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4-保健食品功效成分检测技术与方法


保健食品功效成分 检测技术与方法

提纲
一.保健食品的检验有关要求 二.保健食品理化检验及常用的分析方法 介绍 三.保健食品功效成分的检测 四.保健食品功效成分检测其它有关问题

一、保健食品的检验有关要求

1、检验依据 2、检验要求

1、主要检验依据
?保健食品管理办法(1996年卫生部46令) ?保健食品注册管理办法 ?卫生部健康相关产品检验机构认定与管理办法 (卫法监发[1999]第76号) ?卫生部发布的与保健食品相关的文件 ?保健食品通用卫生要求(1996年) ?保健(功能)食品通用标准(GB16740) ?保健食品检验与评价技术规范(2003年版) ?食品国标GB/T5009——2003 ?企业标准

2、检验要求
保健食品检验机构 ?CDC系统 ?药检系统

检验要求
1.保健食品应具有与产品配方和申 报的保健功能相适应的功效成分 或特征成分,申报时须检测配方 中主要原料所含的功效成分或特 征成分。

检验要求
1. 保健食品评审专家委员会可根据产品的具体配 方、工艺等相关资料,要求申报单位检测指定 的项目。 2. 检验机构受理保健食品检测时,申报单位应提 供该产品的配方、工艺及企业标准等相关资料。 3. 保健食品的功效成分检测工作应在SFDA和卫生 部原来认定的检测机构进行。

检验要求
1. 功效成分或指标性成分、含量及其检验方法
? 根据产品及原料确定,应与申报的功能有一定的关系 ? 功效成分或指标性成分、含量及其检验方法应分别列出 ? 依据以下二方面确定产品的功效成分(或标志性成分)并说明理由
? 与申报保健功能有关的功效成分 ? 代表产品特性的标志性成分

? 按标准(规范)规定的检测方法检测
? 无标准检测方法的,应用比较权威的检测方法,并标明方法的出处 ? 无相关检测方法的,申请人应提供详细的检测方法和方法学研究及验证 结果。研究及验证结果包括检验方法、线性范围、精密度、准确度和至 少5批加样回收率等内容及验证报告

检验要求
功效成分、特征成分、营养成分及卫生学指标 的检测方法应根据其产品适用的方法学范 围选择以下进行测定: 国家标准 卫生部部颁标准 行业标准 国际上权威分析方法

检验要求
1.在没有相应的标准方法时,企业应建 立自己的企业标准。自主开发研究的 分析方法,申报单位需向检测机构提 供方法学研究的相关资料。

检验要求
1. 质量标准
?质量标准中文文本编写格式须符合GB/T1.1-2000 标准化工作导则第一部分:标准的结构和编写规 则的规定 ?内容须包括资料性概述要素(封面、目次、前 言)、规范性一般要素(产品名称、范围、规范 性引用文件)、规范性技术要素(技术要求、试 验方法、检验规则、标志、包装、运输、储存、 规范性附录)以及质量标准编写说明 ?附录中列出检验方法和原料的质量标准

检验要求
1. 质量标准(续)
? 功效成分标示范围,具体标示方法
? 一般性功效成分(或标志性成分)按≥指标值标示,如总氨基酸、粗 多糖、膳食纤维等 ? 功效成分(或标志性成分)需要限定范围的,可按指标值±x%作为限 定范围,如总蒽醌、芦荟苷等。X值依据研制产品的检测资料确定 ? 对于每日摄入量需严格控制的化合物,如褪黑素等,其指标范围上限 折算成每日摄入量不得大于允许摄入量 ? 营养素补充剂中维生素类按指标值的0.8-1.8倍确定其指标范围,矿物质 按指标值的0.75-1.25倍确定其指标范围 ? 质量标准编制说明中应详细提供功效成分(或标志性成分)指标值的确定 依据及理由

二、保健食品理化检验及常用的 分析方法介绍

1、保健食品常见的检验项目 2、保健食品检验常用的分析方法

1、保健食品常见的检验项目
1. 感官指标(性状) 2. 水分 3. 灰分 4. 净含量与负偏差 5. 崩解时限 6. 微生物限度 7. 重金属(Pb、As、Hg) 8. 农药残留量(六六六、滴滴涕) 9. 功效成分 10. 其它

2、保健食品检验常用的分析方法

1. 感官检查法 2. 物理检查法 3. 化学分析法 4. 物理化学分析法

感官检查法
1.主要依靠人的感觉器官,即视觉、嗅觉、 味觉等来鉴定被检物质的外观、颜色、气 味和滋味等。感官检查在对某些保健食品 进行卫生学评价时具有重要的意义。

物理检查法
1.测定被测物的物理性质,如密度、旋光、 折光率等,用以判定物质的纯度。不溶 性固形物物。

化学分析法
1.定性分析
?化学反应的颜色、沉淀

2.定量分析
?重量分析
?挥发法、萃取法、沉淀法

?容量分析
?中和法、氧化还原法、沉淀法、络合滴定 法

物理化学分析法
1. 比色和分光光度法 2. 原子吸收分光光度法 3. 荧光分析法 4. 原子荧光光谱法 5. 电位分析法 6. 层析法 7. 气相色谱法 8. 高效液相色谱法

物理化学分析法
1. IR 2. HPCE 3. HPLC-MS/MS 4. GC-MS/MS 5. ICP-MS

三、保健食品功效成分的检测
(一)、保健食品原料 (二)、保健食品功效成分类别和相应检测指标 (三)、保健食品功效成分检测方法 (四)、保健食品分析方法的建立和析方法学验证 (五)、实例分析

(一)、保健食品原料
1. 普通食品 2. 植物类(中草药) 3. 动物类 4. 真菌类 5. 益生菌类 6. 核酸类 7. 新资源食品 8. 营养素 9. 其他

(三)保健食品类别和功效成分检测指标
1、增强免疫力功能 多糖(灵芝、虫草、香菇等)、腺苷、氨基酸、人参皂 苷类、花粉、党参、黄芪、伏苓、枸杞、人参、阿 胶、大枣、灵芝、灵芝孢子粉、桑葚、西洋参、螺 旋藻、冬虫夏草、蜂王浆、铁皮石斛、蜂胶、牛初 乳、杜仲、银耳、牛膝等 2、辅助降血脂功能 黄酮类、鱼油(EPA、DHA、DPA)、亚麻酸、亚油酸、 绞股蓝皂苷、卵磷脂、山楂、芦荟、丹参、牛磺酸、 茶多酚、苦荞粉、钝顶螺旋藻、决明子、维生素E、 银杏叶、荷叶、月见草油、沙棘油、红曲制剂、甲 壳素、植物甾醇、γ-谷维素等

保健食品类别和功效成分检测指标
3、辅助降血糖功能 苦瓜总苷、三价铬、多糖类、黄酮类、红曲、三七、葛 根、泽泻、田七、何首乌、黄芪、黄精、人参、乌 梅、知母、生地、决明子、山药、山楂、红花、甘 草、有机铬、苦瓜、魔芋精粉、麦芽糖醇、木糖醇、 山梨酸糖醇、异麦芽糖醇、乳糖醇、蜂胶、桑叶、 D-甘露、糖醇、百合 4、抗氧化功能 茶多酚、黄酮类、维生素C、硒

保健食品类别和功效成分检测指标
5、辅助改善记忆功能 EPA、DHA、DPA、Ve、磷脂、牛磺酸 6、缓解视疲劳功能 B-胡萝卜素、叶黄素、维生素类 7、促进排铅功能 N-葡萄糖基L-半胱氨酸、谷胱甘肽、牛初乳粉、珍珠粉、 维生素C、葡萄糖酸锌、酪蛋白磷酸肽、牛磺酸、木糖 醇 8、清咽功能 金银花、胖大海青果、冰片、薄荷脑 9、辅助降血压功能 黄酮类

保健食品类别和功效成分检测指标
10、改善睡眠功能 褪黑素、松果体素、低聚糖 11、促进泌乳功能 12、缓解体力疲劳功能 人参、西洋参皂苷类、多糖类、维生素类、淫羊藿苷 13、提高缺氧耐受力功能 角鲨烯、维生素E、角鲨烯、沙棘籽油、枸杞子、黄精、 冬虫夏草、螺旋澡、胶股蓝、茶多酚、珍珠粉、牛 初乳、党参、红景天、马鹿葺、川芎、当归、刺五 加、灵芝、黄芪、三七、银杏叶、红花

