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生物技术大作业之文献综述


RNA 干扰及其在水稻抗病毒基因工程中的应用
摘要: 摘要: RNA 干扰( RNA interference, RNAi)是一种基因沉默机制。RNAi 作为新兴的基因阻 断技术具有明显的优势,已被广泛应用到动植物功能基因组和植物抗病研究中。在抗病毒研 究中,人为地将与病毒或宿主基因同源的双链 RNA 分子导入转基因植株, 引起与其同源的 基因发生沉默,达到抗病毒的作用。本文主要综述了 RNA 干扰的 相关知识以及在水稻抗病毒基因工程研究中的应用进展。 关键词: RNA 干扰;  基因工程;  水稻病毒病害 关键词:

Advances in RNA interference and its applications in genetic engineering against Rice stripe virus
Abstract: RNA interference is a mechanism of gene silencing. As a newly developed gene silence tool, RNAi possesses distinct advantages and has been applied to plant and animal functional genomics and plant disease resistance research. In plant antivirus research, double strands RNA homo lo go us to virus gene or host gene is transferred into plant to repress the virus replication and r educe its damage . This review summarizes the advances in RNA interference techniques and its applications in r ice genetic engineering research. Key words: RNA interference;  genetic engineering;  rice virus diseases 

水稻病毒病是由病毒引起的一类系统性侵染病害,世界上已经发现和确认的 水稻病毒病( 包括类菌原体病)约有 16 种,其中在我国发生的有 11 种( 包括两 种类菌原体病) ,分别是普通矮缩病、黄叶病、条纹叶枯病、黑条矮缩病、黄萎 病、草状矮缩病、簇矮病、锯齿叶矮缩病、橙叶病、东格鲁病、瘤矮病。中国稻 区广阔, 水稻病毒病可广泛流行, 在病害严重流行时,曾十几个省相继发病, 暴 发成灾, 仅一个省( 市、自治区)因病损稻谷即数十万 t。北方粳稻产区以水稻 条纹叶枯病发生普遍。水稻条纹叶枯病( rice stripe disease) 是由水稻条纹 病毒( Rice stripe virus, RSV)引起的一种最严重的水稻病毒病害, 是通过灰 飞虱[ Laodelphax striatellus ( Fallen) ]刺吸以持久性方式传播, 汁液、土 壤及种子均不能传毒。自 20 世纪 80 年代末期以来,该病在我国水稻种植区的发 病率逐年提高,特别是在粳稻种植区,发生更为普遍。 据不完全统计, 全国近年该 病的发病面积已达 267 万 hm2 以上, 病区发病率一般在 10% ~ 20%, 重者株发病 率达 50% ~80%, 给农民带来重大经济损失[ 1]。利用水稻品种抗性被认为是防治 水稻条纹叶枯病最经济、 有效的方法。用常规方法培育抗病品种存在育种周期 长、效率低,抗病基因与不良性状连锁等问题。RNA 干扰( RNA interference, RNAi ) 技术所具有的特异性、稳定性、高效、快速以及不改变基因组的遗传组

