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PCR-DGGE 技术在微生物物种多样性研究中的局限性及其解决措施_图文

※专题论述

食品科学

2008, Vol. 29, No. 05 493

P C R - D G G E 技术在微生物物种多样性 研究中的局限性及其解决措施

马俊孝,季明杰,孔 健 *
(山东大学 微生物技术国家重点实验室,山东 济南

250100)

摘 要:变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)技术目前已经成为研究微生物物种多样性 和动态变化的分子检测工具之一。该技术不依赖于微生物的分离培养,便能快速、准确地获取复杂样品中微生物 的菌群组成及其遗传信息,因此被广泛应用于微生物生态学、食品微生物学等领域。但 DGGE 技术存在一定的局 限性,有时会造成分析结果的偏差。本文简单概述了 DGGE 技术的基本原理及其在微生物群落分析中的应用,重 点对造成 D G G E 结果偏差的因素,如 D N A 提取、P C R 扩增、D G G E 条件以及 D G G E 图谱分析等进行讨论,并提 出相应的解决措施,旨在对 D G G E 检测结果的分析提供参考。 关键词:变性梯度凝胶电泳;微生物多样性;微生物生态学;P C R ;局限性

Overview of Limitation and Improving Methods of PCR-DGGE in Microbial Diversity Study

MA Jun-xiao,JI Ming-jie,KONG Jian* (State Key Laborotory of Microbial Technology, Shandong University, Jinan 250100, China)

Abstract:Polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE) technique has been proven to be

a powerful tool for analyzing microbial communities and their dynamics changes. As a fast and reliable molecular method,

DGGE is used widely to investigate the microbial component and structure of complex communities without isolation and

cultivation processes. However, potential causes resulting in limitations in DGGE analysis can be sometimes met. In this paper,

the principle and application aspects, as well as the limitation of DGGE techniques for microbial ecology analysis were introduced,

and the main causing factors addressed and discussed, such as DNA extraction, PCR amplification, DGGE conditions optimization,

and DGGE profile analysis.

Key words:DGGE;microbial diversity;microbial ecology;PCR;limitations

中图分类号:Q939.97

文献标识码:A

文章编号:1002-6630(2008)05-0493-05

对于微生物物种多样性的分析传统上主要依赖于经 典的培养技术,即经过菌株分离纯化、形态观察、生 理生化特征等环节获得部分信息后再进行菌株分类鉴 定。该过程步骤繁琐、工作量大,而且对于生理生化 特性相似的菌株,仅凭这些特征难以正确区别和鉴定, 并且生态环境中不可培养的微生物易被遗漏[1-2]。近几 年,逐步发展起来的分子生物学技术克服了经典培养方 法的不足以及引起种群丢失等的缺陷,可以更可靠、更 快速地获得环境样品中各种微生物的菌落指纹和特征性 核苷酸序列以确定微生物的多样性及其分类地位,揭示 和丰富了生态环境的微生物资源。

变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)技术已经发展成为研究微生物群 落组成及亲缘关系的主要分子工具之一[3-4],它不依赖于 培养过程,大大缩短了样品的分析时间,而且还能显 示环境样品中不可培养的微生物的遗传信息,因此, D G G E 技术在微生物多样性研究中发挥了重要作用。但 是 D G G E 技术的应用存在一定的局限性,有时造成检测 结果的偏差。本文简述 PCR-DGGE 技术的原理及其在微 生物生态学中的应用,重点对 PCR-DGGE 技术在复杂样 品的微生物群落分析中造成结果偏差的原因进行归纳和 讨论,并提出相应的解决方法,以便对以后的 D G G E 结

收稿日期:2007-04-02 基金项目:国家“8 6 3 ”高技术研究发展计划项目( 2 0 0 6 A A 1 0 Z 3 4 4 ;2 0 0 6 A A 1 0 Z 3 2 1 ) 作者简介:马俊孝(1978-),男,硕士研究生,研究方向为食品微生物学。E-mail:jx·m@mail.sdu.edu.cn * 通讯作者:孔健(1964-),女,教授,博士,研究方向为应用微生物。E-mail:kongjian@sdu.edu.cn

