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RT-PCR 实验方法


Rt-PCR 实验步骤

一、实验器具与材料: 1、移液枪:1ml、200μ l、20μ l、10μ l、2μ l 2、吸头:1ml、200μ l、20μ l 3、匀浆管:5ml 4、吸头台:放置 1ml 吸头的一个,放置 20μ l 吸头的一个 5、EP 管:1.5ml、0.2ml、100μ l 6、试剂瓶:2 个 60ml 的棕色试剂瓶(广口,带盖) 1 个 125ml 的白色试剂瓶(放无水乙醇) 7、量筒:50ml、250ml、500ml 8、容量瓶:250ml、500ml、1000ml 9、试管架:5ml、1.5ml、20μ l 10、盐水瓶:250ml、500ml 各 2 个备用,一个装无水乙醇,另一个装 DEPC 水 11、铝制饭盒:4 个 12、塑料小饭盒:1 个 13、大瓷缸:2 个 14、锡泊纸:一卷 15、卷纸:2 卷 16、三角烧瓶:带盖,稍大 二、实验器具的处理与准备 1、塑料制品: (包括枪头、EP 管、匀浆管等) 先将 DEPC 水从容量瓶中倒入瓷缸中,将塑料制品逐个浸泡其中,其中小枪头需要吸管打 入 DEPC 水,过夜,然后高压,再烤干备用,实验前将枪头等放入吸头台,再高压一次(EP 管) 2、玻璃制品:泡酸过夜,冲洗干净,蒙锡纸烤干备用(DEPC 水泡) (洗净后先泡 1‰DEPC 过夜,再烤干) 3、匀浆器: (包括剪刀、镊子)先洗净后,再高压(不需要泡 DEPC) 三、试剂配制: 1、DEPC 水:吸出 1ml 放在 1000ml 双蒸水中配成 1‰DEPC 水,放在 1000ml 容量瓶中静 置 4 小时备用。 2、75%乙醇:用无水乙醇+DEPC 水配,然后放-20℃保存(其中 DEPC 水需先高压) 3、异丙醇:放入棕色瓶中 4、氯仿:放入棕色瓶中 5、琼脂糖 四、几种缓冲液的配制: 1、电泳缓冲液: Tris 54g 硼酸 27.5g 0.5M EDTA 20ml? pH8.0 蒸溜水 1000ml

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5×TBE (贮存液) 再将 5×TBE 稀释 10 倍成 0.5TBE 就可以在电泳时使用(即工作液浓度) ,如取 50ml 贮存 液+450ml 水——→500ml 工作缓冲液 2、上样缓冲液: 0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯青 FF 30%甘油 6×缓冲液,4℃保存 五、琼脂糖凝胶的配制: 1、1.0%: 1.0g 琼脂糖+100ml 电泳缓冲液,微波炉中火 30 秒至沸腾,熔化的琼脂物冷却至 60℃ 时加入 10mg/ml 溴化乙锭 2.5μ l,充分混匀,将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中,在室 温下放置 30-45min 后现进行电泳。 2、1.5%: 同上,将琼脂糖的量改为 1.5g 六、需购置的 Rt-PCR 材料: (生工. Tel. 2236106.) Taq 酶(含 MgCl2 Buffer) 200u 70.00 dNTP: 1 支 oligo(dT)15: 1 OD 40.00 promega M-MLV: 1 支 250.00 promega (Buffer) RNasin: 1 支 110 —— -20℃ DEPC 5g 110.00 Trizol 100ml/1 瓶 Invitrogen Life technologies —— 4℃ Marker: 10μ g 0.2μ g/ml 150.00 科威 (1543. 994. 697. 515. 377. 231) 七、引物合成 1、内参照: GAPDH 正义:5′—ACCACAGTCCATGCCATCAC—3′ 反义:5′—TCCACCACCCTGTTGCTGTA—3′ β -actin 正义:5′—CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC—3′ 反义:5′—TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT—3′ 2、par-4: 正义:5′—GGGACCTCGGAACTCAAC—3′ 反义:5′—TGTATCTGCCTGGGACTG—3′ 3、退火温度计算 2(A+T)+4(G+C) 正反义平均数,再上下波动度(±4℃,或±5℃)