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成等特性,为基因功能的研究提供了强有力的手段, 同时也为转基因植物抗病毒 病害增添了新的策略和方法。 1 RNA 干扰( RNAi) 干扰( RNA 干扰( RNA interference, RNAi) 是指双链 RNA( double stranded RNA, dsRNA)分子引起的序列特异性靶基因 mRNA 降解,从而导致内源或外源靶基因沉 默的机制。 1.1 RNAi 的发现 1.1 RNAi 尽管 RNAi 现象只是在 20 世纪 90 年代以来才被认识并逐渐引起人们的注意, 但是第 1 篇与 RNAi 相关的文章可能早在 1928 年就已发表。Wingard 发现由烟 草环斑病毒侵染的烟草植株开始时表现出明显的病症, 但上部叶片的症状会逐 渐变轻, 可以从病毒侵染症状中 恢复 过来,并且新长出的叶片可抵抗同源病 毒的再次侵染,具有了一定的抗性。当时并没有有关 RNAi 机制的任何信息,甚至 不知道烟草环斑病毒的基因组是 RNA。不过,这一现象说明了抗性机制的存在可 以限制或阻止病毒的再次侵染。1998 年, Fire 等人 [ 3] 将 dsRNA 注入线虫 (Caenorhabditis elegans )体内后发现可抑制序列同源基因的表达,抑制主要作 用于转录之后, 并将此现象称为 RNA 干扰。此后, RNA 干扰现象被证明广泛存 在于真菌、线虫、 果蝇、植物、高等动物等生物中,发现者也因此获得 2006 年 诺贝尔生理学或医学奖。 1.2 RNAi 的作用机制 1.2.1 dsRNA 的来源 经研究发现有多种途径可以产生 dsRNA,主要为: 1)当基因组的一些随机位 点被插入一段序列的多个拷贝时,侧翼启动子驱动转录, 转录通读可以产生与该 正义链序列互补的双链 RNA, 形成 dsRNA;2)对于具有末端反向重复序列的转座 子, 转录通读产生的 RNA 会自身回折形成发夹结构的 dsRNA( hairpinRNA, hpRNA)[
4- 5] [ 2]

; 3)帮助细胞识别异常的 RNA ( aberr ant RNA ) , 并在 RdRP

( RNAdependent RNA polymerase) 作用下, 转变成 dsRNA[ 6]; 4) 植物中, RNA 病毒感染可以直接引入 dsRNA[ 4- 5]; 5)外源基因以反向重复的形式插入基因组后 可转录产生 hpRNA; 6)正义 RNA 大量表达引起的共抑制, 也能诱导 dsRNA 的产 生[ 7]; 7) 病毒或植物细胞中的 miRNA 基因, 其前体 miRNA( premiRNA) 被 DCL1 加工为 miRNA-miRN A * 双体( 即为 dsRNA)[ 8- 9]。无论哪种途径产生的 dsRNA, 都可引发 RNAi。 1.2.2 RdRp 介导的补充途径 在线虫、 植物、 真菌和果蝇中还存在依赖 RNA 的 RNA 聚合酶介导的补充 途径, RdRp 可能的作用方式有: 1) RdRP 以 siRNA 单链为引物合成靶 mRNA 的

2

互补链; 2) 不需要引物直接合成异常 RNA 的互补链; 3)在 1 条 mRNA 链上结合 了 2 条或多条 siRNA 引物, 分别由 RdRP 延伸后再由 RNA 连接酶连接成互补 链; 4) dsRNA 解旋后, 2 条链均结合上 siRNA 引物,分别由 RdRP 合成互补链, 新合成的次生 dsRNA 又被 Dicer 切割成大量次生 siRNA,从而增强了诱导基因沉 默的效率
[ 6]