保健食品类别和功效成分检测指标
14、对辐射危害有辅助保护功能 红景天、茶多酚、维生素C、当归、蜂胶、原花青素、灵 芝、银耳、维生素E、螺旋藻、壳聚糖、枸杞、银杏 叶、女贞子、黄芪、香菇、番茄红素、刺五加、β胡萝卜素等

15、减肥功能 决明子、芦荟、黄芪、山楂、番泻叶、黄酮、肉碱、大 黄酸、茶多酚、荷叶等

保健食品类别和功效成分检测指标
16、改善生长发育功能 钙、锌、Vd、Vb6等 17、增加骨密度功能 钙、牛磺酸、Vd、Vc 18、改善营养性贫血功能 Fe,芦荟 19、对化学性肝损伤有辅助保护功能 黄酮、多糖

保健食品类别和功效成分检测指标
20、祛痤疮功能 栀子、丹皮、银花、薄荷、芦荟、野菊花 21、祛黄褐斑功能 芦荟、山药、茯苓、薏米 22、改善皮肤水份功能 23、改善皮肤油份功能

保健食品类别和功效成分检测指标
24、调节肠道菌群功能 益生菌、低聚糖类 25、促进消化功能(成人和儿童) 山楂、麦芽、鸡内金、山药、党参、莱服子、扁 豆、陈皮、伏苓、大枣、木香、神曲、佛手、 生地、低聚果糖、牛磺酸、乳酸锌、果寡糖、 微晶纤维素、膳食纤维、低聚半乳糖、大豆 低聚糖

保健食品类别和功效成分检测指标
26、通便功能 制何首乌、火麻仁、决明子、枳实、莱菔子、桃 仁、百合、玉竹、阿胶、芦荟、黄芪、膳食 纤维、大豆膳食纤维、低聚果糖、低聚半乳 糖、大豆低聚糖、螺旋藻、橘皮、蜂蜜、山 楂、几丁聚糖、番泻叶、罗汉果、大黄、甘 草、郁李仁、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、燕麦、 桑椹、乳酸菌、决明子胶、瓜尔豆胶、阿拉 伯胶 27、对胃黏膜损伤有辅助保护功能

部分常见保健食品原料为主的 产品指标检测项目
产品类型 营养素补充剂 五加科参类 蕈类(灵芝、蘑菇等) 冬虫夏草菌丝体 红景天类 检测项目 产品中标识的营养素(包 括维生素和矿物质) 皂甙 膳食纤维 腺苷 红景天甙

部分常见保健食品原料为主的 产品指标检测项目
芦荟类 大蒜类 螺旋藻类 茶叶类 魔芋类 芦荟甙 大蒜素 蛋白质、胡萝卜素、维生 素B1、维生素B2 茶多酚 膳食纤维

部分常见保健食品原料为主的 产品指标检测项目
纤维素类 磷脂类(原料) 红曲类 植物油类 动物油类 膳食纤维 丙酮不溶物、乙醚不溶 物等 洛伐它丁 脂肪酸、维生素E 脂肪酸

部分常见保健食品原料为主的 产品指标检测项目
初乳类 鹿血类 蚂蚁类 蚯蚓类 蛇、蝎等 免疫球蛋白 蛋白质、氨基酸 锰、蛋白质 蚓激酶(溶纤酶)、蛋 白质 蛋白质、氨基酸

部分常见保健食品原料为主的 产品指标检测项目
角鲨烯 蜂皇浆 蜂花粉、蜂胶 甲壳质产品 蛋白质、氨基酸制品 褪黑素产品 角鲨烯 10-羟基癸烯酸 总黄酮 脱乙酰度,产品如为复方 应检测原料的脱乙酰度 蛋白质、氨基酸 褪黑素产品原料(褪黑 素)需提供原料纯度证明 并检测

(三)保健食品功效成分检测方法
1. 保健食品中红景天甙的测定 2. 保健食品中大蒜素的测定 3. 保健食品中芦荟甙的测定 4. 保健食品中脱氢表雄甾酮(DHEA)的测定 5. 保健食品中吡啶甲酸铬的测定 6. 保健食品中盐酸硫胺、盐酸吡哆醇、烟酸、烟 酰胺和咖啡因的测定

保健食品功效成分检测方法
7. 保健食品中肌醇的测定 8. 保健食品中肉碱的测定 9. 保健食品中α-亚麻酸、γ-亚麻酸的测定 10. 保健食品中免疫球蛋白IgG的测定 11. 保健食品中人参皂甙的高效液相色谱测定 12. 保健食品中原花青素的测定

保健食品功效成分检测方法
13. 保健食品中核苷酸的测定 14. 保健食品中洛伐他丁的测定 15. 保健食品中中药功效成分的鉴别方法 16. 保健食品中银杏叶总黄酮的高效液相色谱测定 17. 保健食品中异麦芽低聚糖、低聚果糖、大豆低 聚糖的测定 18.保健食品中金雀异黄素的测定

保健食品功效成分检测方法
19.保健食品中茶氨酸的高效液相色谱测定 20.五味子类保健食品中五味子醇甲、五味子甲 素和乙素的高效液相色谱测定 21.保健食品中腺苷的测定 22.保健食品中褪黑素的测定

保健食品功效成分检测方法
23. 保健食品中总皂甙的测定 24. 保健食品中总黄酮的测定 25. 壳聚糖的游离氨基测定及脱乙酰度的计算 26. 蚓激酶活性的测定 27. 红曲产品中桔青霉素的测定

(四)保健食品分析方法的建立 和析方法学验证
· 分析方法的选择 · 分析方法学验证的内容 ·分析方法建立实例分析

分析方法的选择
1. 根据分析对象的性质选择准确、可靠的方法 2. 分析方法的科学性,应根据分析方法的评价参 数选择可以满足分析需要的分析方法 3. 分析方法的实用性,方法应简便易行,样品前 处理少、操作不费时、适合大批量样品的测定、 同时测定成本低、所用试剂和材料不特殊、种 类少、稳定性高、环保、毒性小等。 4. 方法要经过验证和评价

分析方法学验证的内容
1. 精密度 2. 准确度 3. 灵敏度 4. 检测限 5. 检测上限 6. 定量限 7. 方法的适用范围 8. 最佳测定范围 9. 选择性和专属性 10. 耐用性 11. 不确定度评估

精密度(precision)
1.
在一定条件下对同一被测物多次测定的结果与平均值偏离的程 度。精密度反映了随机误差的大小。 常用标准差(S)或相对标准偏差(RSD)表示。

?平行性(replicability)相同分析方法、样品、实验室、分析
人员、分析设备、分析时间

?重复性(repeatability)相同分析方法、样品、实验室,但分
析人员、分析设备、分析时间中至少有一项不同

?再现性(reproducibility)相同分析方法、样品,但实验室,
分析人员、分析设备、分析时间均不同

精密度
平行性 方法 样品 地点 人员 时间 设备 浓度水平 样品(n) √ √ √ √ √ √ 3 9 室内 重复性 √ √ √ √× √× √× 3 9 再现性 √ √ × × × × 3 9 室间 分散 备注

准确度(accuracy)
1.是用一个特定的分析程序所获得的分 析结果与假定的或公认的真实值之间 符合程度的度量。 2.准确度反映分析方法的系统误差和随 机误差的综合指标。 3.决定分析结果的可靠程度

准确度的评价方法
回收率 X1-X0 P(%)= ————×100
M

P ——加入的标准物质的回收率 M——加入标准物质的量 X1——加入标准样品的测定值 X0——未知样品的测定值

用回收率评价准确度需注意事项
1. 不同浓度水平,加入量与样品浓度相近(80%、 100%、120%),不能超过方法的线性范围,加 标量不得超过待测物含量的3倍。 2. 用回收率评价准确度并非完全可靠。形态不同、 与其它组分的关系不同。 3. 选定与被测样品相似的标准参考物更加可靠。 4. 样品中某些组分对被测成分产生的干扰(正、 负),有时很难靠回收率实验发现。 5. 如果可能,用不同方法比较。

灵敏度(sensitivity)

1.一个方法的灵敏度是指该方法对单位 浓度或单位量的待测物质的变化所引 起的响应量变化的程度。通常工作曲 线的斜率(k)用于度量灵敏度。 A=kc+a

检测限(limitofdetection,LOD)
1.指对某一特定的分析方法在给定的臵 信水平内可以从样品中检测到待测物 质的最小浓度或最小量。即分析方法 所能识别的极限。