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4、引物各合成 5 OD,每 OD 一瓶分装好 5、引物稀释: 加 DEPC 水量为(μ l) = ? nmol / OD × 管上所标 OD 数×100 是为 10p mol / μ l 浓度的引物溶液 八、PCR 产物电泳 先将 1-10μ l 左右 PCR 产物,加已点在纸上的溴酸兰,反复吸打混匀后进行电泳,一 般电流为 10mA,电源 100V,电泳 30 分钟,紫外灯下观察,满意的结果扫描打印。 九、几个注意点: 1、逆转录的关键步骤是立即冰水浴? 2、Rt 时,先打开 PCR 预热 30 分钟。 3、RNA 抽提前,打开离心机预冷。

TRIzol 法抽提总 RNA 组织 100mg 细胞 1×107 ↓ 加 1mlTRIzol ↓ 细胞用 1ml 加样 匀浆(要彻底,后转至 EP 管) 器吹至液体澄清 (组织匀浆量>100mg 时分装 1ml/每 EP 管) 且无细胞团块 ↓ 颠倒混匀 10 下,室温 5 分钟 ↓ 加氯仿 1/5 体积(0.2ml) (必须按总体积的 1/5) ↓ 颠倒混匀 10 下,室温 5 分钟 ↓ 4℃,离心 12000g(勿超过),15 分钟 ↓ 转上层水相(约 400μ l)于另一 1.5mlEP 管中 ↓ 加等体积异丙醇(约 400μ l) ,混匀室温 10 分钟(-20℃ 2-4h 或过夜) ↓ 4℃,离心 12000g,10 分钟 ↓ 弃上清 ↓ 加冰预冷的 75%(或 80%)乙醇(用 DEPC 水配)1ml ↓ 4℃离心 7500g,5 分钟/4℃,离心 12000g,10 分钟

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加无水乙醇 1ml ↓ 4℃,离心 12000g,10 分钟 ↓ 弃上清,空气干燥 5-10 分钟(不能完全干燥) ↓ 溶于 DEPC 水中至 20μ l(10μ l-20μ l) (可在 55-60℃水中,<10 分钟助溶)

注: 1、RNA 若用于核酸转移应溶解于样本缓冲液中,否则 DEPC 溶解 2、细胞组织加 TRIzol 匀浆后,可在-60℃放置至少一个月(甚至可一年以上) 3、RNA 沉淀在 75%乙醇中,2-8℃至少可保存一周,-20℃至少可保存一年

两步法 RT-PCR (第一步:逆转录反应) 试剂 RNA Oligo(dT)15 浓度 0.05μ g/μ l 体积 23μ l(11.5μ l) 4μ l(2μ l) 终浓度 0.005μ g/μ l (稀释 10 倍后用)

↓ 混匀,离心,70℃/65℃ 5min(RT 大于 1 kb 时,建议采用 65℃) ↓ 立即冰水浴至少 1 分钟,稍离心 (此步可省略,将 Buffer 等预热到 RT 温度即可) ↓ 试剂 浓度 体积 终浓度 M-MLV Buffer 5× 8μ l (4μ l) 1× dNTP 10mM 2μ l (1μ l) 0.5mM RNasin 40U/μ l 1μ l (0.5μ l) 20μ M-MLV/AMV 200U/μ l 2μ l (1μ l) 200U 总体积 40μ l(20μ l) ↓ 混匀,离心,M-MLV/AMV 37/42-55℃ 60min ↓ 95℃ 10min(破坏 M-MLV/AMV,70℃ 15min/85℃ 5 min) ↓ 4℃保存

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两步法 RT-PCR (第二步:PCR 反应) 总体积 20μ l(50μ l) 试剂 Taq Buffer MgCl2 dNTP 上游引物 下游引物 cDNA 模板 DEPC 水 Taq 酶 2.5U/μ l 浓度 10× 25mM 10mM 10pmol/μ l 10pmol/μ l 体积 2μ l 1.2μ l 0.2μ l 0.3μ l 0.3μ l X (?) (5μ l_) (3μ l) (0.5-1μ l) (1μ l) (1μ l) (1-10μ l) 终浓度 1× 1.5mM <200μ M 10pmol 10pmol

