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中药郁金的指纹图谱的初步研究


中药郁金的指纹图谱的初步研究
摘要: 摘要:目的 建立温莪术挥发油与姜黄素的指纹图谱,对郁金与莪术的指纹特征进 为有关的药学研究和生产的质量控制提供技 行比较,探索二者之间的内在化学本质区别, 术基础。方法 采用水蒸气蒸馏法提取挥发油,加热回流法提取姜黄素;利用中药指纹 方法 图谱技术建立指纹图谱,对郁金与温莪术的指纹图谱特征进行直观比较。结果 所建立 结果 了的指纹图谱,具有良好的精密度,重现性及稳定性。郁金与温莪术在指纹图谱特征上 有明显的不同。结论 利用中药色谱指纹图谱技术控制郁金质量具有良好的可行性。 结论 关键词: 关键词:温莪术;郁金;挥发油;姜黄素;指纹图谱

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Primary Studies of Radix Curcumae Fingerprints Yangshaui.shishuxia
Abstract: Objective To establish Rhizoma curcumae wenyujin fingerprints of volatile oil and curcuminoids for the fingerprints characteristic comparison of

Radix Curcumae kawangsiensis with Rhizoma curcumae wenyujin. Explores their
differences of chemistry essence in order to effectively control The two drug quality, and provides the technology supports for quality control of their studies and production. Methods The volatile oil was extracted by the steam

distillation; the curcuminoids was extracted by heating backflow law extraction. The fingerprints characteristics of Rhizoma curcumae wenyujin and volatile were compared after their fingerprints had been established. Results The established

fingerprints were accuracy, reproducibility and the stability. The results shown there was obvious difference on the fingerprints characteristics of two Chinese traditional medicines. Conclusion It has the good practicability using the

Chinese national medicine chromatograph fingerprints to control the curcuma quality. Key words

Rhizoma curcumae wenyujin ; Radix curcumae ; Volatile oil;

Curcumin;Fingerprints

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前言
郁金为姜科姜黄属植物温郁金Curcuma.wenyujin Y.H.Chen et C.Ling. 姜黄C.longa L. 广西莪术C.kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang. 或蓬莪术C.phaeacaulis Val. 等品种的干燥 块根[1]。本药性寒,味辛、苦,归心、肝、胆经,具有活血行气止痛、清心解郁、利胆 退黄、凉血止血之功效,常用于经闭痛经、胸腹胀痛、黄胆尿赤等证。郁金药材不仅供 中医临床配方使用,也是利胆排石片、郁金银屑片、舒肝和胃丸、安宫牛黄丸等多种中 成药的原料。据统计中国药典2000年版一部和1-19册部颁标准中有 143个成药使用了郁 金原料,约占国家标准收载中成药的3.3%[2]。国内对郁金从其资源分布、采收加工、化 学成分,药理作用等方面多有研究[3~11],发现其含有挥发油、姜黄素类、多糖、生物碱, 微量元素和其它化学成分。现代药理学证实郁金内有保肝、利胆、抗癌,抗自由基损伤 和对中枢神经抑制等作用,并对血液系统和消化系统有影响[12~18]。 中药指纹图谱是借助于波谱或色谱技术获得的中药主要是植物药次生代谢化学成 分的光谱图或色谱图。中药指纹图谱分析是针对根据中医理论建立的中药方剂不仅多为 复方,而且有效成分复杂,非任何单一活性成分所能表达,也不是多个化学成分作用的 简单加合的非线性特点建立的一种新的质量控制模式。它强调的是多个成分以相对稳定 的比例关系及位置顺序相互制约的完整的色谱或综合的光谱特征,即指纹图谱的整体性 特征和在共同特征的基础上个体之间又互有差异的模糊性特征。可以在量的概念上判断 产品质量的稳定性及批间质量的是否一致[19~22]。 中药指纹图谱在国内仍为中药研究的一 大热点,继现有的中药注射液指纹图谱的完成,对中药的药材、饮片、其它制剂的指纹 图谱研究正方兴未艾。 尽管郁金的研究较为广泛,但其目前仍有一药多名、数药同名等状况,其临床应用 时有混淆,另郁金与同属植物药材形态功用较相近。为更有效地控制该药材的质量、揭 示郁金与相关药材内在的本质区别,为相关的药学研究提供了参考数据,有必要利用现 有的中药指纹化学图谱技术,建立相应的色谱指纹图谱。根据现具备样品与实验条件, 本文建立了温莪术Rhizoma Curcuma wenyujin Y. H. Chen et C. Ling的挥发油与姜黄素部 分的色谱指纹图谱,对桂郁金Radix Curcumae kawangsiensis的化学指纹特征进行了初

