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DGGE技术在土壤微生物群落研究中的应用

黑龙江农业科学 2010( 7) : 5~ 8 Heilong jiang Ag ricultural Sciences

生物技术

DGGE 技术在土壤微生物群落研究中的应用
宋 洋, 李柱刚 ( 黑龙江省农业科学院 生物技术研究所/ 黑龙江省作物与家畜分子育种重点实验室, 黑龙江 哈尔滨 150086)
摘要: 现代分子生物学的变 性梯度 凝胶电 泳( Denatur ing G radient Gel Electr qphoresis, DGG E) 技术是 土壤 微 生物 群落研究的有效工具, 它直接分离土壤微生物的 DN A 片段, 比传统的培 养方法更 具明显的优 势, 已 成为 研究土壤微生物的重要手段之一。对 DG GE 技术的原 理及其在 土壤微 生物群 落研究 中的应 用情况、 优点 和 局限性进行了介绍。 关键词: DG GE; 土壤微生物; 群落结构 中图分类号: Q 938 1+ 5 文献标识码: A 文章编号: 1002 2767( 2010) 07 0005 04

土壤中微生物群落结构对农业的健康、 持续 发展具有重要作用。它们积极参与土壤物质转化 过程, 在土壤形成、 肥力演变、 植物养分有效化和 土壤结构形成与改良、 有毒物质纯化及净化方面 起着重要作用 重视
[ 2] [ 1]

其在研究微生物多样性和种群差异上的优越性。 此后, 该技术被广泛应用于微生物分子生态学研 究的各个领域, 如复杂微生物群落结构演替规律、 微生物种群 动态、 基因定位、 表达调控的评价分 析。而且 DGGE 可靠性强、 重现性高、 方便快捷, 目前已发展成为研究微生物群落结构的重要分子 生物 学手段[ 4, 6] , 同时 也成为研究土壤微生物多 样性及种群演替的重要方法之一。

。由于土壤微生物的重要性, 有

关土壤微生物的群落结构及多样性研究受到广泛 。但研究结果表明, 土壤微生物中可用常

规方法分离培养的微生物只占 0 1% ~ 1 0% [ 3] 。 因此, 传统的微生物培养及鉴定方法不足以反映 土壤环境中微生物的真实情况, 需要现代分子生 物学 技 术 进 行 补 充, 如 变 性 梯 度 凝 胶 电 泳 ( DGGE) 、 温度梯度凝胶电泳( T GGE) 、 单链构象 多态性分析( SSCP) 等技术, 这些技术可以根据微 生物的 DNA 序列遗传多态性, 揭示出其群落结 构及其多态性。 变性梯度 凝胶电 泳 ( denat ured g radient gel electr ophoresis, DGGE) 是 20 世纪 80 年 代初由 Lerm an 等 发明用于医 学上检测 DNA 片段中 点突变的一种电泳技术。Muyzer 等
[ 5] [ 4]

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DGGE 技术
基本原理 DGGE 技术在普 通的聚丙 烯酰胺凝 胶基础

上, 加入了变性剂( 尿素和甲酰胺) 梯度, 根据其迁 移行为决定于其分子大小和电荷的原理, 能够把 同样长度但序列不同的 DNA 片段区分开来。 一个 特定的 DNA 片段 由其特 有的序 列组 成, 其序列组成决定了其解链区域 ( m elt ing do m ain) 和解链 行为( m elt ing behav ior) [ 7 8] 。不同 的双链 DNA 片段因为其序列组成 不一样, 所以 其解链区域及各解链区域的变性剂浓度也是不一 样的。当它们进行 DGGE 时, 一开始变性剂浓度 比较小, 不能使双链 DNA 片段最低的解链区域 解链, 此时 DNA 片 段的迁移行为和在一般的聚 丙烯酰胺凝胶中一样。然而一旦 DNA 片段迁移 到一特定位置, 其变性剂浓度刚好能使双链 DNA 片段最低的 解链区域解链时, 双链 DNA 片段最 5

在 1993 年

首次将其应用于微生物群落结构研究, 并证明了
收稿日期: 2010 03 22 基金项目: 黑 龙 江 省 科技 厅 国 际 合作 重 点 资 助 项 目 ( WB 07A 10) 第一作者简介: 宋 洋 ( 1981 ) , 女, 黑 龙江 省 哈尔 滨 市人, 硕 士, 研究实习员, 主要从事微生 物菌群分析和分子育种研究。 E mai l: achievement81@ yahoo com cn。 通讯作者: 李柱刚( 1972 ) , 男, 黑龙江省 庆安县人, 博士, 研究 员, 从事植物分子育种研究。E mail: lizhugang@ 163 com。