1.2.3 RNAi 的 3 种主要途径 RNAi 通过大量基因抑制现象的研究, 以及生化和遗传学上的分析表明, 基因沉 默有 3 种不同的途径。这 3 种途径都包括 dsRNA 被含有 RNase III 结构域的 Dicer 酶切割为 21~ 26 个核苷酸小分子 RNA 的过程 miRNA( microRNA)。 1.2.3.1 转录后基因沉默( posttranscriptional gene silencing, PTGS) 转录后基因沉默( posttranscriptional PTGS) PTGS 是最普遍的一种沉默机制。此机制主要由 siRNA 介导[ 11]。病毒侵染的 植物细胞中的 dsRNA 可能是单链 RNA 病毒的复制中间产物或是其二级结构形 态。至于植物 DNA 病毒,其 dsRNA 可能是具有重叠互补序列的转录物经由退火 形成的。在胞质中的 Dicer 酶或其类似物( Dicer like, DCL)的作用下把长链 dsRNA 切割成 siRNA, 其具 5’端磷酸和 3’端羟基,此外每条单链的 3’端均 有 2~ 3 个突出的非配对的碱基[ 12- 13]。由 siRNA 中的反义链指导形成一种核蛋白 体, 即 RNA 诱导的沉默复合体( RNAinduced silencing complex , RISC ) , 然 后 siRNA 作为引导序列,按照碱基互补配对原则识别靶基因转录的 mRNA, 并引 导 RISC 复合体结合 mRNA; 接着 siRNA 与 mRNA 在复合体中换位, 内切核酸酶 将 mRNA 切割成 21~ 23 nt 的片段,特异性地抑制靶基因的表达; 另一方面, 释 放的 siRNA 可结合在靶 mRNA 上作为引物, 在 RdRp ( RNA dependent RNA Polymerase ) 的作用下合成 dsRNA ,合成的新的 dsRNA 又可以发生 RNAi 现象, 特异地降解靶 mRNA[ 14- 16],从而产生级联放大反应。 转录水平的基因沉默( 1.2.3.2 转录水平的基因沉默( transcriptional gene silencing, TGS) TGS 机制是通过改变靶基因染色质的结构来实现的。许多研究表明, 发生 T GS 的主要原因是启动子序列的碱基尤其是胞嘧啶的甲基化。siRNA 通过碱基配 对原理, 指导 DNA 甲基化酶结合到 DNA 的特异部位,引发该部位 DNA 中胞嘧啶 的甲基化( RNA directed DNA methylation, RdDM) 及组蛋白 H3 赖氨酸 9 的甲 基化[ 17- 21], 使靶启动子失去功能, 导致下游基因转录沉默。另外, DNA 甲基化 可以阻止转座酶的生成,从而抑制转座子的移动,保持遗传稳定, 防止遗传损害
[ 22] [ 10]

。目前研究比较清楚且

使用较多的基因沉默小分子 RNA 主要有 siRNA ( small interfering RNA)及

。 1.2.3.3 翻译水平的基因沉默

3

这种机制主要是由内源的 miRNA 介导的基因沉默。miRNA 是由长度约 70nt 的 RNA 形成的茎环样前体,经 Dicer 酶作用后形成长约 21~ 25nt 的单链 RNA, 大多数 miRNA 与底物 mRNA 不完全配对结合, 它们并不改变 miRNA 的稳定性
[ 23-24]

。这种抑制方式最终也通过形成 RISC 发挥作用, 结合在相应的 mRNA 的
[ 25- 26]

3’末端非翻译区( 3’UTR) 上,对靶基因进行转录后的负调控, 而靶 mRNA 并 不发生变化, 所以属于一种翻译水平上的抑制效应 。 miRNA 和 siRNA 相同, 除了都由 Dicer 酶加工成熟之外, RNAi 必需的 Argonaute ( alg1、alg2) 家族 基因也是这两种 RNA 行使生物功能所必需的。 RNAi 过程中形成的 RISC 复合 在 物既含有 siRNA 又含有 miRNA, 此复合物可根据不同情况产生不同效应,若 siRNA 与靶序列不能严格配对( 如有单个碱基错配) ,则 PT GS 无法进行,此时 复合物转而利用 miRNA 抑制核糖体在 mRNA 上延伸从而在翻译水平阻断基因表 达[ 27]。 2 RNAi 技术在植物抗病毒研究中的应用 RNAi 技术目前已经广泛应用于植物病毒的防治上。 1998 年,首次报道了 RNAi 技术在防治马铃薯 Y 病毒病上的应用, Waterhouse 等人利用马铃薯 Y 病毒 ( PVY ) 蛋白酶基因片段构建 IRS( inverted repeat sequence) 载体进行烟草 转化, 使植株完全免疫[ 28]。 dsRNA 为 RNAi 的诱导起始物。 生物体由于病毒入侵、 转座子转录、基因组中反向重复序列转录以及外源基因导入等原因都可能产生 dsRNA 分子。dsRNA 的产生有化学合成法、体外转录法和转录载体体内转录法。 现在普遍采用转录载体体内转录法。 2.1 RNAi 表达载体的构建 2.1 2.1.1 靶基因序列的选择 2.1.1 构建高效的 RNAi 表达载体是应用 RNAi 技术的关键。其中导入的 dsRNA 具 有特异性是利用 RNAi 的前提, 在保证不影响其他功能的前提下降解病毒基因 组。 这种特异性是由 dsRNA 与目的基因的同源序列决定的,所以如果在植物体内 还有另外的基因与 RNAi 作用的基因有同源性, 这个基因必定也会受到 RNAi 的影响。另外, 对于 RNAi 的作用位点要经过精心选择。位点选择不当还常常会 导致脱靶效应( off-target effect ) 。由于 siRNAs 和靶 mRNA 可以有一定的 错配和间隙,因此 siRNAs 可能在一个基因组中作用于上百个潜在的目标序列
[ 29]