分光光度法检测限的确定
1.以扣除空白值后的吸光度为0.01相对 应的浓度值为检测限。 2. 标准质量×0.01

3.检测限= ———————————— 4. 标准吸光度-空白吸光度

色谱法检测限的确定
以最低检出量(或浓度)表示检测限。 S=3N S——最小响应值(峰高或峰面积) N——噪音信号 标准物质的量×S 最低检出量= ———————————— 标准物质的响应值 注:标准物质的量尽量接近最低检出量,较为准确。

检测上限(maximumdetectability)

指与标准曲线直线部分最高界点相应的浓 度值。当样品中待测物质的浓度值超过 检测上限时,无法定量。

定量限(limitofquantitation,LOQ)
1. 定量下限:
?在限定误差能满足要求的前提下,用特定分析方法 能准确地定量测定待测物质的最小浓度或量。通常 取SN=10N ?对于消除了系统误差的特定方法来说,精密度要求 越高,则定量下限高出检测限越多。

2. 定量上限:
?在限定误差能满足要求的前提下,用特定分析方法 能准确地定量测定待测物质的最大浓度或量。 ?对于消除了系统误差的特定方法来说,精密度要求 越高,则定量上限低于检测上限越多。

方法的适用范围
1.某一特定方法的检测下限至检测上限之间 的浓度范围,在此范围内可作定性或定量 的测定。

最佳测定范围 (optimumconcentrationrange)
1.亦称有效测定范围,在限定误差能满足 要求的前提下,特定方法的测定下限至 测定上限之间的浓度范围。在此范围内 能准确地定量测定待测物质的浓度或量。 2.最佳测定范围应小于方法的适用范围, 对测量结果的精密度要求越高,则相应 的最佳测定范围越小。

检测上限 定量上限 斜率K=灵敏度

定量下限 检测限

最佳测定范围 方法适用范围

选择性和专属性
1.其它组分的存在不干扰 2.一个选择性好的方法是由一系列专属性 的测定方法组成的。

耐用性
在测定条件有小的变动是,测定结果不受 影响的承受程度。
?样品溶液的稳定性 ?提取次数、时间 ?HPLC流动相比例、PH、……

(五)、分析方法建立实例分析
实例1 高效液相色谱法测定保健食品中的淫羊藿苷

高效液相色谱法测定保健食品中的淫羊藿苷 HPLCdeterminationofIcariineinhealthfood
1范围 本方法规定了保健食品中淫羊藿苷的测定方法。 本方法适用于以淫羊藿或淫羊藿提取物为主要原料生产的保健食品中淫羊藿苷 的测定。 原理 将粉碎的胶囊内容物、丸剂或液体试样经提取、浓缩等前处理后,根据高效液 相色谱紫外检测器定性定量检测。 试剂 除非另有说明,在分析中仅使用重蒸水。 3.1乙醇分析纯 3.2乙腈色谱纯 3.3提取液稀乙醇(乙醇546mL→1000mL) 3.4淫羊藿苷标准溶液准确称量淫羊藿苷标准品0.012g,加入甲醇溶解并定容至 25mL。此溶液每mL含0.48mg淫羊藿苷。 仪器
高效液相色谱仪:附紫外检测器(UV)。 超声波清洗器。

高效液相色谱法测定保健食品中的淫羊藿苷 HPLCdeterminationofIcariineinhealthfood
分析步骤
试样处理:
固体试样:取20粒以上胶囊、10g以上丸剂试样进行粉碎,混匀,根据样品含量,称取0.5g~ 2.5g试样(精确至0.001g),精密加入50mL稀乙醇,称重,超声提取60分钟,取出,放 冷至室温,用稀乙醇补重,过滤,取续滤液,经0.45μm膜过滤后供液相色谱分析用。 液体试样:取100mL以上液体试样,混匀,精密吸取50mL,减压浓缩至近干,用稀乙醇转移 至10mL量瓶中并稀释至刻度,摇匀。经0.45μm膜过滤后供液相色谱分析用。

液相色谱参考条件

5.2.1 5.2.2 5.2.3 5.2.4 5.2.5 5.2.6 5.2.7

色谱柱:C18柱,5μm,4.6×250mm。 柱温:20~35℃。 紫外检测器:检测波长270nm。 高效液相色谱流动相:乙腈-水(26:74)。 流速:1.0mL/min。 进样量:10~20?L。 色谱分析:取10~20?L试样溶液注入色谱仪中,以保留时间定性,以试样 峰面积通过标准曲线计算含量。

高效液相色谱法测定保健食品中的淫羊藿苷 HPLCdeterminationofIcariineinhealthfood

淫羊藿苷标准溶液色谱图

高效液相色谱法测定保健食品中的淫羊藿苷 HPLCdeterminationofIcariineinhealthfood
5.3标准曲线制备分别配制浓度为0.004836~1.0104mg/mL的淫羊藿苷标准溶液,在给定的 仪器条件下进行液相色谱分析,进样量10?L,以峰面积对进样量(?g)作标准曲线。
分析结果的表述

由y=a+bx得 [(yx-a)/b]×V1×10-3×100 X= M×V2 式中:X ——试样中淫羊藿苷的含量,g/100g; yx ——试样峰面积; V1 ——试样稀释倍数,mL; M ——试样质量,g; V2——样品进样量,μg。 5.4.2结果表示计算结果保留三位有效数字。 技术参数 准确度方法的回收率在95.0%~105.0%之间。 允许差平行样相对误差≤2%。

标准起草说明和方法学验证
1仪器及试药 1.1仪器 1.1.1高效液相色谱仪:附紫外检测器(UV)。 岛津2010液相色谱仪; AgiLent1100液相色谱仪; 岛津2010/SPD-M液相色谱仪。 1.1.2超声波清洗器。 1.2试剂 除非另有说明,在分析中仅使用重蒸水。纯净水为Milli-Q纯水系统二次制备。 1.2.1乙醇分析纯。 1.2.2乙腈色谱纯。 1.2.3稀乙醇(乙醇546mL→1000mL)。 1.3样品 1.3.1前烈立舒胶囊:澳美制药生产。 1.3.2中国劲酒:劲牌有限公司生产。 1.3.3海狗丸:深圳市宝和堂保健品有限公司出品。 1.4标准品:淫羊藿苷(批号:110737-200414,中国药品生物制品检定所提供)。

标准起草说明和方法学验证
2样品及处理 2.1固体试样:取10粒胶囊内容物,混匀,取约0.5g,精密 称定;或取10g丸剂,研细,混匀,取约2.5g,精密称定。 精密加入稀乙醇50mL,称重,超声处理60分钟,放冷至 室温,再称重,加稀乙醇补足减失的重量。滤过,取续 滤液,经0.45μm膜过滤后作为供试品溶液。 2.2液体试样:取100mL以上液体试样,混匀,精密吸取 50mL,减压浓缩至近干,用稀乙醇转移至10mL量瓶中并 稀释至刻度,摇匀。经0.45μm膜过滤后作为供试品溶液。

标准起草说明和方法学验证
3对照品 精密称取淫羊藿苷标准品12.33mg,臵25mL量 瓶中加甲醇溶解并稀释至刻度,作为标准 品溶液。

标准起草说明和方法学验证
4线性及范围 精密量取标准品溶液0.5mL,1mL、2mL,分别臵25mL量瓶 中,用甲醇稀释至刻度,摇匀。精密量取标准品溶液1 mL,2mL,3mL,5mL,10mL,分别臵10mL量瓶中,用 甲醇稀释至刻度,摇匀。按给定的色谱条件,分别精密 吸取稀释后的标准品溶液10μL,注入液相色谱仪,测 得峰面积积分值。以峰面积积分值为纵坐标,以淫羊藿 苷标准品进样量(?g)为横坐标,绘制标准曲线,计算 回归方程为: y=2.2260×106x-1.3159×104,r=0.9998 淫羊藿苷在0.09864~4.932μg范围内,进样量与峰面积积分 值呈良好的线性关系。(见附图1)

标准起草说明和方法学验证
12000000 10000000 8000000 峰面积 6000000 4000000 2000000 0 0 1 2 淫羊藿苷进样量(μ g) 3 4 5