生物技术

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低的解链区域立即发生解链。部分解链的 DNA 片段在胶中的迁移速率会急剧降低。因此, 同样 长度但序列不同的 DNA 片段会在胶中不同位置 达到各自最低解链区域的变性剂浓度, 因此它们 会在胶中的不同位置发生部分解链导致迁移速率 大大下降, 从而在胶中被区分开来。然而, 一旦变 性剂 浓度达到 DNA 片段最高 的解链区 域浓度 时, DNA 片段会完全解链, 成为单链 DNA 分子, 此时它们又能在胶中 继续迁移。因 此如果不同 DNA 片段的序列差异发生在最高的解链区域时, 这些片段就不能被区分开来。DNA 片段分离过 程见图 1 。在 DNA 片段的一端加入一段富含 GC 的 DNA 片段( GC 夹子, 一般 30~ 50 个碱基 对) 可以解决这个问题。含有 GC 夹子的 DN A 片 段最高的解链区域在 GC 夹子这一段序列处, 它 的解链温度很高, 可以防止 DNA 片段在 DGGE 胶中完全解链。当加了 GC 夹子后, DNA 片段中 基本上每个碱基处的序 列差异都能被区 分开
[ 10 11] [ 9]

程: ( 1) 采集土壤样品; ( 2) 土壤样品总 DNA 的提 取与纯化; ( 3) 纯化的总 DNA 进行 16S rDNA V3 区巢式 PCR 扩增; ( 4) DGGE 技术 分离 P CR 产 物; ( 5) DGGE 电泳条带的指纹图谱分析。

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DGGE 技术在土壤微生物群落研究中 的应用
土壤微生物是土壤环境中的重要组成部分,

其中的群落结构及其变化在一定程度上影响了土 壤的质量, 所以对于土壤中微生物群落的研究, 在 土壤可持续利用及农业可持续发展方面起着重要 作用。由于土壤环境复杂, 运用传统的平板培养 法等很难反映出土壤微生物 的群落结构, DGGE 技术不依赖于微生物培养可以较大限度地反映出 其多样性, 它的应用为研究土壤微生物群落结构 提供了一个有效的方法。国内外的很多研究人员 利用 DGGE 技术在土壤改良及土壤微生物变化 规律、 影响因素等方面开展了分析研究。 2 1 污染土壤微生物群落的研究 由于环境污染日趋严重, 土壤及土壤中的微 生物 群 落 也 受 到 了 一 定 程 度 的 影 响。 利 用 DGGE 技术分析污染 物对土壤微生 物的多样性 及变化规律的影响, 可以提供土壤的污染程度, 并 为改 良 污 染 土 壤 提 供 理 论 依 据。 F ant roussi 等[ 12] 研究长期使用苯基尿类除草剂后农田土壤 微生物的变化, 结果表明, 使用此除草剂后, 土壤 微生物多样性明显降低, 使土壤中一些不可培养 的微生物 种 群 出 现 明 显 的 消 亡 现 象。贾 建 丽 等[ 13] 基于 PCR DGGE 技术, 对中国不同区域环 境下的油田区石油污染土壤微生物多态性进行评 价, 结果表明, 土壤含油率通过制约微生物数量和 活性而对总 DNA 产率产生影响。 2 2 作物根际土壤微生物群落的研究 植物根分泌出的无机物、 有机物等是根际微 生物的主要营养来源, 这就使得根际微生物的数 量和优势菌群随植物生育期的变化而变化, 而根 际微生物数量和菌群的变化也对根及植物的生长 产生影响。分析根际微生物的变化规律, 对建立



图1

DG G E 对 DN A 片段的分离示意图

当用 DGGE 技术来研究微生物群落结构时, 要结合 PCR( polym erase chain reaction) 扩增技 术, 用 P CR 扩增的 16S r RNA 产物来反映微生物 群落结构组成。通常根据 16S rRNA 基因中比较 保守的碱基序列设计通用引物, 其中一个引物的 5 端含有一段 GC 夹子, 用来扩增微生物群落基 因组总 DNA, 扩增产物用于 DGGE 分析。 1 2 6 基本流程 DGGE 技术研究 土壤微生 物群落的 基本流

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洋等: DGG E 技术在土壤微生物群落研究中的应用

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有利于作物生长的土壤环境具有重要意义。胡元 森
[ 14]