20μ l—4.3μ l—X 0.3μ l ↓ 混匀 ↓ 97℃,5 分钟 ↓ 立即冰水浴 ↓ 混匀 ↓ (1μ l) 2.5U/μ l

95℃ 94℃ X℃ 72℃ 72℃ 28-36 循环,4℃保温

5分 30 秒 40 秒 30 秒 7分

预变性 变性 退火 延伸 终末延伸

三、电泳: 加 1-10μ l PCR 产物+溴芬兰(1-2.5μ l)混匀,加样,电泳。 注意:Taq 酶、M-MLV、Rnasin 等-20℃保存,操作时置于冰上。dNTP 勿反复冻融。
几点补充建议: 1) DEPC水的浓度可以为千分之0.8—1.0

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2) 3) 4) 5) 6) 7) 8) 9)
10)

玻璃器皿在酸缸里浸泡3小时以上即可 条件许可的话,请在2度—8度的条件下离心 初学者们务必戴手套和口罩,原则上每一步骤结束均需换手套,故建议用薄膜手套,比较便宜。 所有操作均在冰上为宜 加入TRIZOL后的摇匀要充分 加入异丙醇后的离心,停下来的速度要慢,以保持两界面不被破坏 用DEPC水溶解沉淀时要反复吹打 加入异丙醇或乙醇后室温或冰上孵育 10min 能够有效沉淀 RNA,在有足够浓度盐的情况下,加入乙醇的体积为 2-2.5 倍, 加入异丙醇的体积为 0.6-1 倍。
从一开始就小心 RNase 的污染(防止它污染后面步骤的操作,小心为妙) 。当然最关键是从加异丙醇这一步开始,之后的每一步都 得严防 RNase,处处小心被它污染,因为从这一步开始没有任何防止试剂可防护 RNase(除非加抑制剂,但它会影响下面的实验, 通常不加) ,只能靠自己小心避开 RNase。

用 Trizol 法抽提 RNA 时如何避免基因组污染?哪些步骤是需要特别注意的 起始的细胞组织不能太多,这是关键。用 DnaseI 处理一下不可以么?还有取上清别贪多.
用 Invitrogen 公司的 SUPERSCRIPT III 或 ThermoScript, 据说可以达到 55 度, 甚至 60 度, 但我们订的 III 没到货没用,我们以前用的是 II ,一般用 50 度。 较高的保温温度有助于 RAN 二级结构的打开,增加反应的产量,对于多数 RNA 膜板,在没有缓冲液或盐的 条件下,将 RNA 和引物在 65 度保温,然后迅速置冰上冷却,可以消除大多数二级结构,然而某些模板仍然存 在二级结构,即使热变性后也不能打开二级结构,对于这些摸板可以使用 SUPERSCRIPT III 或 ThermoScript, 并将逆转录温度提高。如果是 GSP,确保引物的 Tm 值与预计的保温温度相同,不要在逆转录温度高于 60 度时 使用 oligo(dT)或随机引物,随机引物在增加到 60 度前在 25 度保温 10 分钟。除了使用较高温度外,还可以 通过直接将 RNA/引物混合液从 65 度转到保温温度,加预热的其他反应液。 反转录酶 温度 AMV 37-45 度 M-MLV 37 SUPERSCRIPT II 37-50 THERMOSCRIPT /III 42-65 RNA 在高于 65 度时开始水解,对于小于等于 1Kb 的 RNA 第一链合成温度可以为 70 度,对于大于 1K 的 RNA 则需要小于 65 度。 逆转录添加剂,如甘油、DMSO,可以减低核苷酸双链的稳定性并解开 RNA 二级结构,最多可以加 20%的甘油 或 10%的 DMSO 而不影响 SUPERSCRIPT II 或 M-MLV 的活性。 一、RT-PCR 1. cDNA 产量的很低 可能的原因:*RNA 模板质量低*对 mRNA 浓度估计过高*反应体系中存在反转录酶抑制剂或反转录酶量不足* 同位素磷 32 过期 *反应体积过大,不应超过 50μl 2. 扩增产物在电泳分析时没有条带或条带很浅 *最常见的原因在于您的反应体系是 PCR 的反应体系而不是 RT-PCR 的反应体系*与反应起始时 RNA 的总量及纯 度有关*建议在试验中加入对照 RNA*第一链的反应产物在进行 PCR 扩增时, 在总的反应体系中的含量不要超过 1/10*建议用 Oligo(dT)或随机引物代替基因特异性引物(GSP)用于第一链合成。由于 RNA 模板存在二级结构, 如环状结果,有可能导致 GSP 无法与模板退火;或 SSⅡ反转录酶无法从此引物进行有效延伸。*目的 mRNA 中 含有强的转录中止位点,可以试用以下方法解决:a. 将第一链的反应温度提高至 50℃。b. 使用随机六聚体代 替 Oligo(dT)进行第一链反应。 3. 产生非特异性条带 *用 RT 阴性对照检测是否被基因组 DNA 污染。 如果 RT 阴性对照的 PCR 结果也显示同样条带, 则需要用 DNase I 重新处理样品。*在 PCR 反应中,非特异的起始扩增将导致产生非特异性结果。在低于引物 Tm 2 至 5℃的温 度下进行退火,降低镁离子或是目的 DNA 的量将减少非特异性结果的产生。*由于 mRNA 剪切方式的不同,根