进样量(μg) 0.09864 0.19728 0.39456 0.49326 0.9864 1.4796 2.466

峰面积积分值 216452 428011 850451 1207299 2141414 3235671 5387479 11020132

淫羊藿苷标准曲线

4.932

标准起草说明和方法学验证
5检测限和定量限 5.1检测限精密吸取标准品溶液(浓度为 0.009864mg/mL)1.0mL,臵100mL量瓶中, 加甲醇稀释至刻度,摇匀。按上述色谱条 件测定,进样量10μL。此浓度标准品的 峰高为相应噪音的峰高的3倍。故本方法 的检测限为0.9864×10-3μg。

标准起草说明和方法学验证

淫羊藿苷检测限色谱图

标准起草说明和方法学验证
5.2定量限精密吸取标准品溶液(浓度为 0.009864mg/mL)1.0mL,臵10mL量瓶中,加 甲醇稀释至刻度,摇匀。按上述色谱条件 测定,进样量10μL,连续进样5次,结果 见下表。故本方法的定量限为9.864×103μg。

标准起草说明和方法学验证
定量限测定结果 进样次数 1 2 3 4 5 峰面积积分 值 24556 24838 24044 24025 24597 24412 1.48% 平均值 RSD%

标准起草说明和方法学验证
16小时内稳定性试验结果

6稳定性 取同一供试品 溶液,按给定 色谱条件测定 16小时内淫羊 藿苷峰面积积 分值,数据见 表

小时 0 2 4 6 8 10 12 14 16

峰面积积分值 1195430 1171502 1171950 1190252 1164955 1192283 1181783 1189009 1178808

平均值

RSD%

1181775

0.90%

标准起草说明和方法学验证
重复性试验结果

7精密度 7.1重复性取本品 (批 号:QLS050107)12份 (低浓度3份,中 间浓度6份,高浓 度3份),按样品 溶液制备方法制 备,依给定色谱 条件测定含量

试验重复 次 数 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

取样量 (g) 0.2674 0.2494 0.2485 0.4998 0.5000 0.5030 0.5031 0.5038 0.5056 0.7503 0.7602 0.7510

含量 (g /10 0g) 1.0869 1.0745 1.0578 1.0409 1.0440 1.0456 1.0039 1.0419 1.0236 1.0474 1.0398 1.0399 1.0465 2.04% 平均值 RSD%

标准起草说明和方法学验证
仪器精密度试验结果

7.2仪器精密度取 同一供试品溶液, 按给定色谱条件重 复进样6次,测定峰 面积积分值

进样次数 1 2 3 4 5 6

峰面积积 分 值 2343692 2345240 2348346 2342514 2350773 2345878

平均

RSD%

2346074

0.13%

标准起草说明和方法学验证
7.3中间精密度 试验3人采用 3台不同的设备 对同一批 (QLS050107批) 样品按样品溶 液制备方法制 备,依给定色 谱条件测定含 量
中间精密度试验结果
测定仪器 测定结果 (g/100g) 1.06 1.07 1.42% 平均 RSD%

1

岛津2010液相色 谱仪 AgiLent 1100液 相色谱仪 岛津2010/SPD-M 液相色谱仪

2

1.09

3

1.06

标准起草说明和方法学验证
8回收率 分别精密吸取标准品溶液(精密称取淫羊藿苷 29.32mg臵100mL量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻 度,摇匀,即得。浓度:0.2932mg/mL)5.0、10.0、 15.0mL,臵100mL锥形瓶中,挥干溶剂,取本品 (批号:QLS050107)0.25g,共9份,按样品溶液制备 方法制备供试液,按给定色谱条件测定,计算回 收率 测得量-样品中含量 回收率%=×100% 对照品加入量

回收率试验结果
样品中含 量(mg) 2.6537 2.6537 2.6140 2.6140 2.6098 2.6098 2.7719 2.7719 2.6684 2.6684 2.6433 2.6433 2.6579 2.6579 2.6788 2.6788 2.6370 2.6370 4.3980 2.9320 1.4660 对照品加 入量(mg) 测得量 (mg) 4.1068 4.1338 4.0651 4.0913 4.0237 3.9941 5.6145 5.6821 5.5703 5.5801 5.4797 5.4834 6.8763 6.9409 6.8929 6.9009 6.9398 6.9422 回收率% 99.12% 100.96% 98.98% 100.77% 96.45% 94.43% 96.95% 99.26% 98.97% 99.31% 96.74% 96.87% 95.92% 97.39% 95.82% 96.00% 97.84% 97.89% 96.81% 98.02% 97.76% 0.87% 98.45% 平均值 总平均% RSD%

标准起草说明和方法学验证
9专属性 取未加入淫羊藿药材的空白对照样品0.5g,按 样品溶液制备方法制备。按给定色谱条件 进行测定,结果未检测出淫羊藿苷的色谱 峰

标准起草说明和方法学验证

专属性色谱图 (色谱图从下到上依次为溶剂、缺淫羊藿阴性、 淫羊藿苷对照品、样品)

标准起草说明和方法学验证
10耐用性 分别采用3根不同商品规格的色谱柱,对同一批 (QLS050107批)样品按试样溶液制备方法制备, 依给定测定条件测定含量
色谱柱规格 Phenomenx Gemini 5μ,C 110A, 18 250×4.6mm Agilent C,250×4.6mm
18

测定结果 平均 (g/100g) 1.07 1.06 1.06 1.06

RSD%

0.71%

HiQ Sil C18W,250×4.6mm, No.00W00169

标准起草说明和方法学验证
11不确定度 P±0.050P(k=2)

标准起草说明和方法学验证
12其他有关说明 采用已建立的方法,测定了不同配方、不同 剂型的保健食品中淫羊藿苷的含量。

标准起草说明和方法学验证
12.1中国劲酒中淫羊藿苷的含量测定 供试品溶液的制备精密量取本品50mL,减压浓缩至近干,用稀乙醇转 移至10mL量瓶中并稀释至刻度,摇匀,经0.45?m滤膜滤过,即得。 标准品溶液的制备精密称取淫羊藿苷标准品12.59mg,臵25mL量瓶中加 甲醇溶解并稀释至刻度,作为对照品溶液。 标准曲线的制备精密量取对照品溶液0.5mL,1mL,2mL,分别臵25mL量 瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀。精密量取对照品溶液1mL,2mL, 3mL,5mL,10mL,分别臵10mL量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀。 按给定的色谱条件,分别精密吸取稀释后的标准品溶液10μL,注入 液相色谱仪,测得峰面积积分值。以峰面积积分值为纵坐标,以淫羊 藿苷标准品进样量(?g)为横坐标,绘制标准曲线。 测定法精密吸取供试品溶液10μL,注入液相色谱仪,记录峰面积积分 值,通过标准曲线计算供试品溶液中淫羊藿苷的含量。

标准起草说明和方法学验证
12.2海狗丸中淫羊藿苷的含量测定 供试品溶液的制备取本品适量,研细,混匀,精 密称取2.5g,精密加入稀乙醇50mL,摇匀,称 重,超声处理60分钟,放冷至室温,用稀乙醇 补足减失的重量,滤过,取续滤液,经0.45?m 滤膜滤过,即得。 标准品溶液的制备、标准曲线的制备同“中国劲酒 中淫羊藿苷的含量测定”项下。 测定法精密吸取供试品溶液20μL,注入液相色谱 仪,记录峰面积积分值,通过标准曲线计算供 试品溶液中淫羊藿苷的含量。

标准起草说明和方法学验证

样品测定结果
试样名称 中国劲酒 海狗丸 含量
-4

RSD% 0.54% 0.75%

2.40×10 g /100mL 1.28×10 g/100g
-2

标准起草说明和方法学验证

其他保健食品色谱图 (1-中国劲酒;2-海狗丸;3-淫羊藿苷对照品)

保健食品功效成分检测实例分析
实例2 HPLC-DAD-MS法同时测定保健食品中六种大 豆异黄酮类成分的含量

天然药物及保健食品概况
一.天然药物的特点
? 来源广泛 ? 成分复杂多样 ? 功效成分不唯一 ? 质量控制和评价难度大

天然药物及保健食品概况
二、保健食品的特点
? 概念 ? 来源
? 食品、药食同源、维生素、矿物质

? 质量和安全性问题
? 标准 ? 功效成分不明确 ? 违法添加严重 ? 外源性有害残留物控制

? 稳定性、可控性检测
? 一致性 ? 均一性

天然药物及保健食品概况
三、天然药物及保健食品分析检测的发 展趋势
?功效性检测 ?安全性检测
?多组分、多成分、多指标、常量、微量、 代谢产物 ?外源性有害残留物检测 ?内源性有毒物质的检测 ?一致性 ?均一性