突变, DGGE 检出率可达 100% , 分辨率可达到 1 个碱基; 几乎可检出所有突变, 无须对引物标记; 可将突变体同野生型进行比较分析; 检测片段最 长可达 1 kb, 但最适范围为 100~ 500 bp。 与其它技术一样 DGGE 技术也存在一定局 限性。M uy zer 等 [ 18] 指出 DGGE 技术只能对微生 物群落中数量大于 1% 的优势 种群进行分析, 还 不能 完 整 地 反 映 复 杂 环 境 中 微 生 物 的 群 落。 DGGE 检 测 的 DNA 片 段 长 度 范 围 以 200 ~ 500 bp为好, 超出此范围的片段分离效果较差; 不 能完全保证 将有序列差异的 DNA 片段分开, 从 而出现序列不同的 DN A 共迁移现象。此外, 由 于 DGGE 还不能提供微生物完整、 真实的群落情 况, 在其检测的基础上往往需结合杂交技术或核 酸测 序 分析 才能 更 详尽 地 反映 微 生物 群 落复 杂性。

等用 DGGE 技术分析黄瓜连作土壤微生物

群落演替规律, 发现黄瓜根际细菌数量与其生长 发育关系密切, 而非根际细菌数量随黄瓜生长发 育变化不大。黄瓜连作导致根际微生物数量显著 变化可能与 根分泌物在根 部累积有 关。孙晓棠 等[ 15] 用巢式 PCR DGGE 法研究番茄不同生育期 根际微生物种群的动态变化, 根际细菌种类和数量 在初花期发生较为显著的变化, 初果期根际群落多 样性指数和物种丰度值都达到最高, 微生物最丰 富, 是筛选 拮抗菌的 较好时期。而 Ma
[ 9]

等应用

PCR DGGE 技术探测灌木根际真菌, 通过与加拿 大萨斯喀彻温省土壤中的已知菌群作比较, 验证这 种方法的有效性, 并发现了一种以前未观察到的灌 木根际真菌 2 3 Scutellosp or a Calosp ora。 影响土壤微生物多样性的研究 土壤中的微生物是敏感群体, 周围环境发生 变化时就可能对其产生一定程度的影响。探讨周 围环境对微生物多样性造成的损失与伤害, 可以 为保护土 壤 微 生 物 多 样 性 提 供 方法。王 岳 坤 等
[ 16]

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展望
DGGE 技术作为 土壤微生 物快速分 析的重

要手段, 再辅以杂交技术或核酸测序分析技术, 能 够更深入地揭示土壤微生物群落的多样性。随着 DGGE 技术在土壤微生物评价方面的广泛应用, 研究人员将对其不断改进和完善, 使其在土壤、 活 性淤泥、 底泥等材料中微生物群落结构、 多样性及 演替规律等方面的研究过程中发挥更大的作用, 也为人类更近一步认识微生物提供可靠的理论依 据, 从 而能够 更好地 开发和 利用有 益的 微生物 资源。 参考文献:
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从红树林中 19 种不同红树植物的土壤中抽

提微生物总 DNA, 直接扩增 16S rDNA V3 片段, 应用 DGGE 技术和分子克隆技术分析 16S rDNA V3 片段的 多态性, 发 现地域因素和 红树品种都 是影响土 壤 微 生 物 群落 结 构 的 因 素。A llision Mccaing 利用 DGGE 方法对 3 种类型草地的细菌 多样性进行了比较, 同时也对没改进的和经过改 进的草地土壤用克隆方法进行了 比较
[ 17]

。结果

表明, 通过对图谱进行分析确实揭示出了 3 种草 地类型中的细菌群体结构的差异, 改进了的草地 样品中的细菌多样性比没改进的草地样品低, 半 改进的草地样品中细菌与 其它 2 个 草地样品相 比, 具有较少的多样性和较低的组内变化。

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DGGE 技术的优点与局限性
DGGE 技术的优点是: 其可直接对提取的土

壤样品总 DNA 进行微生物多样性 分析, 比传统 培养方法提供更多的菌群信息; 若 P CR 产物发生

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生物技术
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M uyzer G , de W aal E C, U it t erlinden A G Profil ing of com pl ex micr obi al popul at ions by den at uring gradient gel el ec t rophoresis analysis of polymeras e chain react ion amplif ied genes coding f or 16S rR N A [ J] A ppl Environ M icrobi ol , 1993, 59: 695 700

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Application of DGGE in Soil Microorganism
SONG Yang, LI Zhu gang ( Biot echnolog y Research Inst itut e of H eilo ng jiang Academy o f Ag ricult ural Sciences/ Key Laborat ory of Cro p and L iv est ock Mo lecular Breeding of H eilo ng jiang, H arbin, H eilongjiang 150086)
Abstract: Based on moder n mo lecular technolog y, DGG E is a po werf ul too l fo r the analysis to understand com munity str uctur e o f soil micr oor ganism, which can directly separating DN A clips It has obvio us advantages and it is o ne of the most useful r esear ch methods in soil microo rg anism In this paper, the principle and the applica tion of DG GE in soil micro or ganism w ere briefly intr oduced, w hile the adv ant ages and limitat ions of t his tech nique w ere also evaluated Key words: D GGE; so il micro org anism; community st ruct ur e


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