。现在已经发展出若干种算法和软件帮助选择特异的 siRNA 靶序列[ 30], 运用

科学并相对先进的技术可以帮助尽量避免脱靶效应的产生。目前,RNAi 技术在植 物抗病毒研究中, 主要从两方面来设计 RNAi 作用的靶位点: 1) 以病毒基因组序 列为靶位点设计 dsRNA,来起到抑制的作用; 2)以宿主植物的基因组序列为靶位 点设计 dsRNA, 来起到抑制的作用。前一种方法目前研究和应用的比较多,它是

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将植物病毒基因组的一部分片段作为 RNAi 作用的靶位点来设 dsRNA, 从而达到 抗病毒的目的。Shuichiro
[ 31]

等人分别以马铃薯 X 病毒( Potato virus X , PVX)

的外壳蛋白基因和 TGBp1 基因(这个基因编码 RNA 沉默抑制因子) 为靶位点来设 siRNA, 他们分别选取了这两个基因的部分片段设计成可产生发夹结构的反向重 复序列, 结果表明这两种 siRNA 都能干扰 PVX 的侵染。后一种方法研究和应用 的比较少, 因为它需要在对宿主植物某些基因功能了解比较清楚的前提下进行。 2.1.2 dsRNA 表达结构 对于 dsRNA 表达结构, 人们多采用基因片段反向连接成反向重复序列的方 法, 可使表达的单链 RNA 自我配对形成发夹结构 RNA ( hpRNA) , 发夹茎部形成 稳定的 dsRNA 可诱导同源的内源基因沉默。 通常在片段之间需存在一段间隔区, 以便使载体结构更加稳定。而用正义方向连接的内含子序列替代 hpRNA 间隔区, 形成带有内含子结构的 ihpRNA (intron splicing hpRNA)载体,其沉默效率可达 到 90%以上[ 32]。Wesley 等[ 33]对此进行了深入的比较研究,其结果表明长度为 98~ 853 bp 的靶基因反向重复片段能够高效地导致沉默, 其转化体沉默效率可达 66% ~ 100%(平均 90% )。另外启动子强弱对于外源基因的表达水平也有很重要 的影响, 在构建准备转化禾本科植物( 如水稻) 的表达载体时, 可用 Ubiquit in 启动子等,以获得较高的干扰程度
[ 34]



2.2 RNAi 技术在抗水稻条纹叶枯病毒中的应用 利用 RNAi 技术赋予植物体病毒抗性具有高度可行性,目前已有通过 RNAi 技 术获得抗性的报道。如 Pinto 等[ 35]将南方菜豆花叶病毒属的水稻黄斑驳病毒 ( Rice yellow mottle virus , RYMV) 复制所需酶的部分基因通过构建载体而 转化水稻, 诱发基因沉默,从而使植物具有对 RYMV 的抗性, 并且这种抗性能稳 定遗传 3 代。马中良等
[ 36]