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据选择引物的不同将导致产生不同的 RT-PCR 结果。 4. 产生弥散(smear)条带 *在 PCR 反应体系中第一链产物的含量过高*减少引物的用量*优化 PCR 反应条件/减少 PCR 的循环次数*在用 DNase 处理被 DNA 污染的 RNA 样品时,其产生的寡核苷酸片段会产生非特异性扩增,一般会显示为弥散背景。 5. 产生大分子量的弥散条带 *大多数情况下是由于退火温度过低而导致的非特异性的起始及延伸产生的*对于长片段的 PCR,建议将反应体 系中 cDNA 的浓度稀释至 1:10(或 1:100-1:200) 6. 在无反转录酶的情况下,对照 RNA 获得扩增结果 *通常是由于对照 RNA 中含有痕量 DNA 而导致的。由于进行体外转录时不可能将所有的 DNA 模板消除。建议 可将第一链 cDNA 稀释 1:10、1:100、1:1000 倍以消除 DNA 污染所造成的影响。*有可能是引物二聚体的条带 7. 扩增产物滞留在加样孔中 *有可能是由于模板量过高而导致 PCR 结果产生了高分子量的 DNA 胶状物。 建议将第一链结果至少稀释 100 倍 再进行二次扩增。*另外,在二次 PCR 时使用的退火温度如果比引物的 Tm 值低 5℃,可以将退火温度适当增高 或进行热启动以提高特异性。 8. SSⅢ与 SSⅡ有何不同? *具有更高的热稳定性(达 50℃)*具有更长的半衰期(达 220 分钟)*对 PCR 无抑制*干冰运输*Tdt 活性更低 SuperScriptⅢ反转录酶 9. 为什么有人更喜欢用 SSⅢ而不是 ThermoScript? ThermoScript 如果保存不当会引起活性很快降低,SSⅢ则更稳定。 10. 为什么使用基因特异性引物(GSP)? GSP 在扩增低丰度的转录本时是最好的。Oligo dT 引物建议用于高质量 RNA 及全长转录本的逆转录;随机引物 用于 mRNA 片段的逆转录。 11. 什么情况下需要使用 RNase H? 在第一轮 PCR 中 RNA/DNA 杂合体不能正常变性时 12. 根据不同的目的选择不同的系统:目的 建议 RT 与 PCR 使用不同的引物或需要灵活选择 PCR DNA 聚合酶 两步法 RT-PCR 系统 高灵敏度 一步法或两步法 RT-PCR 系统 高特异性 含有适当的 DNA 聚合酶的两步法 RT-PCR 系统或具有高保真 Platinum Taq 酶的一步法 RT-PCR 系统 高保真度 含有 Pfx Taq 酶的两步法 RT-PCR 系统 长的反转录结果 通常使用两步法 RT-PCR 系统可达到最佳结果含 Elongase 酶的一步法 RT-PCR 系统 二、Generacer 1. 如何针对 Generacer 试剂盒设计基因特异性引物(GSP)? 使用 5’或 3’RACE 试剂都需要至少一条基因特异性引物,您在设计引物时需要注意以下几点要求:*50-70%的 GC 含量,以提高引物熔点(Tm)*23-28 个碱基长度,以提高引物特异性*降低 3’端 GC 含量,将引物非特异性 结合的可能性降至最低 2. 为什么得不到 RACE 产物? *加入 Hela 对照*低质量的 RNA 模板*逆转录失败,SSII 和 SSIII 非常适用于长模板 cDNA 的合成*目的基因丰 度太低, 可以通过提高 PCR 的循环次数来解决, 建议使用巢式 PCR*目的基因没有表达, 可以通过使用两条 GSPs 来分析 cDNA 中是否含有目的基因*目的基因太长而不适合进行反转录,建议使用 GeneRacer 试剂盒中的 Oligo dT 来得到全长 cDNA,使用随机引物或与模板的 5’端尽可能近的 GSP 进行 PCR。*cDNA 模板属于困难模板,可 以通过以下方法解决:优化 PCR 反应参数及反应体系;降低退火温度;使用 5-10%的 DMSO 帮助通过高 GC 含 量区;使用高保真度和高延伸能力的酶进行 PCR 反应。 3. RACE 的 PCR 结果有杂带 RACE PCR 杂带或非特异性 PCR 条带可能是由于以下原因: *GSP 与其他 cDNA 的非特异性结合会导致在扩增目 的产物时得到无关产物。*GeneRacer 引物和 cDNA 的非特异性结合会导致产生一端带有 GeneRacer 引物序列 的 PCR 产物。*RNA 降解。*PCR 管或试剂污染。注意:杂带一般是因为没有优化 PCR 条件,可以加入阴性对