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步的研究,取得了较满意的结果。

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1.1

仪器、 仪器、试剂与药品
仪器
美国安捷伦有限公司高效液相色谱仪(HPLC) ,包括: Agilent 1100 四元泵,Agilent

色谱数据工作站,Agilent 二极管阵列紫外检测器。Eclipse XDB-C18 柱(250 mm ×4.0 mm ID,5?m) ,保护柱:Zorbax SB-C18 柱(12.5 mm×4.6 mm ID,5?m) 。 SHB-Ⅱ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司) Agilent 1100液相色谱仪(美国Agilent有限公司) FA2004电子天平(上海恒平科学仪器有限公司) RE-52A旋转蒸发器 (上海亚荣生化仪器厂) 玻璃仪器气流烘干器(长城科工贸有限公司) KDM型调温电热套(山东鄄城华鲁电热仪器有限公司)

1.2试剂 试剂
甲醇(国药集团化学试剂有限公司) ;乙醚(国药集团化学试剂有限公司) ;无水硫 酸钠(天津化学化工厂) ;磷酸(国药集团化学试剂有限公司)以上试剂均为分析纯。 甲醇(天津市科密欧试剂开发中心) ;乙腈(天津市科密欧试剂开发中心)均为色谱 纯。 水为市售纯净水(杭州娃哈哈集团)

1.3 药品
牻牛儿酮对照品(111665-200401) ;莪术醇对照品(100185-200) ;标准莪术油 (544-200202)均购自中国药品生物制品检验所 郁金药材: 2006年3月购于佳木斯市金天药店, 产地: 广西北京兴中中药饮片厂生产, 批号:20051104。10批温莪术的来源见表1。

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表1 实验用温莪术来源 编号 06-1 06-2 06-3 06-4 06-5 06-6 06-7 06-8 06-9 06-10 来源 浙江端安制药厂 浙江天端药业 浙江天端药业 浙江天端药业 浙江天端药业 浙江天端药业 浙江天端药业 浙江天端药业 浙江天端药业 浙江天端药业 采集时间 2003.12 2004.12 2004.12 2004.12 2004.12 2006.01 2005.12 2005.12 2005.12 2005.12 炮制时间 2004.3 2005.1 2005.1 2005.1 2005.1 2006.4 2006.4 2006.4 2006.4 2006.4

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实验方法

2.1 供试品的制备
2.1.1 挥发油的提取
分别取温莪术与郁金药材,经适当粉碎,分别在混合均匀的500 g中药材粉末中称取 50.0 g,将药粉与8倍量的水,即400 ml置于1000 ml的圆底烧瓶中,振摇混匀,浸泡过夜, 加入数粒玻璃珠,连接挥发油提取器与冷凝管。自冷凝管上端加水使充满挥发油提取器 的刻度部分, 并溢流入烧瓶时为止。 置电热套中缓缓加热至沸, 控制冷凝下的回流液每 s 内2~3滴,并保持微沸8 h;停止加热,放置片刻,待没有回流液滴下时,由挥发油提取 器的上部将挥发油取出。

2.1.2

挥发油的精制

将挥发油置于梨形瓶内,加入无水硫酸钠适量,振摇,当瓶底有尚未结块的无水硫 酸钠,且具有流动性的时,不再增加无水硫酸钠,静止2 min, 将液体取出,用乙醚反复5 次冲洗残留在无水硫酸钠中的挥发油,合并乙醚,在旋转蒸发仪上于37 ℃回收乙醚,当

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冷凝管中不在有乙醚滴下时,将挥发油取出。

2.1.3

姜黄素部分的提取

分别取温莪术与郁金原药材的粉末,称取1 g,加入100 ml甲醇,置于500 ml圆底烧 瓶内,连接冷凝管,置电热套中缓缓加热至沸,并保持微沸30 min;停止加热,放置片刻, 待没有回流液滴下时,过滤,取滤液在旋转蒸发仪上回收甲醇,浓集至1 ml,备用。