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果分析提供帮助。
1 DGGE 原理
一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳能将大小不同的 D N A 分子进行分离,但是对于大小相同碱基序列不同的 D N A 片段因其具有相同的迁移行为而不能被分开。鉴 于此,D G G E 技术在一般聚丙烯酰胺凝胶电泳的基础上 添加了呈梯度分布的变性剂( 如尿素和甲酰胺) ,使双链 D N A 分子迁移到一定的变性剂浓度并达到其解链温度 时,便开始部分解链。而部分解链的 D N A 分子其迁移 率随解链程度增大而减小,从而使序列不同大小相近的 D N A 片段滞留于凝胶的不同位置,形成相互分开的谱 带[3-5]。
2 DGGE 技术在微生物生态学中的应用
D G G E 技术对微生物多样性的分析不依赖于微生物 的培养过程,而是直接提取环境样品中总的 D N A ,由 此包括了样品中可培养微生物和不可培养微生物的总遗 传信息,从而真实地反映了微生物群落的原始组成。自 1993 年 Muyzer 等人首次将 DGGE 技术应用于微生物生态 群落结构的研究后,迅速扩展到微生物分子生态学研究 的各个领域,如土壤[6-7]、肠道[8]、温泉[9]、海洋[10]、 根际等生态环境,目前在发酵食品的微生物检测及质量 控制中也显示出很好的应用潜力[11-14]。有关 DGGE 技术 的应用已有很多报道,本文不再做详细概述。
3 造成 DGGE 结果偏差的因素及其解决措施
理论上,只要选择的电泳条件如变性剂梯度、电 泳时间、电压等适当,DGGE 技术便可区分一个碱基差 异的 D NA 片段[15]。但是在 D G G E 实际操作中通常包括: 样品的预处理、样品总 D N A 的提取、样品靶基因( 如 16S r DNA 基因片段)的 PCR 扩增、扩增产物的 DGGE 分 析等步骤,每一环节的操作均有可能造成分析结果的偏 差,以致最终导致分析结果的不准确。造成结果偏差 的因素可以归纳为以下几个方面。 3.1 环境样品中总 D N A 提取
PCR-DGGE 技术是建立在环境样品的总遗传信息分 析的基础上,因此 D N A 提取质量的好坏,直接影响着 后续分子实验操作。然而对于复杂环境样品 D N A 提取 通常需要经过样品预处理、细胞裂解、D N A 沉淀等环 节,以上过程易造成菌种数量的改变和 D N A 含量的变 化,由此引起分析偏差[1 6] 。
3.1.1 样品的预处理 环境样品组成复杂,除含有微生物细胞外,还含
有复杂的有机物质和无机盐类,这些杂质去除不干净,

将会对 D N A 后续分析产生重大影响。环境样品总 D N A 提取方法可概括为两类:间接法和直接法[17-18]。间接提 取法是先经过梯度离心、离心洗涤等步骤去除样品中的 杂质,然后再收集细胞和裂解细胞,该过程容易造成 微生物种类和数量的丢失;而直接法是不去除杂质直接 对样品处理以使细胞裂解,该操作不可避免地造成环境 样品中杂质(主要是腐殖酸和多糖)对 DNA 的污染,进而 影响后续的分子操作。
3.1.2 裂解细胞 环境样品中存在的微生物种类繁多,生理状态各
异,细胞壁结构和组成也不同( 如革兰氏阳性菌和阴性 菌) 。为使提取的 D N A 分子具有代表性,必须保证所有 微生物细胞无选择性地裂解而释放出核酸物质。目前裂 解环境样品微生物细胞的方法有:酶法、化学法和机械 法以及 3 种方法的有机结合。大量实验证明,微珠振荡 法能彻底破坏样品结构, 从而得以最大限度的触及整个细 菌群落, 包括深藏在样品微穴中的细菌,而且对细胞无 选择性,是一种方便且有效细胞裂解方法[ 1 9 - 2 1 ] 。
3.1.3 D N A 的获取 环境样品总 D N A 提取质量的高低多以获得量大、
能用于后续分子操作和尽可能地包含样品中所有微生物 类群的遗传信息为指标。D N A 提取过程中一般用乙 醇、异丙醇和聚乙二醇( P E G ) 等有机溶剂沉淀 D N A 分 子,这些有机溶剂对环境样品的 D N A 均有一定的优先 选择性。Porteous 等[22]认为肝糖原有助于提高 DNA 的 涵盖面从而减少遗漏。
环境样品中微生物种类和数量存在差异,为了尽可 能多地包含劣势微生物的遗传信息,需要针对样品的理 化性质和生物学特性采取适当的提取方法和对现有方法 进行改进,以得到高质量的 D N A 。
3.2 P C R 扩增 利用 D G G E 技术分析微生物群落组成时,通常结合
PCR 技术,即通过 PCR 扩增产物的指纹图谱反映微生物 群落组成的有关信息。但是 PCR 技术自身也存在诸多不 足,具体表现在以下几个方面。
3.2.1 扩增效率的差异 采用细菌通用引物、以提取的混合 D N A 为模板,
扩增 16S rRNA 上的靶基因时,其扩增几率不均等,而 是存在基因优先扩增现象,即所谓的基因扩增偏嗜性。 邢德峰等[23]利用 PCR-DGGE 技术分析活性污泥的微生物 组成时发现,采用的引物不同,其 P C R - D G G E 指纹谱 带存在明显差异。笔者以等量混合的乳酸菌染色体 D N A 为模板,采用细菌通用引物和乳酸菌专用引物分 别扩增 16S rRNA 的 V3 可变区域,其扩增产物在 DGGE 胶板上虽然谱带数相同,但谱带明暗程度明显不同。采

