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RNA干扰载体构建方法的研究进展_图文

湖南农业科学201I,(19):1-4

Hunan

A—cultural

Sciences

RNA干扰载体构建方法的研究进展
粟挺L2,刘爱玲1,2,陈信波1,2
(1.湖南农业大学生物科学技术学院,湖南长沙210128; 2.湖南农业大学作物基因工程重点实验室,湖南长沙410128)
摘 要:BNA干扰是通过外源或内源的双链RNA在细胞内诱导同源序列的基因表达沉默的现象。目前RNA干扰技术不但被广

泛地应用于各种基因的功能研究,而且在农作物抗逆品种的选育方面起重要的作用。RNA干扰技术的关键是构建能在受体中稳 定表达的干扰载体。阐述了近几年发展起来的3种简单,快捷、稳定的构建RNA干扰载体的方法。

关键词:RNA干扰;载体构建;基因;综述 中图分类号:Q78 文献标识码:A 文章编号:1006-060X(2011)19--4}001--04

Advances in Constructing

Method

for RNA-interference Vector

SU Ting他,LIU Ai-ling坦,CHEN Xin-bo坦 (1.Colle萨of Bioscience
2.Hunan Provincial Key end Biotechnology,HNA U,C}Ⅷ垮h 41012&PRC;

Laboratory矿Crop Gene

Engineering,HNA以咖舰41012&PRcJ
sequence gene

Abstract:RNA interference is the phenomenon of homologous
exogenous
or

expression silencing induced by the


endogenous double-RNA in cells.RNA interference
an

technique

is not only widely applied in the research of

gene function,but also plays

important role in the breeding of resistant crops at present.The key

technique

of RNA:

interference is to construct stable expression of interference vector in the receptor.This paper described 80me simple,fast and reliable methods for constructing RNA interference vector in recent years.

Key words:RNA-interference;vector construction;gene;summary

随着模式植物拟南芥和水稻全基因组测序工 作的完成,植物基因组学的工作重心已由结构基
因组学转向功能基因组学,因此迫切需要一种高

可以获得遗传上稳定的突变体。强启动子下游插入 反向重复片段的表达载体是诱导RNA干扰的最基
本结构,最有效的双链RNA构件是能转录的发夹 RNA(hairpin RNA,hpRNA)14】。研究者一般从方法

效、高通量分析方法从生物个体的整体水平阐明 基因功能。RNA干扰是通过外源或内源性的双链 RNA在细胞内诱导同源序列的基因表达沉默的现 象,其表现的性状类似于基因功能缺失产生的表 型【l-2]。RNA干扰现象自20世纪90年代中期被发 现以来,就被广泛应用于基因功能的分析验证,成 为后功能基因组学研究的热点;在农作物选育方面 也被广泛应用于农作物的品种改良和农作物的抗

是否简便、快捷、成功率高来评价植物RNA干扰 载体构建方法的优劣。笔者对目前广泛使用的构 建RNA干扰表达载体的4种方法进行了归纳和 总结。


1传统的“酶切一连接"方法构建l洙A干
扰表达载体
“酶切—连接”方法是构建RNA干扰载体最常
用的方法,被广泛应用于各种生物之中[541。其构建

病毒【3研究。进行RNA干扰研究需构建可转录为双
链RNA的表达载体,然后获得基因沉默的转基因 植株,进而分析目的基因的功能,这种方法的优点是

过程是:通过PCR方法得到目的基因的片段(添加 了合适的酶切位点),使之正反相连形成顺式片段 和反式片段,然后在顺反式片段之间插入一段中间 间隔序列以增强基因沉默效果19一iol,最后将表达载 体和RNA干扰片段相连接,形成可用于遗传转化 的RNA干扰表达载体。

收稿日期:201l—05—3l 基金项目:湖南农业大学青年科学基金项I目(07QN26) 作者简介:粟挺(1984一).男,瑶族。湖南怀化市人,硕士研究
生,研究方向为生化与分子生物学。

通讯作者:陈信波

万方数据



湖南农业科学

第19期

传统的“酶切一连接”方法对于在载体上添加 l到2个基因比较容易,对于需添加多个基因的表 达载体是比较困难的。除此之外,这种方法的试验 周期比较长,至少需要3个“酶切一连接”的循环才 能完成载体构建,耗时耗力;构建成功率不太高,在 添加最后一个基因片段时,无论是顺式片段还是反 式片段连接到表达载体上都比较困难;对原始载体 和目的片段的限制条件比较多,原始载体至少有4 个可用酶切位点.这就增加了原始载体选择的难 度。传统的“酶切—连接”方法构建RNA干扰载体 是最原始的构建方法,虽然成功地构建了多个植物 RNA干扰表达载体,但其过程相对比较繁琐,受到 限制因素也比较多,不适合做高通量的研究。

表达载体PCXUN和PCR产物的“酶切一连
接”(罔2)。表达载体PCXUN经过Xcml限制性内 切酶酶切后,会形成一个1'尾巴,正好与PCR产物

的A尾巴形成TA克降,.一]于原始表达载体PCX— UN中的致死基凶ccdB被酶叭掉,莺组干扰载体不
含致死基因ccdB,因此阳性妃隆能存活。

醺嗣嗣圈圆 一卜?