?稳定性、可控性检测

色谱质谱技术在天然药物 和保健食品分析中的应用
一.功效成分检测(常量、微量) 二.安全性检测(有害残留、有毒成分) 三.稳定性和可控性(指纹图谱技术)
HPLC-DAD-MS在天然药物和保健食 品分析中的应用介绍

大豆异黄酮类成分概况
1. 功效和用途:大豆异黄酮作为天然的植物雌激素,具有 明显的缓解更年期综合症和抗骨质疏松症的功效,同时 又有延缓衰老以及预防心血管疾病,降低乳腺癌、前列 腺癌等疾病的发病率等多种功效,近年来引起国内外广 泛的关注和研究。 2. 市场概况:我国市场上有关大豆异黄酮类成分的中药、 天然药物、植物提取物、保健食品(进口、国产)名目 繁多,质量参差不齐。 3. 标准概况:目前只控制1-2种成分

大豆异黄酮类成分概况
R1 O

R2

中文名称
大豆苷元 大豆苷 染料木素 染料木苷 黄豆黄素 黄豆黄苷

英文名称
Daidzein Daidzin Genistein Genistin Glycitein Glycitin

R3

OH

R1
OH O-Glu OH O-Glu OH O-Glu

R2
H H H H OCH3 OCH3

R3
H H OH OH H H

大豆异黄酮类成分概况
1. 目前大豆异黄酮类成分常见的分析方法: ? 紫外分光光度法 ? 薄层扫描法 ? 高效液相色谱法 2. 这些方法在准确性、合理性、可操作性等方面 均有欠缺,大多数方法只报道了测定其中1~2 个成分的含量,不能较为全面地反应产品的真 实质量。

标准现状
S1

S2

S3 S4

1.多成分同时测定?
?对照品

?检测成本

2.单成分同时测定多成分

常规的HPLC法用于多成分分析
1、大豆苷 2、黄豆黄苷 3、染料木苷 4、大豆苷元 5、黄豆黄素 6、染料木素
12 3 4 5 6

色谱条件
液相色谱仪:Waters Alliance2690高效液相色谱仪 色谱柱:Agilent zorbax SB-C18(4.6×150mm,5μm) 柱温:25℃ 流动相:0.2%甲酸-乙腈(梯度) 流速:1 ml/min 检测波长:DAD

流动相梯度表
时间 0min 18min 25min 43min 45min 0.2%甲酸(%) 90 78 78 70 50 乙腈(%) 10 22 22 30 50

样品测定
CRS S3

S1

S4

S2

S5

HPLC-DAD-MS法

用于多成分同时测定
A B

用一个对照品同时测定多个成分 ——校正因子法

校正因子(以染料木素计)
化合物
染料木甙

浓度(mg/ml)
0.204 0.408 0.816 1.632 2.04 3.06 0.15 0.3

校正因子 平均校正因子 RSD(%)
1.35 1.38 1.42 1.39 1.35 1.42 2.18 2.05 2.20 2.08 2.14 2.07 1.67 1.62 1.69 1.64 1.66 1.66

1.39

2.27

黄豆黄甙

0.6 1.2 1.5 2.25 0.0256 0.0512

2.12

2.94

黄豆黄素

0.1024 0.2048 0.256 0.384

1.66

1.46

计算因子(以染料木素计)
化合物 大豆甙 浓度(mg/ml)
0.21 0.42 0.84 1.68 2.1 3.15 0.076 0.152

校正因子 平均校正因子 RSD(%)
1.98 1.92 1.88 1.94 1.99 1.92 1.21 1.26 1.17 1.23 1.18 1.2

1.94

2.13

大豆甙元

0.304 0.608 0.76 1.14

1.21

2.93

两种方法测定结果比较
中文名称 大豆苷 黄豆黄苷 染料木苷 大豆苷元 黄豆黄素 染料木素 常规法
含量(%) 0.30 0.07 0.62 0.86 0.06 0.47 RSD ( %) 1.08 1.83 1.26 1.63 1.96 1.28 0.32 0.05 0.61 0.89 0.08 0.46

替代法
含量(%) RSD ( %) 1.65 1.79 1.05 1.22 1.92 1.51

以单成分为对照同时测定多成分时, 最大的困难——被测成分的识别???
A C D F B E

HPLC-DAD-MS 法
MIX-CRS-7212
Mix-standard-7212 6: Diode Array
36.57

用于多成分同时测定
280 Range: 9.468e-2
9.62 14.47 10.58 23.20

8.0e-2

6.0e-2 AU

4.0e-2

25.45

2.0e-2
1.65

0.0 0.00 2.50 Mix-standard-7212 4: SIR of 6 Channels ES+ 5.00 7.50 10.00 12.50 15.00 17.50 20.00 22.50 25.00 27.50 30.00 32.50 35.00 37.50 40.00

23.35

TIC 3.36e5

90
25.50

%

36.53 9.63 10.71 14.47

-10 0.00

2.50

5.00

7.50

10.00

12.50

15.00

17.50

20.00

22.50

25.00

27.50

30.00

32.50

Time 35.00 37.50

40.00

HPLC-DAD-MS提供的信息
MIX-CRS-7201
Mix-standard-7201 2214 (37.010)
260.4

MIX-CRS-7201 6: Diode Array 2.658e-1
Mix-standard-7201 165 (37.065) 3: SIR of 6 Channels ES+ 100 271.0 8.85e4

2.0e-1 0.0 Mix-standard-7201 1544 (25.843) 6: Diode Array

0 Mix-standard-7201 116 (26.026) 3: SIR of 6 Channels ES+ 256.4

7.325e-2
320.4

100

285.0

6.61e4

5.0e-2 0.0

0

Mix-standard-7201 1408 (23.577)

6: Diode Array

Mix-standard-7201 104 (23.322) 3: SIR of 6 Channels ES+

249.4

1.221e-1
302.4

100

255.0

1.61e3

1.0e-1 0.0 Mix-standard-7201 878 (14.743) 6: Diode Array
285.0 0 Mix-standard-7201 66 (14.761) 3: SIR of 6 Channels ES+ 260.4 417.0 433.0 447.0

1.643e-1

100

271.0 433.0

2.64e4

1.0e-1 0.0 Mix-standard-7201 644 (10.843) 6: Diode Array
0 Mix-standard-7201 49 (10.931) 3: SIR of 6 Channels ES+ 258.4

8.63e-2
321.4

100

285.0

4.84e4

5.0e-2 0.0 Mix-standard-7201 587 (9.893)

447.0 0

6: Diode Array

Mix-standard-7201 44 (9.805) 3: SIR of 6 Channels ES+

250.4

1.345e-1

100

255.0 417.0

1.53e4

1.0e-1

0.0 250 300 350

nm 400

0 m/z 100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 525 550 575 600 625 650 675 700 725 750 775 800

AU

AU

AU

AU

AU

AU

%

%

%

%

%

%

HPLC-DAD-MS提供的信息
中文名称
大豆苷元 大豆苷 染料木素 染料木苷 黄豆黄素 黄豆黄苷

分子量 保留时间 UV光谱
254 416 270 432 284 446 26.1 10.6 41.3 15.9 28.2 11.7 218,249,302 218,251 223,260 218,260 218,254,320 218,258,320

HPLC-DAD-MS条件
液相色谱条件:
液相色谱仪:Waters Alliance 2690高效液相色谱仪 色谱柱:Agilent zorbax SB-C18(4.6×150mm,5μm) 柱温: 25℃ 流动相:0.2%甲酸-乙腈(梯度) 流速:1 ml/min(DAD); 0.2ml/min(质谱检测器)

质谱条件:
Waters micromass ZQ液质联用仪,ESI正离子检测:毛细管 电压3.0 KV,锥孔电压40v,源温度120℃,去溶剂温度150℃。 去溶剂气(N2)流速:300L/hr.离子扫描范围:100-700 m/z; 选定m/z 255, 271, 285, 417,433和447进行选择性离子扫描 (SIM)