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照来确定。 4. 得不到全长的 5’RACE PCR 产物 *CIP 反应后的 RNA 降解产生了新的带有 5’磷酸的断裂模板,可以同 GeneRacer RNA Oligo 连接。一定要小心 操作,保证 RNA 无降解。*CIP 脱磷酸不完全,可以增加反应中 CIP 的量或减少 RNA 的量。*PCR 产生了杂带, 并不是真正的连接产物,可以使用上述建议优化 PCR。 三、PCR 在进行 PCR 时:*请确保您没有使用过量的起始 DNA 或者过高浓度的引物,也没有加入过量的 Mg++*请确保 您使用了恰当的退火温度*请确保您没有使用过量的 DNA 聚合酶 四、引物 1. 应该选择哪种纯化方法? 取决于实验目的和引物的长度 2. 为什么我订购了 50nmol,但是收到却只有 40nmol? 50nmol 是起始量 3. 怎样制备 100μM 的储液? 体积(μl)=质检报告上的 nmol 数目× 10 4. 怎样设计引物? *一般长度 20-30bp;*至少 50%的 GC 含量;*避免引物二聚体和二级结构;*引物对的 Tm 值应该接近。 5. 引物序列有插入或缺失? *使用上游和下游引物多测几个克隆。*请选择正确的纯化方法。 6. PCR 无结果? *请检查引物设计是否正确;*请检测 OD 读数是否正确;*做一个阳性对照和一个阴性对照。

SuperScript. III Reverse Transcriptase Cat. No. 18080-093 Size: 2,000 units 18080-044 10,000 units 18080-085 4 × 10,000 units Conc: 200 U/μl Store at -20° (non-frost-free) C Description SuperScript. III Reverse Transcriptase is an engineered version of M-MLV RT with reduced RNase H activity and increased thermal stability. The enzyme is purified to near homogeneity from E. coli containing the modified pol gene of Moloney Murine Leukemia Virus (1,2). The enzyme is used to synthesize first-strand cDNA at temperatures up to 55° providing C, increased specificity, higher yields of cDNA, and more full-length product than other reverse transcriptases. It can generate cDNA from 100 bp to >12 kb. Component Volume SuperScript. III RT (200 U/μl) 50 μl 5X First-Strand Buffer* 1000 μl 0.1 M DTT 500 μl *[250 mM Tris-HCl (pH 8.3 at room temperature), 375 mM KCl, 15 mM MgCl2] Unit Definition One unit incorporates 1 nmol of dTTP into acid-precipitable material in 10 min at 37° using poly(A).oligo(dT)25 as template-primer (3). C Storage Buffer 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.01% (v/v) NP-40, 50% (v/v) glycerol

