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[精品]蛋白可溶表达与纯化的详细实验过程


2011 精品 蛋白可溶表达与纯化的详细实验过程 丁香园 chrispp 作品。 作品。 一、证明目的蛋白有表达 1、挑取一单菌落接种于含氨苄(Amp,终浓度为 100g/mL)的 3mL 液体 LB 培养基中 37℃,250rpm 培养 过夜。 2、将过夜培养菌液以 1:100 转接于含上述抗生素的 100mL 液体 LB 中,37℃,250rpm,3.5h(大量培养 至 OD600=0.6 左右)。 3、取出 1 mL 菌液为未诱导的电泳对照,剩余培养液加入诱导物 IPTG 至终浓度为 1 mmol/L,继续振荡培 养 4h。 4、以未诱导菌液与 IPTG 诱导后菌 液作对比,SDS-PAGE 检测。 结果如下:图 1

1: pET-32aA3 未诱导,2: pET-32aA3 未诱导,3: pET-32aA3 诱导后,4: pET-32aA3 诱导后 二、表达的情况,是可溶还是沉淀 1、将上述的 37℃诱导菌液离心(4℃,12000g,5min),弃 上清(LB 培养液),沉淀重悬于 0.9% NaCl 溶液洗菌。 2、将重悬于 0.9% NaCl 的菌体溶液离心(4℃,12000g,5min),弃上清(0.9% NaCl 洗菌液),得菌 体,称菌体重量,重悬于 8mL PBS(pH 7.0)缓冲液,缓冲液用量根据 50~100mg/mL 的菌液终浓度。 3、超声破菌:冰浴条件下,超声波破碎大肠杆菌,超声设置如下 功率:400W, 工作:15s, 间隔:45s, 全程时间:30min(30 次左右)以菌液由白变透明,且不粘稠 为依据 (少量菌液用液氮反复冻融 7 次以上效果也不错, 而且简单, 但是 DNA 出来后会粘稠, 可能加 dna 酶后会好些,那样好离心,我是用接近最高转速离心的(没加 dan 酶),不然分不开) 4、将超声波破碎的菌液离心 (4℃,12000g,15min),分别收集上清和沉淀,各取 1mL,加入 1mL 2× 上样缓冲液,沸水浴 10min,SDS-PAGE 检测。 结 果如下:图 2

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1: pET-32aA3 诱导上清,2: pET-32aA3 诱导沉淀 三、探索可溶表达条件 有 上述实验结果可知,目标蛋白在上清也有表达,即存在可溶性的表达,但是量很少,大部分也包涵体的 形式存在(沉淀中),而包涵体的存在也证明了蛋白表达量很 高,上清可溶蛋白的可操作性等因素都优于 对包涵体蛋白的分离纯化,所以可通过探索可溶表达条件,最终来加大上清蛋白的含量,以利于下一步实 验的进行。 影 响包涵体形成的因素有很多,如诱导温度,诱导时间,IPTG 浓度,摇床转速等等,所以设定在低 IPTG 浓度下(0.1 mmol/L),在不同温度,诱导时间下的表达对照:

1)37℃ 250rpm 5h 2)30℃ 180rpm 10h 3)23℃ 90rpm 30h 过程:挑取一单菌落接种于含氨苄(Amp,终浓度为 100g/mL)的 3mL 液体 LB 培养基中 37℃,250rpm 培 养过 夜。 将过夜培养菌液以 1:100 转接于含上述抗生素的 50mL+50mL+60mL 液体 LB 中, 37℃, 250rpm, 3.5h(大量培养至 OD600=0.6 左右)。从 60mL 培养液中取 10mL 作为未诱导对照,标记 3 个 50mL LB 培养菌液:1、37℃ 250rpm 5h 2、30℃ 180rpm 10h 3、23℃ 90rpm 30h 都分 5 次取样: 37℃ 每一小时取样一次(取 10mL)编号为:371、372、373、374、375 30℃ 每二小时取样一次(取 10mL)编号为:301、302、303、304、305 37℃ 每五小时取样一次(取 10mL)编号为:231、232、233、234、235 诱导培养结束后, 将上述样品分别破菌离心, 得上清与沉淀, 2× 上样缓冲液, 加 沸水浴 10min, SDS-PAGE 检测。 SDS-PAGE 检测: 1、37℃ M 1 2 3 4 5 五个样的上清和沉淀 2、30℃ M 1 2 3 4 5 五个样的上清和沉淀 3、23℃ M 1 2 3 4 5 五个样的上清和沉淀 4、以不同温度下的最优可溶表达做比较 结果如下: 图 3:37℃条件下五个样的上清和沉淀

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1: 371 上清,2: 371 沉淀,3: 372 上清,4: 372 沉淀,5: 373 上清,6: 373 沉淀, 7: 374 上清,8: 374 沉淀,9: 375 上清,10: 375 沉淀 图 4 图 4:30℃条件下五个样的上清和沉淀