2.1.4 去油姜黄素部分的提取
分别取温莪术与郁金原药材的粉末,按上述挥发油的提取方法除去挥发油,将残渣 置于干燥箱内,于100 ℃加热,直到烘干。再按上述2.1.3 的方法提取姜黄素,备用。

2.2 供试液制备
2.2.1 对照品溶液制备

分别精密称取吉马酮、莪术醇对照品各0.10 mg,用甲醇溶解并定容到100 ml,摇匀, 备用。另取姜黄素适量,用甲醇配制成20 ?g/ml的姜黄素对照品溶液。

2.2.2

样品液制备 样品液制备

取挥发油30 ?l置于10 ml量瓶中,加入甲醇适量溶解后,加甲醇至刻度,摇匀,经微 孔滤膜过滤后,备用。另分别取姜黄素部分与去油姜黄素部分的提取浓缩液,用微孔滤 膜过滤,作为相应的姜黄素部分与去油姜黄素部分供试液。 表2 挥发油梯度洗脱条件 Time 0 5 25 40 50 60 A﹪ 45 45 25 25 0 0 B﹪ 55 55 75 75 100 100 Flow 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000

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2.3 色谱条件
2.3.1 挥发油色谱条件
室温 25℃,进样量 20?l。检测波长/波宽:220nm/4nm;参比波长/波宽:400nm/20nm。 色谱峰光谱采集范围 180nm~450nm。流动相为 0.2﹪磷酸(A)-乙腈(B) ,流动相色谱 梯度洗脱条件见表 2。

2.3.2 姜黄素部分色谱条件
检测波长/谱带宽:420 nm/8 nm;参比波长/谱带宽:550 nm/50 nm; 色谱峰光谱采集 范围为350 nm~550 nm;流速:1 ml/min;进样量:20 ?l;柱温:常温;流动相: 0.2﹪磷酸 (A)-乙腈(B),梯度条件见表6。 表 3 姜黄素的梯度洗脱条件 Time 0 5 45 A﹪ 75 75 35 B﹪ 25 25 65 Flow 1.000 1.000 1.000

2.4

波长的选择

2.4.1 挥发油部分
以乙腈(A)和水(B)为流动相,对标准莪术油进行全梯度洗脱,进样量7 ?l,流速,记 录光谱色谱图。根据其三维色谱选取测定波长与参比波长。

2.4.2 姜黄素部分
用乙腈和4‰乙酸水溶液作为流动相, 对姜黄的供试液进行全体梯度洗脱, 记录色谱 光谱图。根据姜黄中的物质与姜黄素对照品的光谱特点,确定测定波长与参比波长。

2.5 流动相的选择
2.5.1 挥发油部分
根据标准莪术油全梯度洗脱条件下的色谱图中色谱峰分离的效果与色谱色谱峰的峰
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形,改变流动相的配比、流动相的酸度及梯度洗脱条件,不断优化色谱流动相及流动相 洗脱梯度。在被分离物质色谱峰密集处,加大洗脱梯度,使色谱峰得到更好的分离,在 色谱峰稀疏处,适当减小洗脱梯度。在色谱峰峰形不理想处,改变流动相中的酸度,进 而变更流动相的梯度直至达到理想的色谱条件。

2.5.2 姜黄素部分
根据姜黄的非挥发油部分与莪术的姜黄素部分的初始全梯度洗脱的色谱指纹进行流 动相洗脱梯度优化,不断改变流动相的配比、酸的种类与酸度,寻找较佳的流动相色谱 条件。

2.6 温莪术挥发油指纹图谱的建立
2.6.1 共有指纹峰的标定
根据以牻牛儿酮对照品色谱峰与莪术醇对照品色谱峰的保留时间,并结合温莪术油 的色谱图选定参照物。根据参照物的保留时间,计算指纹峰的相对保留时间。令参照物 峰面积为1,按中药指纹图谱的要求,计算各共有指纹峰面积与参照物峰面积的比值,标 定温莪术的共有指纹峰。