根据抗水稻矮缩病毒( Rice dwarf virus, RDV)序列,

构建了与其相关的 RNA 干扰序列,导入水稻中, 发现对水稻矮缩病毒有很高的 抗性。转病毒外壳蛋白 cp 基因策略是研究最早、 应用最广泛的抗病毒手段。 Hayakawa 等[ 37]和燕义唐等[ 38- 39]将条纹叶枯病毒的 cp 基因分别导入到粳稻和 籼稻中, 发现表达外壳蛋白基因的转基因水稻植株对 RSV 的侵染起到一定的抗 性。研究表明, 当 RSV 侵染水稻后, 伴随着病症的加剧, 植物细胞内病毒的外 壳蛋白 CP 和病害特异性蛋白 SP 发生积累,而其他病毒蛋白的积累并不明显, 因此推测这两种蛋白都是致病相关蛋白[ 40]。刘利华等[ 41]应用免疫胶体金电镜技 术发现病毒的 CP 和 SP 在寄主组织细胞中的叶绿体和细胞质中都有存在, 线粒 体中没有, 而细胞核中只有 CP 分布, 这表明 CP 极有可能是病害的致病相关 蛋白,甚至致病性方面比 SP 更为重要;并且还发现在叶肉组织细胞壁的胞间连 丝中存在 CP, 据此推测 CP 也可能与病毒的运输有关。 因此, 目前在利用 RNAi

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技术抗水稻条纹叶枯病毒中经常选取病毒的 cp 基因作为靶位点。代玉华等[ 42] 以 水 稻 条 纹 叶 枯 病 毒 的 cp 基 因 为 靶 标 , 通 过 将 载 体 pMCG161 和 载 体 pCAMBIA1301 双酶切和连接,构建了一个具有 CaMV 35S 启动子并且在正反义链 中间含有一个水稻内含子适于水稻农杆菌转化的高表达 RNAi 载体。张恭等
[ 43]

利用已公布的水稻条纹叶枯病毒的序列和 siRNA Target Finder 软件,获得了 168 条 siRNA 片段, 利用这些片段在水稻基因组中 BLAST,最终获得 6 条与水稻 基因组完全不匹配的干扰序列。 选择其中的 2 条, 通过化学合成干扰序列,利用 pCAMBIA1301 质粒构建了 2 个 RNA 干扰载体。这些研究为探索利用 RNA 干扰技 术防治水稻条纹叶枯病奠定了基础。 3 结语 RNAi 技术已经高效地应用于能够沉默特定植物基因的分子植物育种, 并被 Science 杂志评为 2001、 2002 年度自然科学十大突破之一[ 44], 为目前分子生物 学和遗传学研究热点。 正如诺贝尔生理学或医学奖评奖委员会主席戈兰!汉松说: 我们为一种基本机制的发现颁奖。这种机制已被全世界的发明家证明是正确的, 是给它发个诺贝尔奖的时候了。RNAi 技术发展迅速,以上的研究也说明 RNAi 技 术在应用于抗水稻病毒研究中的巨大潜力。但 RNAi 也有其自身的不足之处。研 究证实即使是有一个碱基的突变, 也会对干扰的效果产生巨大的影响[ 45]。siRNA 的脱靶效应也是进行 RNAi 试验时需要注意的一个问题[ 46- 47]。并且对于 RSV 的 各基因产物的功能及其在致病性中的作用等方面的研究还很少。 尽管仍有一些问 题亟待研究, 但随着分子生物学方法和技术的发展,可以预见上述问题必将一一 得到解决, 有理由相信利用 RNAi 技术将在水稻病毒基因功能研究和水稻抗病 品种的培育方面发挥重要作用。 参考文献: 参考文献: [ 1] 吴书俊, 钟环, 左慧, 等. 水稻抗条纹叶枯病的遗传与育种研究进展 [ J] . 中国农学通报, 2007, 23( 1) : 244- 248. [ 2] Wingard S A. Host s and symptoms of ring spot , a virus disease of plant s[ J] . Agric Res, 1928, 37: 127- 153. [ 3] Fire A, Xu S, Mont gomery M K, etal . Potent and specificgenetic interference by double stranded RNA in Nature, 1998, 391: 806- 811. [ 4]彭昊, 王志兴, 窦道龙, 等. 由根癌农杆菌介导将葡萄糖氧化酶基因 转入水稻[ J] . 农业生物技术学报, 2003, 11( 1) : 16- 19. [ 5] Plasterk R H. RNA silencing: the genomes immune Caenorhabditis elegans[ J] .

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