HPLC-DAD-MS法

用于多成分同时测定
SAMPLE-7201
sample1-7201 5: Diode Array 9.66 Range: 1.35e+2 8.0e+1

6.0e+1 AU

4.0e+1

10.61 14.44

2.0e+1

1.61 2.02 4.31 8.82 19.16 20.06 7.50 10.00 12.50 15.00 17.50 23.04 25.26 20.00 22.50 25.00 27.50 30.00 32.50 35.00 37.50

0.0 0.00 40.00 sample1-7201 2: SIR of 6 Channels ES+ 9.67 TIC 7.66e4 2.50 5.00

23.21 % 10.70

19.27 14.47

25.27

8.98

26.64 36.25 20.13 29.04

1 0.00 40.00

Time 2.50 5.00 7.50 10.00 12.50 15.00 17.50 20.00 22.50 25.00 27.50 30.00 32.50 35.00 37.50

常规方法 HPLC-DAD 计算因子 HPLC-DAD-MS 对照品替代法

应用范围
1. 该法要求被测的每种成分均在其分析测 定的线性范围内。 2. 该法尤其适用于化学和物理性质相似成 分的分析(如黄酮类、皂苷类等)。 3. 对特定品种、特定提取物、或特定工艺 产品的常规例行检测有较大的优势。 4. 进一步验证工作(耐用性考察,如仪器、 色谱柱类型、流动相比例、柱温、PH等)

优势
1. 简便、快速、高效 2. 经济实用 3. 改善目前部分对照品严重缺乏的局面 4. 新的质量控制和评价思路 尤其适合于天然药物和保健食品等多功效成分的 复杂体系

扩展应用 ——胆酸类成分测定(HPLC-ELSD)
400.00

1
300.00

2

3 6 7 8

mV

200.00

4 5

100.00

0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 Minutes 35.00 40.00 45.00 50.00

1、牛黄熊去氧胆酸 2、牛黄胆酸钠 3、牛黄鹅去氧胆酸 4、熊去氧胆酸 5、猪去氧胆酸 6、胆酸 7、鹅去氧胆酸 8、去氧胆酸

扩展应用 ——低聚糖类成分测定(HPLC-RID)
20.00 18.00

16.00

1
5.335

3 2
6.224 8.005

14.00

12.00

10.00 MV

4 5
8.915 9.780

8.00

6
13.439

6.00

4.00

2.00

0.00

-2.00 0.00 10.00 20.00

2.203

2.00 12.00

4.00 14.00 分钟 16.00

6.00 18.00

8.00

1、蔗糖(Sucrose)2、蔗果三糖(kestose)3、棉籽糖 (Raffinose)4、蔗果四糖(Nystose)5、蔗果五糖 (Fructofranosylnystose)6、水苏糖(Stachyose)

扩展应用 ——PUFAs(ω3)类成分测定(HPLC-ELSD)
1200.00 1000.00

1
800.00 mV 600.00

2
400.00

3

200.00

0.00 0.00 24.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 分钟 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00

1、二十碳五烯酸(EPA) 2、二十二碳六烯酸(DHA) 3、二十二碳五烯酸(DPA)

扩展应用 ——马兜铃酸类成分测定(HPLC-DAD-MS)
T o ta l 4 : D io d e A r r a y 100 2 6 .2 3 5 3 .3 6

1

5

254 9 .6 5 e 5

1

2
2
3 2 .0 3

5 4
4
4 7 .5 8

6
5 7 .5 0

%

3

3

3 3 .1 6

2 .1 1

-3 0 .0 0 4 5 .0 0

T im e 5 .0 0 5 0 .0 0 1 0 .0 0 5 5 .0 0 1 5 .0 0 6 0 .0 0 2 0 .0 0 2 5 .0 0 3 0 .0 0 3 5 .0 0 4 0 .0 0

1、马兜铃酸C 4、马兜铃酸B

2、7-羟基马兜铃酸A 5、马兜铃酸A

3、马兜铃酸D

6、去硝基马兜铃酸A

实例3 RP-HPLC-RID法同时测定 保健食品中6种常见低聚糖的含量

提纲
一.低聚糖的概况 二.测定方法研究 三.总结与讨论

一、低聚糖概况
1. 低聚糖(Oligosaccharide)或称寡糖,是由2~10个单糖通过糖苷 键连接形成直链或支链的低度聚合糖,分功能性低聚糖和 普通低聚糖两大类。 2. 普通低聚糖:蔗糖、乳糖、麦芽糖、麦芽三糖和麦芽四糖 等属于普通低聚糖,它们可被机体消化吸收,不是肠道有 益细菌双歧杆菌的增殖因子。 3. 功能性低聚糖:包括水苏糖、棉子糖、异麦芽酮糖、乳酮 糖、低聚果糖、低聚木糖、低聚半乳糖、低聚乳果糖、低 聚异麦芽糖、低聚异麦芽酮糖和低聚龙胆糖等。人体肠胃 道内没有水解这些低聚糖(除异麦芽酮糖之外)的酶系统,因 此它们不被消化吸收而直接进入大肠内优先为双歧杆菌所 利用,是双歧杆菌的增殖因子

低聚糖概况
1. 1999年我国公布的 “功能性低聚糖通用技术规 则行业标准”对功能性低聚糖的定义为:
(1)功能性低聚糖(functionaloligosaccharide)是由2~ 10个相同或不同的单糖,以糖苷键聚合而成; (2)具有糖类某些共同的特性,可直接代替糖料作为 甜食品配料,但不被人体胃酸、胃酶降解,不在小 肠吸收,可到达大肠部; (3)具有促进人体双岐杆菌的增殖等生理功能。

2. 保健食品中常见的功能性低聚糖有大豆低聚糖、 低聚果糖、低聚异麦芽糖、低聚半乳糖、低聚 木糖、低聚乳果糖、乳酮糖、黑曲霉低聚糖等

低聚糖的功能和保健作用
(1)促进双岐杆菌增殖,调整肠道功能。 健康人的肠内栖息着大量的双岐杆菌,由于双岐杆菌可制造出乙酸和乳 酸,所以肠内的酸碱度(PH值)偏向强酸性,这样可以抑制病原菌的繁 殖,防止人体受到感染。故双岐杆菌是典型的有益菌群(俗称长寿菌), 但其菌落数会随年龄增大而逐渐减少。而摄入低聚糖可促使双岐杆菌 增殖。有研究表明:每天摄入10克低聚糖,连续服用10~15天,肠道内 的双岐杆菌活菌数可增加40倍。目前广谱和强力的抗菌素广泛用于各 种疾病的治疗,但它们在杀死病菌的同时,也使人体肠道内正常的菌群 受到不同程度的破坏。因此有目的增加肠道中有益菌的数量显得十分 必要。摄取功能性低聚糖来促使肠道内双岐杆菌自然增殖显得更切实 可行。

低聚糖的功能和保健作用
(2)低能量 低聚糖很难或不被人体消化吸收,所提供的能量值很低或根本 没有,可最大限度地满足那些喜爱甜食及担心发胖者的要求,还 可供糖尿病人、肥胖病人和低血糖病人食用。 (3)膳食纤维功能 低聚糖属于水溶性膳食纤维,具有膳食纤维的部分生理功能,比 如有降低血清胆固醇的作用,还能促进肠道废物的排泄,有预防 结肠癌的作用。

低聚糖的功能和保健作用
(4)预防龋齿 低聚糖不会引起牙齿龋变,因龋齿是由于口腔微生物特别是突 变链球菌侵蚀而引起的,然而低聚糖并不是这些口腔微生物 的合适作用的营养底物,因此不会引起牙齿龋变,有利于保 持口腔卫生。 (5)促进生成营养物质: 由于双岐杆菌在肠道内能自然合成微生素B1、B2、B6、B12、 烟酸和乙酸。而低聚糖能活化双岐杆菌,使其合成营养素的 能力增强。 (6)其他功能:降血脂、降血压、预防骨质疏松等。

低聚糖的功能和保健作用
1. 自然界含量少: ?自然界中仅有少数几种植物含有天然的功能性低聚糖, 例如洋葱、大蒜、天门冬、菊苣根等含有低聚果糖, 大豆中含有大豆低聚糖。 2. 需要补充: ? 从一般膳食习惯上看,每天摄取的低聚糖往往很难达 到推荐量标准。因此,对于婴幼儿、老人和工作压力 大的人,从膳食以外适当补充一些低聚糖,对于人体健 康尤其是消化系统的健康是非常有益的