2.6.2 方法学考察
为了考察分析方法的可靠性, 以温莪术药材样品(06-2)为例, 以牻牛儿酮对照品色谱 峰为参照峰对分析方法的稳定性、仪器精密度、实验方法重现性进行相应考察。

2.6.2.1 稳定性试验
取温莪术药材样品(06-2)挥发油供试品溶液分别在0 h、2 h、4 h、7 h、11 h、16 h、 22 h、29 h,36 h和48 h不同时问点进行检测,用各主要色谱峰相对保留时间的RSD考察 色谱峰相对保留时间的一致性。

2.6.2.2 精密度试验 精密度试验
取温莪术药材样品(06-2)挥发油供试品溶液,连续进样5次,以各色谱峰相对保留时 间的相对标准差和色谱峰相对峰面积的相对标准差为指标,考察色谱峰相对保留时间及

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相对峰面积的一致性。

2.6.2.3 重现性试验
取5批温莪术药材样品(06-2)挥发油供试品溶液同法测定,考察挥发油色谱峰相对保 留时间的及相对峰面积一致性。

2.6.3 共有模式
在计算机上用 9 批温莪术的色谱指纹图谱的全谱数据,按共有模式生成法分别以平 均矢量(均值)和中位矢量(中位数)的算式计算温莪术的共有模式。为进步评价所建 的共有模式,分别用温莪术(06-1)和桂郁金检验共有模式。 平均矢量=∑

(x

1j

,x 2 j … ,x ij ,… ,x nj ) n

(1)
(2)

中位矢量=median ( x1j ,x 2 j ,… ,x ij ,… ,x nj )

式中, x ij 为当保留时间为 j 时第 i 个样品的色谱数据。同时计算各样品 a 与共有模式 b 的 相关系数(r)和夹角余弦(cosα) 。

∑ (a ? a )(b ? b ) ∑ (a ? a ) ∑ (b ? b ) a ?b ∑a b cos α = = a b ∑a ∑b
r=
i i 2 2 i i

(3)

i i

2 i

2 i

(4)

2.7 指纹特征的比较
分别取郁金与温莪术供试品溶液,在选定的色谱的条件进行平行的测定,获取相应 的色谱指纹图谱,并对其指纹特征进行直观比较。

3 实验结果
3.1 挥发油的提取
由 50 g 温莪术得挥发油 1.5 ml 的, 挥发油呈深棕色,由此计算出温莪术的出油率 为 3 %。郁金挥发油呈深紫色,挥发油总量为 0.5 ml,郁金相应的出油率为 1 ﹪。

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3.2 挥发油的测定波长 挥发油的测定波长
以乙腈和水的二元流动相, 对标准莪术油进行全梯度洗脱得到的色谱光谱如见图 1。 标准莪术油分离出的大多数物质在 210 nm 有最大吸收, 全部 由三维色谱光谱图 1 可知, 物质在 330 nm 以后无任何吸收,故选择 210 nm 为测定波长,500 nm 为参比波长,根据 高效液相色谱仪的特点,选择相应的谱带宽分别为 4 nm、100 nm。

图 1 全程梯度洗脱色谱光谱图

图 2 全程梯度洗脱色谱图

3.3 挥发油色谱分离
由标准莪术油的全程梯度洗脱色谱光谱图中截取210 nm检测波长的色谱图,结果 见图2。由图2可知,在设定的全程梯度洗脱条件下,被分离的物质的色谱峰集中在保留 时间35 min到77 min之间,相对应的流动相中乙腈的浓度为45%~87%;另由图2得知, 在保留时间45 min到50 min之间,被分离的物质的分离不理想,故将流动相B改为0.1%磷 酸水溶液,色谱梯度条件改为:0 min, 45%A-55%B;10 min, 5%A-45%B; 15 min, 55%A-45%B; 47 min,87%A-13%B; 48 min, 100%A-0%B;保持至60 min。结果见 图3。