厂——————————]

图2“酶切一连接”过程

I气i——i—■■-
—i_I--‘

卜]

j’——■■—P一:}|J

2“零背景筛选”技术构建RNA干扰表达 载体
“零背景筛选”技术是Chen等…旰发出来的一 种高通量和高效率的构建RNA干扰表达载体的方
法。该方法只需简单的两步PCR反应(图1)就能形

“零背景筛选”技术通过经典的重组PCR方法旧 将两个或多个基因片段通过一个基因片段的3’端 与另一个基因片段的5’端的互补,利用重叠延伸的 方法进行高效和快速的体外基冈片段拼接。应用此 方法构建目的基因的RNA下扰构件的关键是引物 设计,在两条引物前需分别加上一对序列反向互补 的接头,此外这个方法需要进行两轮PCR反应,应 使用保真性高的DNA聚合酶以保证扩增的真实
性。在阳性重组子的筛选过程中F}I于原始载体致死

成干扰载体所需的“发夹”结构,免去了传统方法中 一系列的“酶切一连接”过程;并且此方法筛选阳性 克隆的方法简单,且出现“假阳性”的概率非常小, 几乎为零,所以叫做“零背景筛选”。通过中间载体 中的致死基因ecdB来筛选阳性克隆,与目的基因 连接成功的载体能存活,反之不能存活。此方法只 需两步简单的PCR反应和一次“酶切一连接”过程 就能完成RNA干扰表达载体的构建。其具体步骤
如下。

基因ccdB的存在,导致阳性重组子的筛选效率极 高。此方法只需两步PCR反应就能得到RNA干扰 构件”q,只需一步酶切一连接过程即可以将干扰构 件连接于载体上,构建成RNA干扰表达载体,所以 大大降低了对原载体上可用酶切位点的要求。使用 这种技术,Chen等构建了一套由12个临时载体和 12个稳定载体组成的遗传转化载体用来研究植物 的基因表达,并在水稻和拟南芥中验证了这些载体 的表达。这种方法较传统构建方法更简便、适用性
更广泛。


2.1两步PCR反应
第一步,PCR过程中使用的引物P2和P4是在 正常引物前加上一个含有特殊序列的接头,而引物 P2前面的接头和P4前面接头的序列是反向互补 的。第二步.PCR过程所用的DNA聚合酶是一种 特殊的酶。它可以在PCR产物后面加上A尾巴,
如图1。

盹Firs。l-toum|匝圃匝五巫珂
◆矿
上◆





Gateway技术构建RNA干扰表达载体

Gateway技术是Invitrogen公司开发的一项基 因克隆和表达的新技术.只需BP和LR两个反应 就可以完成RNA干扰表达载体的构建,不需要使
用限制性内切酶和连接酶。

I+下

鬻“…玄匝郦三五F哥1
2.2一次“酶切一连接”过程
万方数据



Gateway技术过程:BP反应(图3)主要是将目 的基因或PCR产物重组人供体载体(donor vector)。 在获得目的基因PCR片段时,需在PCR产物的5’ 端加人attBl位点,3’端加入attB2位点,供体载体

第19期

粟挺等:RNA干扰载体构建办法的研究进展



两端具有attPl和attP2位点,PCR产物和供体载体 在BP反应酶催化下,通过同源重组形成新的位点
attLl和attL2,生成带有目的基因的入门载体。LR

和靶mRNA通过特异的碱基配对结合,形成RISC 沉默复合体,阻碍基因的正常表达。人工IIliRNAⅢ捌 技术指利用miRNA的表达特性,使用生物体内源 的miRNA前体∞创作为人工miRNA的表达框架.
产生出小分子RNA介导的靶基因沉默。因此,在二 级结构不变的前提下,可以通过改变生物体内源

反应(图4)主要是将目的基因从入门载体重组人 目的载体,反应由LR反应酶混合物催化。人门载 体基因两端具有attLl和attL2位点.目的载体上含
有attRI和attR2位点,在LR反应酶作用下发生定

向重组,形成新的位点attBl和attB2,从而将目的
基因转移到目的表达载体中。筛选阳性克隆的机

miRNA前体的一些核苷酸,生成针对特异目的基因 沉默的人T miRNA,目前被广泛使用的miRNA前
体骨架有ath—miR l 59a,ath-miR 1 64b,ath-miR 1 69d, ath—miRl72a,ath—miR319a和osa-miR5280

制是:入门载体质粒上带有卡那霉素抗性基因,而 目的载体质粒上带有壮观霉素抗性基因。重组目 的载体质粒的选择标记为壮观霉素¨卅。具体二L:作原 理见图4。

Weigel等l巧建立了一个人工miRNA设计平台,
在WMD3(Web
MicroRNA Designer,http://wmd3.

