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DGGE技术及其在环境微生物中的应用_图文

第 33卷第 10 期 2008 年 10月

环境科学与管理 ENV IRONM ENTAL SC IENCE AND M ANAG EM ENT

Vol133 N o 10 1 Oct 2008 .

文章编号: 1673- 1212( 2008) 10- 0093- 04

DGGE 技术及其在环境微生物中的应用
李怀 , 关卫省 , 欧阳二明 , 王晓慧 , 张杰
1 1 2 2 2

( 1 长安大学 环境科学与工程学院, 陕西 西安 710054 2 清华大学 环境科学与工程系, 北京 100084) . ; .

摘 要: 变性梯度凝胶电泳 ( DGGE )具有可靠性强、 重复性好、 方便 快捷等优点, 已被 广泛应用 于环境科学 和污 染防治研究领域。介绍了变性梯度凝胶电泳 ( DGGE )的 基本原 理和技 术路线, 重点 介绍和 讨论了 DGGE 技术 在废水生物处理、 废气生物处理和固废生 物处理中的应用现状, 并对该技术的应用前景进行了 展望。 关键词: DGGE; 微生物多样性; 活性污泥 中图分类号: X703 1 . 文献标识 码: A

DGGE (Denatured G radient G el E lectrophoresis) and its App lication in the R esearch of Environm enta lM icrob iology
L iH ua i, GuanW e isheng , Ou Yangerm ing , W ang X iaohui , Zhang Jie
1 1 2 2 2

( 1. Depart ent of Environm en tal Science and E ng ineering Changp U nivers ity X ip 710054, Ch ina m , an , an ; 2 D epart ent of Environm en tal Science and Eng ineering Ts inghua Un iversity Beijing 100084 Ch ina) . m , , , A b stract Denaturing gradient gel electrophoresis(DGGE) has the advantages of h igh reliability good repetition and easy op2 : , eration, and been w idely used in environm ental science and Pollution p revention research areas. In th is paper it is briefly intro2 , duced that DGGE( denaturing grad ient gel electrophoresis) is app lied inW aste water b iological treat en, waste gas b iological treat2 m t ment and solid waste b iological treatment and its p rincipa,l Techn ical rou te as well as the future of th is technology was expected. , K ey words DGGE; m icrob ial d iversity activated sludge : ;

变性梯度凝胶电泳 ( Denatur ing grad ient gel elec2 trophoresis, DGGE ) 技术 是由 F ischer 和 Ler an 于 m 1979年最先提出的用于检测 DNA 突变的一种电泳 技术 。 1993年 Muzyer等 首次将 DGGE 技术应 用于微生物生态学研究, 并证实了这种技术在研究 自然界微生物群落的遗传多样性和种群差异方面具 有明显的优越性。 活性污泥微生物种类极其丰富, 优势种群及其 微生物多样性在活性污泥生态系统中发挥着重要的 作用。目前在环境科学和污染防治研究领域, 关于 活性污泥中微生物多样性的研究越来越受到重视; 而传统的纯培养分离技术研究活性污泥微生物多样 性有很大的缺陷, 不能获得未被培养的微生物的信 息, 只能分离出占活性污泥总数 011 ~ 1 的微生 % % 物种类。而分子生物学技术如 PCR- DGGE, PCR收稿日期: 2008 - 06- 21 作者简介: 李怀 ( 1982- ), 男, 硕士 研究生, 主 要研究方 向: 水污染 控 制工程。 通讯联系人: 关卫省
[ 1] [ 2]

SSCP和 T- RFLP等能够在分子水平上对活性污泥 微生物多样性进行快速和精确的分子诊断, 并可以 监测未被培养的微生物种类。所以与传统方法相比 DGGE 技术能够快速、 准确地鉴定在自然 生境或人 工生境中的微生物种群, 并进行复杂微生物群落结 构演替规律、 微生物种群动态、 基因定位、 表达调控 的评价分析。由于 DGGE具有可靠性强、 重现性高、 方便快捷等优点, 短短的十年内, 已经成为微生物群 落遗传多样性和动态分析的强有力工具, 并被广泛 用于活性污泥、 生物膜、 土壤、 底泥等环境样品中的 微生物多样性检测和种群演替的研究。