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Storage Store all components at -20° (non-frost-free). Thaw 5X First-Strand Buffer C and 0.1 M DTT at room temperature just prior to use and refreeze immediately. Part. No. 18080.pps Rev. date: 06/22/03 This product is distributed for laboratory research only. CAUTION: Not for diagnostic use. The safety and efficacy of this product in diagnostic or other clinical uses has not been established. First-Strand cDNA Synthesis Using SuperScript. III for RT-PCR The following 20-μl reaction volume can be used for 10 pg.5 μg of total RNA or 10 pg.500 ng of mRNA. 1. Add the following components to a nuclease-free microcentrifuge tube: 1 μl of oligo(dT)20 (50 μM); or 200.500 ng of oligo(dT)12-18; or 50.250 ng of random primers; or 2 pmol of gene-specific primer 10 pg.5 μg total RNA or 10 pg.500 ng mRNA 1 μl 10 mM dNTP Mix (10 mM each dATP, dGTP, dCTP and dTTP at neutral pH) Sterile, distilled water to 13 μl 2. Heat mixture to 65° for 5 min. and incubate on ice for at least 1 min. C 3. Collect the contents of the tube by brief centrifugation and add: 4 μl 5X First-Strand Buffer 1 μl 0.1 M DTT 1 μl RNaseOUT. Recombinant RNase Inhibitor (Cat. no. 10777-019, 40 units/μl). Note: When using less than 50 ng of starting RNA, the addition of RNaseOUT. is essential. 1 μl of SuperScript. III RT (200 units/μl)* 4. Mix by pipetting gently up and down. If using random primers, incubate tube at 25° for 5 min. C 5. Incubate at 50° for 30.60 min. Increase the reaction temperature to 55° for C C gene-specific primer. Reaction temperature may also be increased to 55° for C difficult templates or templates with high secondary structure. 6. Inactivate the reaction by heating at 70° for 15 min. C The cDNA can now be used as a template for amplification in PCR. However, amplification of some PCR targets (those >1 kb) may require the removal of RNA complementary to the cDNA. To remove RNA complementary to the cDNA, add 1 μl (2 units) of E. coli RNase H and incubate at 37° for 20 min. C *If generating cDNA longer than 5 kb at temperatures above 50° using a genespecific C primer or oligo(dT)20, the amount of SuperScript. III RT may be raised to 400 U (2 μl) to increase yield. PCR Reaction Use only 2 μl (10%) of the first-strand reaction for PCR. 1. Add the following to a PCR reaction tube for a final reaction volume of 50 μl: 5 μl 10X PCR Buffer [200 mM Tris-HCl (pH 8.4), 500 mM KCl] 1.5 μl 50 mM MgCl2* 1 μl 10 mM dNTP Mix

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1 μl amplification primer 1 (10 μM) 1 μl amplification primer 2 (10 μM) 0.4 μl Taq DNA polymerase (5 U/μl) 2 μl cDNA (from first-strand reaction) 38.1 μl autoclaved, distilled water 2. Mix gently and layer 1.2 drops (~50 μl) of silicone oil over the reaction. (Note: The addition of silicone oil is unnecessary in thermal cyclers equipped with a heated lid.) 3. Heat reaction to 94° for 2 min to denature. C 4. Perform 15 to 40 cycles of PCR. Annealing and extension conditions are primer and template dependent and must be determined empirically. *Optimal concentration of MgCl2 needs to be determined empirically for each template-primer pair. Quality Control This product has passed the following quality control assays: SDS-polyacrylamide gel analysis for purity; functional absence of endodeoxyribonuclease, 3′ and 5′ exodeoxyribonuclease, and ribonuclease activities; yield and length of cDNA product. References 1. Kotewicz, M.L., D’Alessio, J.M., Driftmier, K.M., Blodgett, K.P., and Gerard, G.F. (1985) Gene 35, 249. 2. Gerard, G.F., D’Alessio, J.M., Kotewicz, M.L., and Noon, M.C. (1986) DNA 5, 271. 3. Houts, G.E., Miyagi, M., Ellis, C., Beard, A., and Beard, J.W. (1979) J. Virol.29, 517. Related Products Quantity Cat. No. Oligo(dT)20 Primer (50 μM) 50 μl 18418-020 Oligo(dT)12-18 Primer 25 μg 18418-012 Random Primers A260 units 48190-011 Custom Gene-Specific Primers visit www.invitrogen.com/oligos 10 mM dNTP Mix 100 μl 18427-013 DEPC-treated Water 4 × 1.25 ml 10813-012 RNAseOUT. Recombinant Ribonuclease Inhibitor (40 U/μl) 5,000 units 10777-019 RNase H 30 units 18021-014 Platinum? Taq DNA Polymerase 100 units 10966-018
Limited Use Label License No. 4: Products for PCR which do not include any rights to perform PCR