图 3 流动相优化 1 色谱图

图 4 流动相优化 2 色谱图

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由第 1 次流动相梯度洗脱及流动相组成优化结果的图 3 可知,增加流动相的酸度和 变更流动相梯度,取得了预期的结果,原全程梯度洗脱色谱保留时间 45 min 到 50 min 之间的色谱峰得到了较好的分离。根据图 3 的分离结果中,保留时间 35min 后,色谱峰 较少、出峰时间较长,并且 48 min 后基线的漂移加大,调整流动相洗脱梯度为:0 min, 45%A-55%B; 10 min, 55%A-45%B; 15 min, 55%A-45%B; 35 min, 75%A-25%B; 36 min, 80%A-20%B; 56 min, 100%A-0%B; 保持至 60 min。结果见图 4。 由第2次流动相梯度洗脱优化结果的图4可知,变更流动相梯度,原48 min后基线的 快速漂移得到了纠正,但原全程梯度洗脱色谱保留时间45 min到50 min之间的色谱峰得 到了较好的分离,但保留时间35 min后出峰时间仍较长,为此对流动相的酸度进行了改 变,由原来的1‰磷酸水溶液提高到2‰的磷酸水溶液,结果见图5。

图5 流动相优化3色谱图

图6 流动相优化4色谱图

由图4和图5对照分析得到,增加流动相的酸度,35min后出峰时间得到了一定程度 的缩短,但保留时间35min后,色谱峰的出峰时间仍较长;同时,在色谱保留时间10 min 前无明显的色谱峰,为缩短指纹图谱的时间,对流动相的洗脱梯度进行了进步优化,改 变后的梯度条件为: min, 50%A-50%B; 5 min, 55%A-45%B, 10 min, 55%A-45%B; 0 30 min, 75%A-25%B;35 min,100%A-0%B;保持至45 min,此次优化结果见图6。 由图 6 可知,在优化后的流动相梯度条件下,各色谱峰的分离效果仍保持较好, 但色谱保留时间有较大程度的缩短,达到了原定的目标。故初步确定该色谱流动相及流 动相洗脱条件为色谱指纹图谱的实验条件。

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按上述的确定的流动相及流动相洗脱条件,对来源确定的温莪术挥发油样品(06-1) 进行了色谱分离,同时根据先前的试验结果,对进样的样品浓度及进样量进行了调整, 以获得好的准确度。改变后的状况为:取温莪术挥发油 10 ?l 置于 10 ml 量瓶中,加入甲 醇适量溶解后,加甲醇至刻度,摇匀,经微孔滤膜过滤后,进样 20 ?l。指纹图谱的结果 见图 7。

图7 流动相优化5色谱图

图8 流动相优化6色谱图

由图7发现, 温莪术挥发油在初定的流动相梯度条件下, min后分离结果极不理想, 35 并且标准莪术油与温莪术挥发油的色谱指纹特征明显不同。经与相同条件下的广西莪术 挥发油及蓬莪术挥发油的色谱指纹图谱比较,得到标准莪术油为广西莪术挥发油而不是 温莪术挥发油。基于建立温莪术挥发油的指纹图谱的目的,对初定的流动相梯度条件进 行了如下的变更:0 min, 55%A-45%B;5 min, 55%A-45%B; 25 min, 75%A-25%B; 40 min,75%A-25%B; 50 min, 100%A-0%B, 保持至60 min。变更后得到的结果见 图8。由图8可知,在设定的流动相组成和梯度洗脱条件下,温莪术挥发油有较理想的指 纹特征,并且色谱分离也较理想。因此,最终确定该色谱条件为挥发油的指纹图谱的色 谱条件。

3.4 共有指纹峰的标定
3.4.1 参照物色谱峰
按经优化最终确定了色谱条件对牻牛儿酮对照品与莪术醇对照品进行色谱洗脱, 得 到的对照品色谱色谱图见图 9。由图 9 可知,牻牛儿酮对照品与莪术醇对照品分别在保

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留时间 34.82 min 和保留时间是 17.13 min。基于温莪术挥发油的色谱图 8 中,莪术醇的 色谱峰峰强度很小,而牻牛儿酮峰的峰强度相对较大,故选取牻牛儿酮峰为参照物色谱 峰。

图 9 牻牛儿酮对照品 a 与莪术醇对照品 b 色谱图

3.4.2 色谱峰标定
根据温莪术挥发油的色谱图 8,选取参照物色谱峰峰面积 10%以上的色谱峰为温莪 术指纹图谱的特征峰,并进行标记。其中,5 号峰与 7 号峰为重叠峰。

