCR 2 DGGE 研究饮用水中微生物的多样性 , 得出不同取样点饮 用水样品中虽然存在特异菌 , 但各取样点水样中的 优势菌相同 。从这些研究中可以看出菌群结构主要 是由环境条件决定 , 一般在相同的废水中采用不同 的处 理 , 微 生 物 种 群 结 构 一 般 一 致 , 但 优 势 菌 群 不同 。 312  DGGE 技术在土壤微生物研究中的应用 罗海峰等 采用 PCR 2 DGGE 技术分析农田土 壤微生物多样性 ,得出了 DGGE 能够对土壤样品中 的不同微生物的 16S rRNA 基因的 V3 区的 DNA 扩 增片段进行分离 ,为这些 DNA 片段的定性和鉴定提 [ 33 ] 供了条件 。林曦等 进行了南极中山站排污口土 壤中微生物群落的 DGGE 分析 , 针对 16S rDNA 基
[ 32 ]

因中 V3 保守区域进行比较分析 , 结果发现中山站 排污口样品中的微生物组成表现出与周围环境不同 [ 34 ] 的特征 。滕应等 用 PCR 2 DGGE 技术分析了重金 属污染农田土壤细菌群落的多样性 , 反映了重金属 复合污染影响到农田土壤生态系统的细菌丰富度 , 改变土壤环境的优势菌群 , 使农田土壤微生物群落 [ 35 ] 结构多样性发生变化 。M uller 等 用 PCR 2 DGGE 方法研究了 Hg 污染对土壤微生物群落 , 特别是细 菌群落结构的影响 。结果反映了 Hg污染改变了细 菌群落结构以及降低了其多样性 , 同时耐 Hg 速生 细菌明显变多 ,证明了多样性的减少会降低生态系 统稳定性 ,甚至导致生态系统机能的衰退 。 313  DGGE 技术在膜生物处理研究中的应用 孙宝盛等 应用 PCR 2 DGGE 技术解析膜生物 反应器中微生物群落多样性 , 指出不同的膜生物反 应器在长期稳定运行后形成了各自特定的生态群落
[ 36 ]

结构 ,既有共同的优势种群也有各自特有的种群 ,相 同的微生物种群在不同反应器中的优势地位不同 , 各自特有的微生物群落则是由于水质的不同经过长 [ 37 ] 期演替而来 。苏俊峰等 利用 PCR 2 DGGE 技术初 步分析了生物陶粒反应器细菌的种群演替情况 , 结 果表明群落结构和优势种群的数量具有时序动态 性 ,微生物多样性与废水的处理效果出现协同变化 [ 38 ] 的特征 。蒋建文等 采用 PCR 2 DGGE 技术比较了 生物膜和水体微生物多样性的差异 。结果表明随着

微生物膜的逐渐成熟和微生物群落的稳定 , 生物膜 上微生物多样性呈高于水体微生物多样性的态势 。 [ 39 ] 肖勇等 利用 PCR 2 DGGE 研究处理垃圾渗滤液序 批式生物膜反应器 ( SBBR ) 中的细菌多样性 。结果 表明该驯化后的 SBBR 生物膜和渗滤液原水中都有 比较丰富的细菌多样性 , 渗滤液中存在着丰富的厌 氧细菌 ,为生物膜驯化提供了丰富的脱氮功能菌种 , 驯化的生物膜中同时存在好氧反硝化细菌 、 厌氧氨 氧化细菌 、 大量的硝化细菌和反硝化细菌 。

4  D GGE 技术的展望

DGGE 其自身也存在一些缺点 : ( 1 )只能分离较 小的片段 ( < 500 bp ) ,对于大片段的分离效率下降 。

因此 ,给引物设计和系统发育分析带来一定困难 。 ( 2 ) DGGE 图谱中单一的条带并不总是代表单一的 菌株 ,或是在不同的泳道中移动到同一位置的条带 [ 40 ] 可能由不同的细菌组成 。 Sehiguchi等 在试验中 发现 DGGE 图谱中的单一条带不能被测序 , 对带中 DNA 进行克隆和基因文库研究发现 , 此条带中包含 多条不同的 DNA 序列 。 ( 3 ) DGGE 通常显示群落中 优势种类的 rDNA 片段 , 只有占整个群落细菌数量 约 l%或以上的类群能够通过 DGGE 检测到 。 Val2 [ 41 ] laeys 发现 DGGE 并不能分离样品中所有的 DNA 片段 。 ( 4 ) 由于某些种类的 16S rDNA 不同拷贝之 间的多态性问题 ,可能导致自然群落中细菌数量的 [ 42 ] 过多估计 。 ( 5 ) DGGE 技术对微生物的分类鉴定 依赖于基因数据库 , 若数据库中基因序列信息不够 丰富 ,将会限制 DGGE 的使用 。 DGGE 技术作为一项新兴的研究手段和工具 , 还需要加强和改进以下几个方面 : ( 1 ) 需要摸索适 合具体样品的 DNA 提取方法和最佳 PCR 条件 ; ( 2 ) 优化 DGGE 条件和仔细分析具体结果 。 ( 3 ) 加强 [ 37 ] DGGE 技术与其它技术的联用 。有研究中发现 , 同一种样品采用不同的方法分析 , 传统方法能够检 测到的细菌 ,在分子方法中却不能被发现 ,这可能是 在 PCR 过程中该菌未被扩增的缘故 。 DGGE 方法 可以采用双梯度 DGGE / TGGE, 如联合使用一个丙 烯酰胺梯度或温度梯度以达到更好的分辨率 ; 利用 末端标记的荧光 PCR 产物 、 附加荧光内泳道标准化 检测稀少群落组成和精确的样品对样品比较 。使用 功能型基因作为分子标记也能区别关系相近但生态

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生物技术通报 B io techno logy B u lle tin
2003, 44 ( 2) : 153 ~163.

2009 年第 12 期

差异的种群 ; DGGE 与克隆文库等技术结合 ,可克服 局限性 ,充分发挥分离的优势 。目前的发展趋势是 PCR 2 DGGE / TGGE 与其他分子技术以及微生物学 、 地球化学方法联合使用 , 这样可以减少不同技术的 弊端与局限性 ,综合各种技术的优势 ,从而更真实地 揭示环境微生物群落结构和功能的本质 。 ( 4 ) 进一 步丰富基因数据库 ,建立更加完善的基因序列信息 , 为 DGGE 技术对微生物的分类鉴定提供更好的信 息平台 。
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