This product is optimized for use in the Polymerase Chain Reaction (PCR) covered by patents owned by Roche Molecular Systems, Inc. and F. Hoffmann-La Roche, Ltd. (.Roche.). No license under these patents to use the PCR process is conveyed expressly or by implication to the purchaser by the purchase of this product. A license to use the PCR process for certain research and development activities accompanies the purchase of certain reagents from licensed suppliers such as Invitrogen, when used in conjunction with an Authorized Thermal Cycler, or is available from Applied Biosystems. Further information on purchasing licenses to practice the PCR process may be obtained by contacting the Director of Licensing at Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404 or at Roche Molecular Systems, Inc., 1145 Atlantic Avenue,Alameda, California 94501.
Limited Use Label License No. 138: SuperScript. III Reverse Transcriptase

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The purchase of this product conveys to the buyer the non-transferable right to use the purchased amount of the product and components of the product in research conducted by the buyer (whether the buyer is an academic or for-profit entity). The buyer cannot sell or otherwise transfer (a) this product (b) its components or (c) materials made using this product or its components to a third party or otherwise use this product or its components or materials made using this product or its components for commercial purposes. The buyer may transfer information or materials made through the use of this product to a scientific collaborator, provided that such transfer is not for any commercial purpose, and that such collaborator agrees in writing (a) not to transfer such materials to any third party, and (b) to use such transferred materials and/or information solely for research and not for commercial purposes. Commercial purposes means any activity by a party for consideration and may include, but is not limited to: (1) use of the product or its components in manufacturing; (2) use of the product or its components to provide a service, information, or data; (3) use of the product or its components for therapeutic, diagnostic or prophylactic purposes; or (4) resale of the product or its components, whether or not such product or its components are resold for use in research. Invitrogen Corporation will not assert a claim against the buyer of infringement of the above patents based upon the manufacture, use or sale of a therapeutic, clinical diagnostic, vaccine or prophylactic product developed in research by the buyer in which this product or its components was employed, provided that neither this product nor any of its components was used in the manufacture of such product. If the purchaser is not willing to accept the limitations of this limited use statement, Invitrogen is willing to accept return of the product with a full refund. For information on purchasing a license to this product for purposes other than research, contact Licensing Department, Invitrogen Corporation, 1600 Faraday Avenue, Carlsbad, California 92008. Phone (760) 603-7200. Fax (760) 602-6500.

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RT-PCR实验方法_生物学_自然科学_专业资料。生物实验常用操作逆转录 PCR (RT-PCR) 实验四逆转录 PCR (RT-PCR)【实验目的】1.了解用逆转录 PCR 法获取目的基因...
RT-PCR实验方法大全
RT-PCR实验方法大全 - RT-PCR 实验有三步:抽提 RNA,RT,PCR。 要求: 1.做 RT 前必需测 RNA 浓度,逆转录体系对 RNA 量还是有一些要求,常用 500ng 或 ...
RT-PCR 实验方法
RT-PCR 实验方法_生物学_自然科学_专业资料。Rt-PCR 实验步骤 一、实验器具与材料: 1、移液枪:1ml、200μ l、20μ l、10μ l、2μ l 2、吸头:1ml、...
RT-PCR实验报告
篇二:rt-pcr 实验方法 逆转录 pcr (rt-pcr) 实验四逆转录 pcr (rt-pcr)【实验目的】1.了解用逆转录 pcr 法获取目的基因的原理。 2.学习和掌握逆转录 pcr...
RT-PCR实验步骤
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RT-PCR的实验原理与操作步骤
RT-PCR实验原理与操作步骤 - 提取组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板,采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR 扩增,...
半定量RT-PCR的实验原理和方法步骤
半定量RT-PCR的实验原理和方法步骤 - 半定量 RT-PCR 的实验原理和方法步骤 以下实验步骤仅供参考: 1 样品 RNA 的抽提 ①取冻存已裂解的细胞,室温放置 5 分钟...
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