1

DGGE的基本原理

DGGE 技术主要原理如图 1所示, 在碱基序列存 在差异的 DNA 双链解链时需要不同的变性剂浓度, 他们一旦解链, 在聚丙烯酰胺凝胶中的电泳行为将发 生很大的变化。因此, 将 PCR 扩增得到的等长 DNA 片段在含有变性剂梯度的凝胶中进行电泳, 序列不同 的 DNA 片段就会在各自相应的变性剂浓度下变性, 发生空间构型的变化, 导致电泳的速度急剧下降, 以 # 93#

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至停留在相应变性剂梯度凝胶中, 染色后在凝胶上呈 现为分开的条带, 每个条带代表一个特定序列的 DNA 片段。在不同泳道中停留在相同位置的条带, 一般可 视为具有相同的 DNA 序列。该技术可以分辨具有相 同大小片段的序列差异, 可以用于检测单一碱基的变 化, 微生物群落遗传多样性以及 PCR 扩增 DNA 片段 的多态性。

2 2 样品 16SrDNA 片段的 PCR 扩增 . PCR 扩增是 PCR- DGGE 技术中至关重要的步 骤。 PCR 全过程包括三个基本步骤, 如图 3所示: 双 链 DNA (模板 DNA )加热变性为单链 (变性 ); 在低 温下引物与模板 DNA 单链互补配对 (退火 ); 在适 宜温度下 TaqDNA 聚合酶催化引物沿 着模板 DNA 延伸 (延伸 )。反复进 行变性、 性和延伸的循环, 复 从而使扩增 DNA 产量呈指数上升, 经 25 ~ 30 个循 6 环后, 扩增倍数可达 10 倍。

图 1 DGGE 反应原理

为了提高 DGGE 的检测敏感性, 通常在一侧引 物的 5c端 设 计 增 加 一段 富 含 GC 的 区域 ( GC Clamp 其长度 通常 为 30 ~ 50 个核 苷酸 ), 避免 了 , DNA 的完全解链, 从而提高了不同碱基的检 出率, 使相差一个碱基的序列也能分辨分离。

图 3 PCR 反应原理

2 技术步骤
该技术主要操作过程 (图 2)如下: ( 1) 样品总 DNA 提取; ( 2)样品 16SrDNA片段的 PCR 扩增; ( 3) DGGE 条件优化与分析; ( 4)割胶测序等后续处理。

图 2 微生物群落结构的 16SrDNA分析方法

2 1 样品总 DNA 提取 . 沉淀物、 活性污泥和生物膜等样品中细菌种类复 杂且混杂有大量有毒物质, 如何使所有细胞裂解、 充 分释放 DNA、 有效去除杂质, 建立高效、 可靠的 DNA 提取方法成为研究者关注的热点。当前主要使用超 声波法、 基于 SDS的裂解法、 改进的化学裂解法、 微波 法、 冻融 + 玻璃珠 + 溶菌酶 + SDS和土壤提取 DNA 试剂盒法等 6种活性污泥 DNA 提取方法。 # 94#