3.5 方法学考察结果
按实验方法对温莪术挥发油指纹图谱方法学中的色谱精密度和稳定性的结果分别 为表 4、表 5,表 6 和表 7。精密度试验结果表明,5 次重复进样温莪术挥发油的各特征 峰的相对保留时间的 RSD<3%,色谱峰面积的 RSD<3%,达到中药色谱指纹图谱的要 求。色谱稳定性试验结果表明,5 批同一样品温莪术挥发油的各特征峰的相对保留时间

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的 RSD<3%,色谱峰面积的 RSD<3%,可满足中药色谱指纹图谱的要求。

表 4 相对保留时间 Rt 精密度实验结果 共有峰 No 1 2 3 4 5(S) 6 7 1 0.497 0.553 0.646 0.798 1.000 1.573 2.188 2 0.496 0.554 0.646 0.800 1.000 1.568 2.194 相对保留时间 Rt 3 0.500 0.555 0.631 0.800 1.000 1.567 2.193 4 0.499 0.555 0.647 0.800 1.000 1.582 2.185 5 0.495 0.550 0.645 0.797 1.000 1.588 2.185 0.58﹪ 0.19﹪ RSD﹪ 0.43﹪ 0.37﹪ 1.45﹪ 0.18﹪

表 5 峰面积比值精密度实验结果 共有峰 No 1 2 3 4 5(S) 6 7 1 1.117 0.746 0.288 0.164 1.000 2.058 0.164 2 1.104 0.717 0.284 0.146 1.000 2.047 0.165 峰面积比值 3 1.117 0.791 0.279 0.162 1.000 2.056 0.154 4 1.105 0.765 0.269 0.159 1.000 2.061 0.169 5 1.117 0.721 0.281 0.159 1.000 2.052 0.170 1.58﹪ 2.32﹪ RSD﹪ 1.56﹪ 2.51﹪ 3.00﹪ 1.23﹪

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表 6 相对保留时间 Rt 重现性实验结果 共有峰 No 1 2 3 4 5(s) 6 7 1 0.495 0.550 0.645 0.797 1.000 1.588 2.185 2 0.498 0.553 0.647 0.799 1.000 1.568 2.192 相对保留时间 3 0.499 0.555 0.646 0.800 1.000 1.565 2.196 4 0.500 0.556 0.647 0.801 1.000 1.560 2.197 5 0.501 0.556 0.647 0.802 1.000 1.563 2.198 0.70% 0.24% RSD﹪ 0.46% 0.46% 0.13% 0.26%

表 7 峰面积比值重现性实验结果 共有峰 No 1 2 3 4 5(s) 6 7 1 0.131 0.816 0.123 0.178 1.000 0.952 0.189 2 0.131 0.820 0.128 0.179 1.000 0.965 0.188 峰面积比值 3 0.128 0.826 0.128 0.179 1.000 0.955 0.193 4 0.132 0.834 0.128 0.181 1.000 0.953 0.189 5 0.132 0.834 0.127 0.179 1.000 0.949 0.194 0.63% 1.63% RSD﹪ 1.89﹪ 0.98% 1.70% 1.56﹪

3.6 共有模式
3.6. 1 共有模式的建立
对 9 批温莪术挥发油样品(06-2~06-10)的指纹图谱数据,经色谱保留时间的多峰 校正和数据压缩,按 2.6.3 中的式(1)和式(2)计算全部指纹图信息的均值和中位数, 建立相应的共有模式,结果如图 10。各批样品与共有模式的相关系数与相和系数结果见
15

表 8。由表 8 据看出 9 批温莪术挥发油指纹图谱与它们的共有模式间的相关系数和夹角 余弦值相近、均在 0.96 以上满足中药色谱指纹图谱的质控技术要求。

图 10 No 中位数 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0.9610 0.9824 0.9967 0.9971 0.9976 0.9946 0.9967 0.9927 0.9922

9 批样品均值法 a 和中位数法 b 共有模式图 9 批样品相关系数与夹角余弦值 相关系数 均值 0.9677 0.9798 0.9959 0.9969 0.9964 0.9956 0.9971 0.9952 0.9936 夹角余弦 中位数 0.9642 0.9837 0.9970 0.9971 0.9978 0.9847 0.9969 0.9915 0.9923 均值 0.9703 0.9812 0.9961 0.9967 0.9967 0.9958 0.9972 0.9941 0.9937