2003年日本低聚糖保健食品市场分布概况(共54亿美元)
2% 1.60% 2.10% 14.20%

改善肠道功能

4.90%

控制体重 调节血糖 防龋齿 骨健康

11.20%

64%

调节血压 调节胆固醇

我国常见的对低聚糖
1. 我国对低聚糖的研究始于上世纪80年代,但形成工业规 模和商品化则在80年代默契。 2. 主要品种有低聚果糖、大豆低聚糖、低聚木糖、低聚异 麦芽糖、低聚甘露糖 3. 我国卫生部批准的具有改善肠道润肠通便功能的保健食 品中使用的低聚糖有低聚果糖、大豆低聚糖、低聚异麦 芽糖、低聚甘露糖等。

大豆低聚糖
1. 大豆低聚糖是大豆中所含的寡糖类物质的总称,主要包括蔗糖、 棉子糖、水苏糖等。其中棉子糖和水苏糖被称为大豆低聚糖的 主要功效成分。 2. 大豆低聚糖的生理作用主要是促进双歧杆菌的增殖,从而起到 调节肠道菌群平衡的作用。 3. 同时大豆低聚糖还具有抑制病原菌、防止便秘、腹泻、保护肝 脏功能、降低血清胆固醇、降低血压、增强免疫功能、抗癌作 用等多种生理功能, 4. 另外,大豆低聚糖对糖尿病人可作为糖的替代品。所以,大豆 低聚糖类成分在近20年来逐渐引起国内外广泛的关注和研究, 并迅速发展成为一种新型的保健食品。

低聚果糖
低聚果糖(fructooligosaccharides,FOS)是以蔗糖为原料经微生物 酶作用而制得的由葡萄糖和果糖组成的杂低聚糖混合 物,包括蔗果三糖(GF2)、蔗果四糖(GF3)、蔗果五糖 (GF4)、蔗果六糖(GF5)等低聚糖。低聚果糖浆类似水溶 纤维,能促进小肠蠕动,加快粪便排泄,清除肠内有害 物,预防和减轻便秘。目前,低聚果糖已被许多批准为 食物配料。我国卫生部已经批准低聚果糖为具有改善肠 道和润肠通便功能的保健食品原料。

低聚果糖

低聚果糖
低聚果糖(Fructooligosaccharides,简称FOS)是指1-4个果糖基 以β-(2→1)糖苷糖连接在蔗糖的D-果糖基上而形成的 蔗果三糖(GF2)、蔗果四糖(GF3)、蔗果五糖(GF4) 和蔗果六糖(GF5)的混合物。产品中低聚果糖总含量 是指蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖和蔗果六糖占干物 质的百分含量,其中,蔗果六糖含量不得超过FOS总含 量的5%,超过部分不计。FOS总含量大于等于50%的产 品称为普通型低聚果糖(G型),总含量大于等于90% 的产品称为高纯度低聚果糖(P型)。

低聚果糖和大豆低聚糖的主要成分
中文名称 英文名称 蔗果三糖 kestose 蔗果四糖 nystose, 蔗果五糖 fructofranosylnystose 蔗糖 棉籽糖 水苏糖 sucrose kestose raffinose 结构特点 G-F2 G-F3 G-F4 G-F1 G-F-Ga1 G-F-Ga2

二、测定方法研究
1. 目前低聚果糖和大豆低聚糖类成分常见的分析方法: ? 紫外分光光度法 ? 高效液相色谱法 2. 这些方法在准确性、合理性、可操作性等方面均有欠 缺,大多数方法只报道了测定其中1~2个成分的含量, 不能较为全面地反应产品的真实质量。

研究目标
1. 建立多成分同时测定低聚果糖和大豆低聚 糖类成分的分析方法 2. HPLC-RID法 3. 蔗糖、蔗果三糖、棉籽糖、蔗果四糖、蔗 果五糖、水苏糖共六种成分

HPLC-RID法用于6种成分的测定

1、蔗糖 2、蔗果三糖 3、棉籽糖 4、蔗果四糖 5、蔗果五糖 6、水苏糖

色谱条件
1仪器与试剂 Waters515高效液相色谱仪,2414视差折光检测器。 蔗糖、蔗果三糖、棉籽糖、蔗果四糖、蔗果五糖、水苏糖 对照品均购自北京禾境科技发展中心。实验所用乙腈为色 谱纯,其他溶剂为分析纯,水为纯净水,过Millipore 0.22μm滤膜。含大豆低聚糖保健食品样品共4个品种均为 市售。 2色谱条件 色谱柱AgilentzorbaxNH2(4.6 mm×150mm,5μm),柱温25℃;流速1.2mL· min-1;流动 相由流动相水-乙腈(30:70)等度进行洗脱,视差折光检 测器内部温度设为35℃;理论塔板数按蔗糖计算不低于 2000。

方法
3溶液的制备 3.1对照品溶液分别精密称取蔗糖、蔗果三糖、棉籽糖、蔗 果四糖、蔗果五糖、水苏糖对照品适量,加流动相溶液 分别配制成蔗糖为1.19mg· mL-1、蔗果三糖为1.13mg· mL-1、 棉子糖1.02mg· mL-1、蔗果四糖1.08mg· mL-1、蔗果五糖 1.05mg· mL-1、水苏糖1.12mg· mL-1的溶液,作为对照品溶 液。 3.2供试品溶液分别精密秤取样品(市售大豆低聚糖类保健 食品,多为粘稠液体)0.5g于25ml的容量瓶中,用流动 相溶液定容,充分摇匀,过0.45μm的微孔滤膜,作为供 试品溶液。

方法
4方法与结果 4.1线性关系考察分别吸取对照品溶液2.0,4.0, 8.0,10.0,15.0,20.0μL,注入液相色谱仪,测 定峰面积。以峰面积为纵坐标,浓度为横坐 标,计算其回归方程,见表1。结果表明蔗糖在 2.38~23.8μg、蔗果三糖在2.26~22.6μg、棉子 糖在2.04~20.4μg、蔗果四糖在2.16~21.6μg、 蔗果五糖在2.10~21.0μg、水苏糖在2.24~ 22.4μg范围内线性关系良好。

6种低聚糖的线性关系
成分 蔗糖 蔗果三糖 棉子糖 蔗果四糖 蔗果五糖 水苏糖 回归方程 r 0.9995 0.9993 0.9994 0.9997 0.9991 0.9992

Y=1.025×1052-1.485×10 X Y=1.043×1052-1.143×10 X Y=1.232×1052-1.621×10 X Y=1.232×1052-1.092×10 X Y=1.318×1052-2.127×10 X Y=1.357×1052-2.305×10 X

20.00

18.00

16.00

1
5.335

3 2
6.224 8.005

14.00

12.00

10.00

4.00

2.00

0.00

-2.00 0.00 8.00 16.00 35.00

2.203

2.00 10.00 18.00 分钟

13.439

6.00

8.915

A

MV

4 5
9.780

6

8.00

对照品

4.00 12.00 20.00 14.00

6.00

30.00

6.228

25.00

20.00 MV

10.00

8.925

9.796

B

5.335

8.016

15.00

样品
13.452
4.00 6.00

5.00

0.00 0.00 2.00

8.00

2.125

10.00

7.575

12.00

14.00

16.00

18.00 分钟

20.00

1、蔗糖(Sucrose) 2、蔗果三糖(kestose) 3、棉籽糖(Raffinose) 4、蔗果四糖(Nystose) 5、蔗果五糖(Fructofranosylnystose) 6、水苏糖(Stachyose)

方法
4.2 稳定性试验精密吸取供试品溶液10μL,每隔2h.进样一次,共6 次,测定峰面积,结果蔗糖、蔗果三糖、棉子糖、蔗果四糖、蔗 果五糖、水苏糖的RSD分别为0.99%,0.96%,1.21%,1.22%, 0.97%,0.87%,表明12h内测定结果稳定。 4.3精密度实验分别精密吸取对照品溶液10μL,注入液相色谱仪,测 定峰面积,结果蔗糖、蔗果三糖、棉子糖、蔗果四糖、蔗果五糖、 水苏糖的RSD分别为(n=5)0.93%,0.98%,1.11%,1.01%, 1.54%,1.03%,表明仪器精密度良好。 4.4最低检测限和定量限以信噪比3:1为标准测得蔗糖、蔗果三糖、棉 子糖、蔗果四糖、蔗果五糖、水苏糖的最低检测限分别为0.91, 0.52,0.88,0.61,0.73μg,0.93μg。以信噪比10:1时的进样量作 为定量限,测得蔗糖、蔗果三糖、棉子糖、蔗果四糖、蔗果五糖、 水苏糖的定量限分别为2.73,1.73,2.64,2.03,2.43μg,2.79μg。