通常采用 16SrDNA 中的保 守区作为引物 进行 PCR 反应。这是由于 16SrDNA 具有以下几个特点: ( 1) 16SrDNA 约为 1 500 个核苷 酸长, 序列长短 适 中, 适合用作分类学上的研究; ( 2)任何一种原核生 物体都具有 16SrDNA; ( 3) 16SrDNA 非常保守; ( 4 ) 16Sr NA不会在不同的个体间进行基因交换, 各物 D 种具自 己 的独 特序 列; ( 5) 目 前已 有相 当完 备 的 16Sr NA基 因资 料库, 经过 GenBank 和 R ib oso l D ma D atabase Project( RDP )基因资 料库作对比 分析, 并 [ 8] 可进行 亲 源关 系 分 析、 定 等。 Yu 等 研 究 了 鉴 16Sr NA不同 可变区 V1 V3 V5、 、 及 V1 ~ D 、 、 V6 V8 V3 V3 ~ V5 、 、V6 ~ V8 区 的 PCR 扩 增 产 物 及 其 DGGE 结果。结果表明扩增 V3区及 V3 ~ V5 区的 引物为最佳引物选择。V3 区的 PCR - DGGE 条带 数最多、 分离效果最好。如果需要较长的扩增产物, 则选择 V3~ V5区。 2 3 DGGE 条件的优化 . 通常根据基因片段的大小来确定聚丙烯酰胺凝 胶浓度, 当片段大小在 200 bp左右时, 一般采用 8 % 的凝胶, 片段在 500 bp时用 6 的凝胶。为提高分 % 辨效果, 也可以采用梯度凝胶进行分离, 对于 200 bp 的片段, 可以采用 6 ~ 12 的丙烯酰胺凝胶。变 % % 性剂的梯度范围要根据垂直 DGGE 实验来确定, 垂 直实验曲线 斜率 较大的 部分 代表 解链 区域 的 Tm (解链温度 )值, 此时低温解链区的不同分子达到最 佳分离状态。通常选择水平胶的的变性剂梯度范围 为 30% (相当于 Tm范围 10e 左右 ), 对于不同的样 品还需要 进行调 整。对 大多数 DNA 片段 50e ~

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65e 是比较适合的, 通常电泳的温度要低于样品解 链区域的 Tm 值。电泳时 间取决 于样品 的片 段大 小、 凝胶浓度、 变性剂梯度、 电泳时的电压等因素, 一 个条件的改变都可能引起电泳时间的不同, 可以用 时间进程法来优化出最佳电泳时间。 为了更好的显示 DGGE 条带, 可以选择不同的 染色方式 ( EB、 SYBR Green I和银染 )。其中, SYBR Green ? 染色的优点是背景色低, 可以观察到尽可 能多的条带; 银染的灵敏度最高, 但银染过后的条带 不能用于杂交分析。 2 4 割胶测序 . 对 DGGE 图谱上的优势条带进行割胶回收, 将 回收条带的 PCR产物进行测序分析。

3 DGGE在环境微生物中的应用
3 1 在废水生物处理研究中的应用 . DGGE 技术在废水生物处理研究中的应用使人 们对废水处理过程中微生物群落的变化产生了新的 [ 3] 认识。 Lapara等 研究了升高温度对废水好氧生物 处理过程中细菌群落结构和功能的影响, DGGE 分 析细菌群落的结果表示不同温度下有不同的细菌群 [ 4] 落。 Santegoeds等 用 DGGE 研究了来自污水处理 厂的生物膜中 SRB种群的变化和硫酸还原的优化。 在生物膜的生长过程中, 微生物群落的遗传多样性 增多。用专一性寡核苷酸探针对 DGGE条带进行杂 交分析, 在所有的生物膜和活性污泥样品中, D esulf obu lbus和 Desulf- ovib rio是主要的 SRB, 在好氧层 内部的厌氧区存在一种隶属于 Desu lf- one a的丝 m 状 SRB。但是, 在第 6周和第 8周, 可以发现不同种 类的 Desu lf obulbus和 Desul- fovib rio 。 [ 5] 刘新春等 应用 DGGE 方法, 对在相同的操作 条件下分别用低温菌和常温菌接种的两套活性污泥 系统中的微生物群落结构的动态变化进行了追踪。 由于工艺相同, 使得接种的低温菌群和常温菌群在 相同的操作条件下, 产生了相似的微生物群落结构。 随着运行时间的增加, 其菌群结构相似程度也越来 越高。硝化作用是废水处理系统中实现氨氮去除的 关键步骤。而氨氧化细菌在硝化作用过程中负责将 氨氧化为亚硝酸盐, 实现亚硝化作用, 是硝化过程中 必不可少的步骤。由于氨氧化细菌的生长速率相当 低, 生物量很少, 采用传统的细菌分离培养分析法研 [ 6] 究氨氧化细菌相当费时、 繁琐。 Avraham i等 研究 了温度对水处理反应器中 AOB(氨化细菌 )菌种群 [ 7] 结构的直接或间接影响。许玫英等 采用 PCR 扩 增 16SrDNA、 扩增功能基因、 随机克隆测序等技术, 分析处理含高浓度氨氮废水处理系统不同驯化时期 的 4个活性污泥样品氨氧化细菌的种类和氨单加氧 酶的活性, 并在国内首次采用 PCR - DGGE 相结合