表8

3.6.2 共有模式的检验
温莪术(06-1)样品及桂郁金与已建的共有模式比较,计算所得的数据见表 9。表 9

16

表明验证样品温莪术与共有模式的相关系数的夹角余弦值在 0.9 以上,而桂郁金的相关 系数的夹角余弦值不超过 0.32。 由此可见用 9 批温莪术建立的共有模式有较好的适用性, 可用于温莪术质量控制和与桂郁金的区分。 表9 样品 中位数 温莪术 桂郁金 0.9610 0.2049 检验样本与共有模式的 9 相关系数与夹角余弦值 相关系数 均值 0.9677 0.1941 夹角余弦 中位数 0.9642 0.3150 均值 0.9703 0.3035

3.7 挥发油色谱比较
按挥发油测定的色谱条件,分别测得的桂郁金与温莪术挥发油的指纹图谱,结果见图 11。可明显发现它们的化学指纹图谱相差较大,它们的色谱峰的位及峰的数目有显著的 差异。从温莪术指纹图(a)中至少可见到 10 个色谱峰, 桂郁金指纹图(b)中至少约 12 个 峰, a 图的 7 号峰峰面积很大相对较强,而在图 b 中没有该峰;图 b 中的 5、8、9 号峰为 桂郁金的特有峰; 桂郁金与温莪术色谱中均有牻牛儿酮峰即 6 号峰,且峰面积均大。

图 11

温莪术 a 与桂郁金 b 色谱指纹图

3.8 姜黄素部分测定条件
3.8 .1 测定波长

17

按起始流动相配比为 10%乙腈-90%乙酸(4‰)、流速 1 ml/min 每 min 变化 1%浓度、 对姜黄的姜黄素部分供试液进行梯度洗脱 90min。记录 350 nm~550 nm 色谱光谱,结果 见图 12。由所得的三维色谱光谱图可知,分离出的三种物质在 420 nm 有最大吸收,结 合文献[24,25]初步判定三种物质分别为姜黄素、二氢姜黄素和去甲姜黄素,根据在线光谱 可知,在 520 nm 以后无任何吸收。为进步确定测定波长,取姜黄素适量用甲醇配制成 20 ?g/ml 的姜黄素对照品溶液,在仪器上测定其光谱,结果见图 13。由图 13 可知姜黄 素在 420 nm 波长附近有的最大吸收,故选择 420 nm 为测定波长,550 nm 为参比波长, 根据高效液相色谱仪的特点,初步选择相应的谱带宽分别为 16 nm 和 100 nm。

图 12 姜黄全程梯度洗脱色谱光谱图

图 13 姜黄素对照品光谱图

3.8.2 色谱条件优化
4‰乙酸的浓度相当于 0.7 mol/L,根据弱酸的 pH 值计算得 pH 为 2.45。基于冰醋酸 在紫外光区有一定的吸收, 不利于色谱指纹图谱的相关研究, 因此, 将流动相的中的 4‰ 冰醋酸改为相近的 4‰的磷酸,按上述梯度条件进行洗脱,结果见图 14。 比较 4‰乙酸和 4‰的磷酸流动相的洗脱结果可知, 两者在出峰的数目上无差别, 仅 各峰的保留时间稍有不同, 4‰的磷酸作为流动相较用 4‰乙酸出峰时间稍延后。 用 由此 初步确定所用流动相中的酸及其浓度为 4‰的磷酸。并以桂莪术替代姜黄进行色谱条件 进行测定的结果见图 15。由图 15 得到,桂莪术的色谱指纹图谱较姜黄的色谱指纹图谱 复杂的多,另由图 15 得知,桂莪术在保留时间 60 min 后无明显的色谱峰,此时相应的 流动相中乙腈的浓度为 70%,故将梯度条件改为:0 min,25%A-75%B;30 min, 70%A-30%B;保持至 45 min。第一次优化结果见图 16。