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用降落 PCR 技术能增加引物对模板的识别特异性,降低 基因扩增的偏嗜性。此外,选用多对引物同时对混合 DNA 进行 PCR-DGGE 分析也能补救扩增偏嗜性造成的偏 差 。 [21, 24-25]
3.2.2 P C R 人工产物 利用 P C R 扩增复杂样品的靶基因时,因 D N A 聚合
酶识别的错误、D N A 点突变等原因,可能会产生一些 人工序列(artifactual sequence),如嵌合体(chimeras)、异 源双链(heteroduplexes)和单链 DNA 等[26],这些人工序 列在 D G G E 凝胶板上的出现,致使对样品中微生物种类 评估过高。通过重复 PCR 或对谱带序列测定可以排除嵌 合体,异源双链产生的几率要比嵌合体低,P C R 扩增 产生的单链 D N A 在进行垂直 D G G E 时将形成横贯于 “S ”形曲线陡峭部分的亮线而得以区别。
3.2.3 “ G C 夹 板 ” 技 术 在 D N A 分子中 G 、C 碱基对比 A 、T 碱基对结合
牢固,G 、C 含量高的区域具有较高的解链温度,为 区别序列差异发生在最高解链温度区域的 D N A 片段, 使用了“G C 夹板”( G C - c l a m p ) 。所谓“G C 夹板”是 将一段长度为 3 0 ~5 0 b p 富含 G 、C 的 D N A 序列连接到 双链的一端以形成一个人工高温解链区,使 D N A 片段 的原有部分处在低温解链区从而实现更好的分离。罗海 峰等[27]在研究土壤微生物多样性时,使用 G C 夹板后, P C R 产物在 D G G E 胶板上的分离效率大大提高。
3.2.4 D N A 聚合酶的影响 目前用于 P C R 反应中的 D N A 聚合酶有多种,性质
差异很大。D N A 聚合酶的质量和保真性对扩增产物产生 较大影响,罗海峰[28]等人利用 DGGE 比较了 Taq DNA 聚 合酶、Tsg DNA 聚合酶和 Pfu DNA 聚合酶对 PCR 扩增产 物的忠实性,结果以 P f u D N A 聚合酶的扩增效果最好。
3.2.5 靶基因的拷贝数 16S rRNA 基因是目前用于菌株鉴定的主要分子指
征,过去 DGGE 分析多选用 16S rRNA 的可变区域,由 于 16S rRNA 基因在染色体上存在多个拷贝,致使同一 种细菌在 D G G E 图谱中可能出现多条带,由此高估了样 品中微生物的种类。为了减少基因拷贝数的影响, Rantsiou 和 Renouf 选用单拷贝的 RNA 聚合酶亚单位基因 rpoB 作为靶基因,对食品发酵中乳酸菌的菌群组成和菌 群的适时变化进行分析,避免了基因拷贝数的影响,收 到了很好的实验效果[29-30]。此外,P C R 扩增时,模板 浓度[31]和模板被污染的程度[32],也会导致 PCR 扩增结果 的差异。 3.3 D G G E 技术相关参数
D G G E 技术的检测还与实验条件,如变性剂浓度梯 度和电泳时间有关。尽管目前有些软件能够预测和模拟