的技术对样品中总的细菌类群的差异进行研究。结 果表明采用 PCR - DGGE 技术有利于更全面地了解 氨氧化细菌的类群和功能, 进而改善废水处理系统 的处理效果。 [ 8] 许春红 等对处理抗生素废水的厌氧复合床中 的微生物种群多样性进行研究。结果显示, 厌氧复合 床反应器中微生物种群丰富, 距底部 3 m以下种群最 多且相似性较高, 3 m以上的填料层部位微生物种群 明显减少, 除产甲烷菌为主外, 污泥床层与填料层中 分别有不同的优势菌种与产甲烷菌协同作用。王峰 [ 9] 等 应用 PCR - DGGE 技术对城市污水化学 - 生物 絮凝强化一级处理工艺与传统的完全混合式处理工 艺反应池活性污泥样品微生物种群结构进行了对比 研究, 对同一反应器不同位置微生物分布以及不同工 况下的微生物种群结构进行了初步探讨。结果表明 两种城市污水处理工艺中微生物种群多样性都相当 丰富, 但是种群结构相差很大, 说明化学生物絮凝处 理工艺的微生物作用与成分相近的城市污水处理工 艺中微生物作用机理可能存在相当大的差别。 [ 10] Rowan等 采用生物滴滤 反应器和生物 滤池 处理同种废水, 运用 PCR - DGGE 考察了不同反应 器中的氨氧化细菌菌群的组成。虽然不同形式反应 器或是同一反应器的不同位置中的氨氧化细菌菌群 组成不同, 但是主要种群是不依赖反应器的形式或 是在反应器中所处的位置不同而改变的, 也正是这 些主要种群在整个处理过程中发挥着重要的作用。 [ 11] Curtis等 采用 PCR- DGGE 比较了不同污水处理 厂的活 性 污 泥中 总 微 生物 群 落 的多 样 性。裘 湛 [ 12 ] 等 采用 PCR - DGGE 技术对 处理采油废水 的水 解酸化 - 缺氧法不同生物反应器中污泥样品进行研 究, 确定了微生物的 优势菌种, 并进行了多样 性分 析, 结果显示了在不同环境条件下微生物群落结构 的连续动态变化过程。 3 2 在废气生物处理研究中的应用 . 生物过滤作为一种能够有效处理恶臭和挥发性 有机废气的污染控制技术, 由于其简单高效, 得到了 快速的发展。生物滤池和生物滤塔作为生物处理气 [ 13] 体的典型。陈桐生 等采用 PCR - DGGE 技术研究 除臭生物滤池中试装置中分别处于较强酸性和中性 的两种不同运行环境下微生物种群的多样性和生物 种群的结构变化。通过扩增细菌 16SrRNA基因的 V3 可变区, 结合应用 DGGE 技术分析除臭生物滤池的生 物种群的结构变化, 并回收主要的 DNA 片段, 结合 PCR测序及 T载体克隆测序, 明确优势菌群的系统发 育地位。结果表明, 除臭生物滤池在不同的 p 条件 H 下, 微生物的多样性及其丰度存在较大差别, 强酸性 对微生物具有较高的选择作用, 与中性条件相比, 微 生物种群多样性相对较低。同时在滤池的不同层次 # 95#