product

囊鬯P啦CR喜铲眄(≮猡ntry眄Y
基闪 产物


[圈+[团一[团+[团
\ / \ / \ Bttaudorp 一 flanked pPCR

weigelworld.ors/cgi—bin/webapp.cgi)系统中,可以对 100多种植物设计人工miRNA。使用WMD3的 “Designer”T具,选择所要干涉的植物的基因组数 据库,输入目的基因序列,在线提交,该系统通过和 植物基因组数据库比对,防止“脱靶”,并根据人工 miRNA的相关参数(如Tm值等)列出候选的人工
miRNA。Weige!等提供了基于拟南芥miR319a、水

弋”””m少

010“少







图3

BP反应

[团+[四一[正五]+[巫强]
图4

迢罗嗵萝赠罗迢罗
LR反应

稻miR528、莱氏衣藻的pChlamiRNA2/3载体作为 构建人工miRNA的模板,用PCR方法替换载体上
miRNA片段,构建成人工miRNA表达载体。

Gateway技术是一项基因克隆和表达的新技

人工miRNA技术是一项新兴的生物技术,具 有高效、精确、可控等优点,是替代RNA干扰的有 效T具。几乎所有可以利用RNA干扰的地方都可 以用人工miRNA替代。与RNA干扰技术相比,人 工miRNA具有独特的优势。人工miRNA可以同时 干涉多个序列具有同源性的基因,因此可以用来研
究多拷贝的基因或功能存在互补效应的基因;利用

术,与传统的“酶切一连接”方法构建表达载体比 较,该技术具有耗时短、操作简单等特点,即只需通
过高效的BP和I.R反应就可实现把目的基因定向 转入表达载体中,克隆效率可达到95%t‘51。Gateway 技术应用于构建RNA干扰表达载体具有简便、快

捷、成功率高、对原始载体和目的片段的限制少等 优势,可避免构建RNA干扰载体时存在的困难和 繁琐的“酶切—连接”步骤。很多科研。Jj作者已利用
Gateway技术成功地构建了多种RNA干扰表达载

人下miRNA可以建立基因沉默的突变体库,进行
基因组功能研究。

5结语
RNA干扰技术作为一种基因工程策略,被广

体用于研究基因的功能,姜玲等116l成功构建了番木
瓜环斑病毒CP基因的RNA干扰表达载体;徐化

学等fr'/]利用Gateway技术快速成功地构建了水稻
OsDADl基因的RNA干扰表达载体并用以研究基

泛应用于农作物的遗传改良、抗病毒和抗寄生线 虫例等方面的研究。构建RNA干扰表达载体是最
常用和最基本的试验步骤。随着分子生物学技术的

因的功能;晏立英等f18I构建了花生条纹病毒基因的
RNA干扰表达载体。

不断发展,植物RNA干扰表达载体的构建方法也
会不断推陈出新,变得越来越简便、有效。“零背景

4以人工miRNA为基础的方法构建RNA 干扰表达载体
miRNA是一类内源单链非编码小分子RNA,约 为22 nFl9--20l,广泛存在真核生物中。其小分子RNA 万方数据

筛选”技术突破了传统的限制性酶切法进行基因连
接的概念。将重组PCR技术应用于植物RNA干扰 表达载体的构建,是近两年发展起来的一项新技 术,被证明是可行的;Gateway技术利用同源重组的

原理来构建RNA干扰表达载体,也是一种简便、快



湖南农业科学

第19期

捷的方法,适合高通量的研究;人工miRNA的方法 具有干扰成功率高、并且允许碱基错配、允许同时 表达几个人工miRNA分子,组织特异性的调节表 达等优点网,在植物发育调控、逆境应答及激素调 节等方面应用价值更高[2Sl。随着基因工程技术的发 展,富有创新性的RNA干扰表达载体的构建方法 必将为植物基因功能研究提供更有力的技术支撑。
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(责任编辑:高国赋)

万方数据

RNA干扰载体构建方法的研究进展
作者: 作者单位: 刊名: 英文刊名: 年,卷(期): 粟挺, 刘爱玲, 陈信波, SU Ting, LIU Ai-ling, CHEN Xin-bo 湖南农业大学生物科学技术学院,湖南长沙210128;湖南农业大学作物基因工程重点实验室,湖南长沙 410128 湖南农业科学 Hunan Agricultural Sciences 2011(19)

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本文读者也读过(2条) 1. 罗武.张春强 RNA干扰技术在急性脊髓损伤早期治疗中的应用[期刊论文]-临床和实验医学杂志2012,11(6) 2. 张改云.熊腾飞.马有志.郭家明.陈学平.ZHANG Gai-yun.XIONG Teng-fei.MA You-zhi.GUO Jia-ming.CHEN Xue-ping 烟草CN基因 的RNA沉默载体构建与功能分析[期刊论文]-中国烟草学报2010,16(4)

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得到紫色更深的花; 方法:构建强启动子的苯基苯乙烯酮合酶表达载体,导入 牵牛...RNA干扰技术原理及应用 30页 5下载券 RNA干扰的研究进展 7页 5下载券 RNA...
RNA干扰技术在胰腺癌基因治疗中的研究进展_图文.pdf
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