靶基因的解链性质[ 5 ] ,但与实际操作还有一定的偏差, 仍然需要根据实际情况摸索具体的实验条件。 3.3.1 变性剂梯度的选择
在进行 D G G E 实验前,首先通过垂直变性梯度电泳 了解 D N A 分子的解链性质,以确定变性剂浓度梯度。 所谓垂直变性梯度电泳,即电泳方向与变性剂梯度线性 增加的方向垂直,在聚丙烯凝胶板上变性剂梯度是从左 到右梯度增加,加样孔是一个占胶板整个宽度的单一大 孔( 与梯度方向平行) 。电泳后经染色,凝胶板上呈现出 一条清晰的“S ”型曲线,如图 1 所示( 笔者实验结果, 待发表) 。在曲线中出现的陡峭跃迁的位置显示了有关 D N A 片段解链区域的数目及相对 T M 值( 变性剂浓度) , 以电泳条带能否被分开来确定合适的变性剂范围。
ssDNA

电泳方向

变性剂

Fig.1

图 1 确定 DGGE 变性剂浓度梯度的垂直电泳图谱 Profile of perpendicular DGGE for determining denaturant
agent concentration

3.3.2 电泳时间的确定 电泳时间与 D N A 片段的大小、凝胶浓度、凝胶规
格、变性剂梯度、以及系统电压等参数有关。一般在 既定规格的胶板上,电泳时间与电压密切相关,电压 越低,电泳时间越长。在凝胶规格、电压一定的情况 下,通过垂直电泳确定合适的变性剂浓度梯度后,再 进行变性剂呈线性梯度增加、方向与电泳方向一致的平 行 D G G E 确定电泳时间。电泳时间的确定采用时间间歇 (time-travel)加样法,即每隔一定时间加一次样品。如 图 2 所示,从而使样品的电泳时间有一个梯度,根据电 泳结果,样品获得最大分辨率的时间即为最佳电泳时 间。 3.4 染色及 D G G E 图谱分析
与琼脂糖凝胶电泳一样,D G G E 胶板上的 D N A 谱 带通过染色后才能观察。常用的染色剂有溴化乙啶 (ethidium bromide, EB)、SYBR Green I、SYBR Gold 和 银。E B 染色是最常用的方法,该方法操作简单,但聚

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图 2 确定 DGGE 电泳时间的水平电泳图谱 Fig.2 Profile of time-travel DGGE for determining time
丙烯酰胺对 E B 有熄灭作用,致使灵敏度低,导致低估 环境样品中微生物的种类。SYBR Green I、SYBR Gold 染色,灵敏度高,能更好的消除染色背景,但是 S Y B R 染料价格昂贵。E B 和 S Y B R 染料只对双链 D N A 着色, 单链 D N A 几乎不显色。银染法单、双链 D N A 均能着 色,其缺点是不能用于后续的分子操作[ 5 , 3 3 ] 。
有时染色后的 D N A 谱带强度较弱或不很清晰,可 以加大 D N A 的进样量。鉴于凝胶进样孔的容量有限, 可以对 P C R 产物浓缩后进样。在观察和比较 D G G E 指纹 图谱时,对于明亮程度差异的谱带,在排除点样误差 外,还应考虑基因扩增效率的偏嗜性。 3.5 共迁移
若选用的实验条件不当,则可能会出现不同序列 DNA 片段发生共迁移的现象[34-35],即同一条带含有不同 种类细菌的现象,这样就低估了环境样品中的微生物种 类。降低共迁移发生的措施一是选用不同引物扩增目的 基因,然后比较 D G G E 谱带的差异,另一种方法是对相 应的 D G G E 条带割胶后用不带 G C 序列的引物进行扩增, 其 P C R 产物序列测定后验证。
4 展望
尽管 D G G E 技术本身存在一些不足有待完善,但该 技术具有重复性高、快速和容易操作等优点,能够弥 补传统方法的不足,已经成为微生物学领域的重要研究 手段。最近,在 D G G E 基础上发展起来的双梯度 D G G E (double-gradient denaturing gradient gel electrophoresis, DG DGGE)[36-37]、依赖培养的DGGE(culture-dependent gradient denaturing gradient gel electrophoresis, CD DGGE)[38-39] 等,能使 D N A 形成的谱带更清晰、更真实,因此, 在对复杂环境样品的微生物多样性研究中仍然是一种很 好的技术手段。

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