方法
4.5重复性实验取同一样品5份,按样品处理方法平行提取并同法测定6种 成分的含量。结果蔗糖、蔗果三糖、棉子糖、蔗果四糖、蔗果五糖、 水苏糖的RSD分别为1.25%,1.21%,0.96%,0.93%,1.33%,1.14%,表明 本法重复性良好。 4.6回收率试验采用加样回收率实验方法。分别精密秤取已知含量的1号 样品0.25g共9份,每3份1组,按高、中、低3个水平分别精密加入一 定量对照品(相当于样品中各成分含有量的80%,100%,120%), 按“3.2”供试品溶液制备项下操作,结果6种成分的回收率分别为蔗糖 96.38%(RSD0.97%),蔗果三糖96.32%(RSD0.94%),棉子糖 97.52%(RSD1.13%),蔗果四糖96.98%(RSD1.22%),蔗果五糖 95.67%(RSD1.08%),水苏糖97.40%(RSD1.53%)。结果表明,以 本法同时测定低聚糖中6种成分,其回收率结果良好。 4.7样品测定按“3.2”项下方法制备样品溶液并测定,4个品种低聚糖类保 健食品(样品均为市售含低聚糖类产品不同生产企业的产品,分别 编号1,2,3,4)样品的测定结果见表2。

不同样品中6种低聚糖成分的含量(%)
样品编号 蔗糖 蔗果三糖 棉子糖 蔗果四糖 蔗果五糖 水苏糖

1 2 3 4

6.27 8.22 5.36 7.34

9.13 7.02 7.28 8.72

7.81 5.04 4.32 6.88

2.28 2.69 3.32 1.02

4.11 5.23 3.98 4.09

2.37 4.09 3.37 2.89

总结与讨论
1、低聚糖属于寡糖,其极性很强,用一般的反相 色谱柱很难实现6种分子量相近成分的分离,因 此选用氨基柱,达到了很好的分离效果。经试 验研究后认为采用流动相为乙晴-水(70:30), 柱温25℃,流速为1.2ml· min-1既可使低聚糖成分 与其他可溶性糖进行有效分离,又可使保留时间 缩短,一般一个样品可在20min内完成。

总结与讨论
2、视差折光检测器(RID)
?考虑到寡糖的特性和分析检测的灵敏度及准确度, 本实验使用视差折光检测器,经试验发现,检测器 内部温度设为35℃较适宜。 ?但RID对温度、压力、流量等物理性变化较敏感,另 外,使用RID时不宜梯度洗脱。

总结与讨论
5.3本实验旨在研究建立含低聚 糖成分的保健食品功效成分 的含量测定方法,以制定该 类产品的质量标准。从测定 结果可以看出不同企业生产 的同类产品6种低聚糖成分的 含量差别很大,因此反映出 目前市场上该类产品的质量 良莠不齐的现状。另外,含 量测定方法学实验结果表 明,本法操作简单,测定结 果准确,具有良好的重复 性,可用于含低聚糖类成分 保健食品的质量控制。
4种含低聚糖样品中6种成分的含量情况 35 30 25 20 % 15 10 5 0 样品4 样品3 样品2 样品1

成分

四、保健食品功效成分检测其它有关问题
1、样品的前处理 2、标准物质、标准溶液、基准物质 3、检验结果和结论的表达

1、样品的前处理
1. 样品的制备和对样品中待测测组分进行提取、 净化、浓缩的过程。样品处理是保健食品分析 检测过程的重要环节,约占分析检测时间的60%。 要开发一个新的检测方法,主要的工作在样品 前处理上。 2. 目的:消除基质干扰、保护仪器、提高方法的 准确度、精密度、选择性和灵敏度 3. 方法:
?加入隐蔽剂,如加入柠檬酸铵、氰化钾、EDTA等金 属络合剂,使样品中可能存在的金属离子不再与显 色剂作用,起到隐蔽杂质的作用。 ?预处理,分离纯化

常用的样品前处理方法
1. 传统的样品处理方法:
? ? ? ? ? ? ? 挥发法:汞、氰化物的测定 沉淀法:硫酸盐的含量、除蛋白 蒸馏法:挥发性成分 吸附法:硅胶、聚酰胺、硅藻土、氧化铝、大孔吸附树脂等 透析法:透析膜;除去高分子杂质如蛋白质、柔质、树脂等 提取法:浸取、索氏提取、萃取等 有机质破坏法:金属和部分非金属元素,
? 干法:高温,易挥发,不适合易挥发的金属元素如砷、汞、锑等 ? 湿法:强酸、氧化 ? 均需做空白试验

2. 特点:自动化程度低、效率低、成本高、劳动强度大、 环境污染大,但由于设备简单易得,仍在使用。

样品前处理新技术
1.20世纪末,现代科学技术和仪器分析技术 的发展推动了样品处理新技术的发展。 2.新技术的特点:自动化程度高、速度快、 效率高、成本低、劳动强度小、环境污染 小,有利于人员健康和环境保、且方法准 确可靠。

样品前处理新技术
1.凝胶色谱(GPC) 2.固相萃取(SPE) 3.固相微萃取(SPME) 4.加速溶剂提取(ASE) 5.超临界萃取(SFE)

凝胶渗透色谱(GPC)
1.凝胶渗透色谱(gelpermeationchromatography, GPC) 2.原理:利用多孔性物质按照分子体积大小 进行分离。 3.特点:柱子可重复使用,适用样品范围 广,包括对油脂的净化,多用于农残的测 定和高聚物分子量分布的测定。

固相萃取(SPE)
1. 固相萃取(SPE,solidphaseextraction) 2. 固定相(固体)吸附样品溶液中的目标成分, 与样品中基质和干扰物分离,然后用洗脱液洗 脱或加热解吸附。达到分离和富集目标成分的 目的 3. 特点:液体样品,与液-液萃取相比,不乳化、 减少溶剂用量、高效省时、选择性好 4. 固定相的选择:根据目标成分的性质、选择性、 吸附可逆性 5. 应用:生物样品中的药物分析、食品、动植物 样品中农药、兽药及其它污染物的分析。

固相微萃取(SPME)
1. 固相微萃取技术(SPME,solid-phasemicroextraction):
?原理:根据有机物与溶剂之间相似相溶的原理,利用 石英纤维表面的色谱固定相对分析组分的吸附作用, 将组分从试样基质中萃取出来,并逐渐富集,完成试 样前处理过程。在进样过程中,利用高温载气(GC) 或流动相(HPLC、HPCE)将吸附的组分解吸下来, 由色谱仪来进行分析。食品农残分析常用。 ?简单、经济、易于自动化的方法,目前较为常用,多 用于挥发、半挥发性物质的测定,如顶空萃取。

加速溶剂提取(ASE)
1. 加速溶剂提取(ASE,acceleratesolventextraction)
2. 高温(50-200度)、高压(10-20MPa)下用有机溶剂萃 取的自动化方法。 3. 特点:快速、回收率高、溶剂用量少(1g样品仅需1.5ml 溶剂)、选择性好、处理固体和半固体样品,仪器昂 贵, 4. 应用:EPA推荐方法农残测定、环境、药物分析

超临界提取技术(SFE)
超临界提取技术有以下几个特点: (1)提取温度低,蒸发温度也低,可有效地保护 易氧化成分或易挥发成分; (2)保持二氧化碳液体须施加较大压力,因此溶 媒可被压入细胞内,因而提取完全; (3)二氧化碳蒸发后继续液化使用,因而损失很 少; (4)二氧化碳无毒副作用、又不易残存在提取物 中,这是其他有机溶媒不可比拟的优点。

2、标准物质、标准溶液、基准物质
1. 标准物质的要求:稳定性、均匀性、准确性 2. 选择标准物质原则:
?选择与待测样品基质相同或相近的标准物质 ?标准物质的量值及准确度水平 ?稳定性、均匀性 ?明确标准物质证书,使用方法、贮存方法、不确定 度等

标准品、标准溶液、基准物质
1.来源 2.纯度 3.有效期

3、检验结果和结论的表达
1、功效成分测定结果,单位通常为:
g/100g,g/100ml

2、如果未检出,需指明检出限 3、有效数字和数据处理


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