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上也表现出明显的空间分布多样性差异, 序列比对结 果显示硫氧化细菌在除臭过程中占有优势地位, 为更 好地处理恶臭气体提供可靠的科学依据, 同时也为生 物除臭的应用提供一定的理论基础。 [ 14] 李建军等 利用 DGGE 技术对 处理甲苯废气 的生物滴滤池中微生物生态学进行了研究, 在运行 过程中, 随着生物滴滤池对甲苯去除能力的不断增 加, 填料当中的 微生物种群也 发生了明显的变 化。 在甲苯的选择压力下, 随时间的迁延, 微生物种类减 少, 优势种群的相对丰度增加, 处于不同层面填料上 [ 15] 的微 生 物 分 布 也 趋 向 于 一 致。 殷 峻 等 应用 DGGE 技术对处理含氨废气的生物滤塔中微生物多 样性随时间的变化进行了研究, 通过比较反应器不 同填料、 不同时期微生物多样性得出结论: 填料中微 生物的多样性都随着反应器运行时间的延长而有所 减少; 与污泥填料和混合填料相比, 堆肥填料的微生 物多样性程度最高, 反应器的去除能力也最好。 3 3 在固废生物处理研究中的应用 . 在固废处理过程中, 污泥的稳定化和餐厨垃圾 的处理是当前要解决的重要问题。微生物的稳定化 过程对于系统达到稳定状态 具有更直接的 指导意 [ 16] 义。李竺等 利用 DGGE 对快速高效堆肥处理城 市污泥中微生物进行了多样性研究, 结果表明污泥 中的微生物种群有显著的改变, 同时对堆肥后污泥 中的微生物进行 了尝试性 探讨。原 泥中无明 显亮 带, 而堆肥高温期物料 (反应 8d)与回流物料和出料 (均反应 16 d)有较为明显的亮带, 这说明该堆肥工 艺对污泥中微生物的种群构成有明显的作用, 原泥 中并无明显优势菌种, 而经堆肥后泥样中有明显优 势菌种出现, 这可能是堆肥过程中起积极作用的微 生物实现了污泥的减量化和稳定化。 [ 17] 傅以钢等 用 DGGE指纹图谱技术对污泥堆肥 工艺中的细菌种群动态变化及多样性进行了研究。 结果表明, 生物法污泥堆肥周期小于 8 d 。对污泥堆 肥各工艺环节样品进行 DGGE 指纹图谱和相似性系 数 Cs值分析, 发现随着反应的持续进行, 微生态结构 的 Cs值越来越高, 说明微生物种群结构愈趋稳定。 证实污泥微生态能迅速进行优胜劣汰的筛选, 调整内 部细菌种群结构, 从而达到适应环境的目的, 在发酵 过程中形成的优势细菌种群能长时间保持稳定。 [ 18] 刘有胜等 利用 DGGE 技术对 城市餐厨垃圾 堆肥过程中细菌种群结构随 时间的变化进 行了研 究。 DGGE 图 谱 显 示, 不 同 时 间 堆 肥 样 中 细 菌 DGGE 图谱有着明显的差异性; 堆肥 升温期细菌种 群丰富, 优势种群不明显; 高温期细菌种群减少, 优 势种群明显; 降 温期细菌种群 结构基本保持稳 定。 温度对堆肥过程中细菌种群具有明显的筛选作用。 堆肥各阶段 DGGE 图谱相似性 Cs值比较低, 堆肥处 # 96#

理后细菌种群结构与堆肥原料之间存在明显差异。

4 不足与展望
在短短十年内, DGGE 技术已经成为 微生物群 落遗传多样性和动态分析的强有力工具, 还存在着 不足: 实际微生物细胞壁的坚实度不同获得样品中 所有种类微生物的 r NA 难度加大, 容易 导致提取 D DNA不完全; 实际 PCR 扩增过程中不均等扩增 ( Bi2 as)、 有些微生物 rDNA 条数不同等都会造成 PCR 结 果的代表性下降; 理论上对于 500 bp以内含 GC堆 积 rDNA, DGGE 可以分离其所有点变异的 95 , 但 % 实际上来自一种微生物的 DNA 量不到样品 DNA 量 的 1 时, 肉眼难以检测其条带。 % 因此, DGGE技术作为一项新兴的研究手段和工 具, 还需要在以下几个方面进行加强和改进: ( 1)需要 摸索适合具体样品的 DNA 提取方法和最佳 PCR 条 件; ( 2)优化 DGGE 条件和仔细分析具体结果。 此外, 还应该加强 DGGE 技术与其它技术的联 用: DGGE方法可能采用双梯度 DGGE /TGGE, 如联合 使用一个丙烯酰胺梯度或温度梯度以达到更好的分 辨率; 利用末端标记的荧光 PCR 产物、 附加荧光内泳 道标准化检测稀少群落组成和精确的样品对样品比 较。使用功能型基因作为分子标记也能区别关系相 近但生态 差异的种群; DGGE 与 克隆文库等技术结 合, 可克服局限性, 充分发挥分离的优势。目前的发 展趋势是 PCR - DGGE /TGGE 与其他分子技术以及 微生物学、 地球化学方法联合使用, 这样可以减少不 同技术的弊端与局限性, 综合各种技术的优势, 从而 更真实地揭示环境微生物群落结构和功能的本质。