18

图 14 乙酸 A 与磷酸 B 全程梯度洗脱色谱图 A-4‰乙酸作流动相 B-4‰磷酸作流动相

图 15 桂莪术全程梯度洗脱图

图 16 第一次优化色谱图

从图 16 得知,桂莪术在保留时间 15 min 外有一明显的宽峰、分离欠佳,同时在保 留时间 40 min 后无色谱峰,相对应的流动相中乙腈的浓度为 65%。基于上述原因,进行 第二次优化,变更色谱梯度洗脱条件改为:0 min,25%A-75%;保持 5 min;45 min, 65%A-35%B,同时为了保护色谱柱,将 B 的酸度降至为 2‰。第二次优化结果见图 17。 从图 17 得知,桂莪术色谱分离效果得到了改善。综合分析上述试验结果,最终确定了色 谱条件为:0 min, 25%乙腈-75%磷酸(0.2%)水溶液;5 min,25%乙腈-75%磷酸(0.2%)

19

水溶液;45 min,65%乙腈-35%磷酸(0.2%)水溶液。 按优化确定的色谱条件分别获取温莪术与桂郁金姜黄素部分的指纹色谱图 18。比 较温莪术与桂郁金姜黄素部分的指纹色谱图 18-A 与 18-B 可知, 温莪术与桂郁金中的 8、 9、11 号与 13、14、15 号的峰位相同,结合图 14 可知,这三对色谱峰分别为姜黄素、 二氢姜黄素和去甲姜黄素;但温莪术色谱峰强度低于桂郁金。图 18 另能表明,温莪术中 姜黄素部分的化学成分比桂郁金姜黄素部分的化学成分复杂的多。

图 17 梯度洗脱第二次优化色谱图

图 18 温莪术(A)与桂郁金(B)指纹特征

由于温莪术姜黄素部分色图谱形非常复杂,为证实是否由于未除的挥发油所至, 对除去挥发油, 和未除油的图谱进行比较结果见图 19,另对桂郁金的除去挥发油, 和未除 油的图谱进行比较结果见图 20。

图 19 温莪术的指纹特征 A-未除挥发油 B-除挥发油

图 20 桂郁金的指纹特征 A-未除挥发油 B-除挥发油

20

由图 19、 得知, 20 对于温莪术及桂郁金除挥发油与未除挥发油的姜黄素部分的指纹 图谱,除挥发油与未除挥发油的图谱基本一致,仅是峰强度有不同。未除挥发油的色谱 峰强度大于除挥发油的色谱峰强度。

4 结论与讨论
4. 1 结论
建立的温莪术指纹图谱可用于温莪术的识别与桂郁金的区分。温莪术与桂郁金的挥 发油部分和姜黄素部分的指纹特征明显不同。对于姜黄素部分样品制备中除挥发油与不 去除挥发油对指纹图谱的主要特征无明显影响,仅是除挥发油的指纹图谱色谱峰强度相 对较低。

4. 2 讨论
建立的温莪术挥发油的指纹图谱虽可用于温莪术的识别与桂郁金的区分, 但指纹图 谱中尚有未完全正确分离的色谱峰。应对色谱的条件进行进步的优化,获得更理想的色 谱指纹图谱。 应进步建立各种郁金的色谱指纹图谱,并对不同品种的郁金进行比较鉴别,以便有 效地控制郁金药材的质量。 本课题仅对郁金与温莪术的化学指纹特征进行直观上比较, 应进步利用化学计量学 的方法对两者的化学指纹特征进行深层次的比较分析,以获得更多和更准确的色谱指纹 信息,进而运用其它的联用仪器,确定各特征峰的归属。

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致 谢
本论文自始至终都是在方洪壮教授悉心指导下完成的。从论文的选题、文献的查阅、 实验的开展到论文的撰写,方老师都给了我无微不至的关心。方老师学识渊博,治学态度 严谨,工作作风认真求实,为人平易近人,使我受益匪浅。本文所取得的一点一滴的成果 都与方老师的指导分不开。谨在此对方老师表示最诚挚的谢意。 在实验过程中,我得到了药物分析所有老师的支持和帮助,缪月英老师、高金波老师 在本论文实验过程中也给了我很大的帮助,在此一并表示衷心的感谢。感谢在大学四年中 所有教授我知识的老师和所有给予我帮助的同学。我还要感谢我的父母和家人,他们一直 在默默的支持我,鼓励我。

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