5 结语
DGGE 技术作为一项新兴有力的研究工具, 已 成为环境微生物群落遗传多样性和动态分析的强有 力工具, DGGE 技术及其它分子生物学技 术的引入 将为中国环境科学和污染防治研究领域的基础理论 研究提供强有力的武器, 同时也会促进工程实践的 快速发展, 对中国的环境污染控制作出贡献。 参考文献:
[ 1]Muyzer G, S a lla K. App lica tion of denatur ing gradient m ge l electrophoresis( DGGE) and te perature gradient ge l e lectro2 m phoresis( TGGE) in m icrob ial ecology[ J]. Antonie van Leeuwen2 hoek 1998 73: 127- 141 , , . [ 2]Muyzer G, W aa l EC U itterlinden AG. Profiling of com2 , plexm icrobial popu lations by denatur ing gradient gel electrophoresis ana lysis of polymerase chain reaction a lified genes encoding for mp 16S r RNA[ J]. Appl Environ M icrob io,l 1993, 59 695- 700 : . [ 3] LaPara T M, Konopka A A Nakastu C H, et a. Eff s , l ect of elevated te mperature on bacterial community st ructure and func2 tion in b ioreactors t reating a synthetic waste water[ J]. M icrob io.l Biotechno.l, 2001 24( 2): 140- 145 , .

(下转第 99页 )

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卓燕等 # CAST 工艺在制革废水处理中的应用

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表 2 制革 废水处理效果
月份 2 3 4 5 6 7 进 COD c r 2 250 2 780 2 650 2 350 2 730 2 580 BOD5 960 1 250 1 150 1 050 1 180 1 075 S230 58 52 40 62 48 水 总 Cr 12 25 23 19 27 18 p 值 H 9. 5 8. 5 9. 0 8. 8 7. 8 8. 3 COD c r 235 265 263 242 273 255 BOD 5 65 78 72 63 84 68 出 S20 75 . 0 82 . 0 95 . 0 65 . 0 73 . 0 86 . 水 总 Cr 0 98 . 1 02 . 1 25 . 0 86 . 1 18 . 1 05 .

mg/ l pH 值 8 5 . 8 4 . 7 6 . 8 0 . 8 2 . 7 8 .

(注: 以上指标均为当月多次测定的平均值。 )

5 主要经济技术指标
该工程总投资为 175 万元, 总占 地面积为 600 2 m 。该废水处理站总装机功率为 4515 KW, 使用功 率为 3918 KW。运行成本为 1 52元 / , 其中人工费 . t 0105元 / t 电费 0182元 / t 药剂费 0155元 / ,t 污泥外 、 、 运费 0110元 / t 。

( 4)应用物化 - CAST工艺处理制革污水, 工艺 流程简单, 采用矩形结构, 节约工程基建投资, 运行 时, 不需要大量的污泥回流, 自动化程度高, 实现自 动控制, 运行灵活, 方便维护管理, 降低处理费用, 所 以建设和运行费用低。 参考文献:
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6 结论
( 1)通过 分流和采用物化作为预处理工艺, 取 得较理想的 COD 和色度去除效果, 对 COD 的去除 率达到了 50 以上, 大大地降低了后续生物处理的 % 负担, 为达标排放提供保障。 ( 2) CAST 工艺保持了典型的完全混合特性, 处 理效果好, 抗冲击能力强 的特点, 对 COD cr、 BOD5、 2S 、 Cr的去除率均在 90 以上, 处理出水优于国 总 % 家二级标准。 ( 3) CAST 设置生物选择器, 促进絮凝型细菌的 生长和繁殖, 从而抑制了污泥膨胀的发生, 高效地进 行硝化反硝化, 脱氮除磷效果显著。 (上接第 96页 )
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