1: 301 上清,2: 301 沉淀,3: 302 上清,4: 302 沉淀,5: 303 上清,6: 303 沉淀, 7: 304 上清,8: 304 沉淀,9: 305 上清,10: 305 沉淀 图 5:23℃条件下五个样的上清和沉淀

1: 231 上清,2: 231 沉淀,3: 232 上清,4: 232 沉淀,5: 233 上清,6: 233 沉淀, 7: 234 上清,8: 234 沉淀,9: 235 上清,10: 235 沉淀

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2011 精品 图 6:不同温度下的最优可溶表达

1: 234 上清,2: 234 沉淀,3: 303 上清,4: 303 沉淀,5: 373 上清,6: 373 沉淀, 由图 5 可知:23℃条件下,明显的提高了上清目的蛋白的含量,并且,存在可溶表达平衡,即 20 个小时 后,蛋白表达将以包涵体的形式存 在,即不论如何改变条件,可溶表达已经达到极限。所以无需探索更低 温度等条件。(个人观点,不知道是否正确) 四、大量制备,表达与纯化 配 置 1L LB 液体培养基,分装成 100mL×10 瓶,分瓶以利于大肠杆菌生长和后续操作。 诱导培养:挑取一单菌落接种于含氨苄 (Amp,终浓度为 100g/mL)的 3mL×5 管 液体 LB 培养基中 37℃, 诱导培养 250rpm 培养过夜。将过夜培养菌液以 1:100 转接于含上述抗生素的 100mL×10 瓶液体 LB 中,37℃, 250rpm,3.5h(大量培养至 OD600=0.6 左右)。取出 1 mL 菌液为未诱导的电泳对照,剩余培养液加入 诱导物 IPTG 至终浓度为 0.1 mmol/L,23℃,90rpm 条件下,继续振荡培养 20 小时。 菌收集上清: 破 菌收集上清:分别离心(4℃,12000g,5min)加 8mL×10 管 PBS(pH 7.0)缓冲液重悬后,冰浴条 件下超声波破碎(400W,15s,45s,30min),分别离心(4℃,12000g,15min)收集上清(8mL 左 右 ×10 管)。 稀释过滤上清:将 8mL 左右×10 管菌液用 PBS(pH 7.0)缓冲液稀释为 2 倍,并过 0.45 纳米滤膜。取 稀释过滤上清 1mL 留样。 过镍柱纯化:( 过镍柱纯化:(8mL 左右×10 管×2 倍=160mL,分 2 次过 柱,每次 80mL) A、用缓冲液 I (PBS pH 7.0 缓冲液)平衡镍柱,5 个床体积,流速为 2mL/min。 B、将稀释过滤后的 上清上样,流速为 1mL/min。 C、用缓冲液 I (PBS pH 7.0 缓冲液)再洗 5 个床体积,流速为 2mL/min。使目标蛋白充分挂柱。 D、 用含 50mM 咪唑的缓冲液 III,洗去杂蛋白,流速为 2mL/min。并收集洗杂峰。 E、用含 100mM 咪唑的缓冲液 III,进行洗脱,流速为 1mL/min。并收集洗脱峰,收集洗脱液。 F、 将收集的洗脱液用 15mL 超滤离心管分次超滤浓缩, 收集各次浓缩液合并后再次超滤浓缩, 分装成每 管 1.5mL,取 1mL 4℃备用,其余-80℃保存。 G、各取 1mL 过柱前、挂柱穿透、洗杂液、洗脱液加 2×上样缓冲液,沸水浴 10min,SDS-PAGE 检测。 结果如下: 图 7 蛋白质过 Ni 柱电泳图示

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1: pET-32aA3 诱导全菌,2: pET-32aA3 诱导沉淀,3: pET-32aA3 诱导上清,4: Ni 柱穿透, 5: 50mM 咪唑洗杂蛋白,6: Ni 柱洗脱(纯化的蛋白),7: 超滤离心管浓缩的蛋白 全 图:

1: pET-32a 未诱导,2: pET-32a 诱导,3: pET-32aA3 未诱导 4: pET-32aA3 诱导, 5: pET-32aA3 诱导沉淀,6: pET-32aA3 诱导上清,7: Ni 柱纯化的蛋白,8: Ni 柱纯化的蛋白 五、Western Blot

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六、多克隆抗体的制备 纯化蛋白加等量的弗氏完全 佐剂进行乳化使之形成油包水乳剂(我用枪吹了 2 个多小时),采用皮下、皮 内和肌肉注射的方法进行第一次家兔免疫。再次免疫使用弗氏不完全佐剂乳化,最后一 次静脉加强免疫时 则不用佐剂。每次免疫抗原量为 400 -500g/次(1mL 左右),最后一次加强免疫 7-10 d 后采血。将所采血 4℃凝结过夜,取血清(3000rpm 10~15min),加入 NaN3 后于 4℃保存(我是直接-80 保存,什么都没加)。 用琼脂双扩散的方法测定抗血清效价(还没做) 七、什么什么效 价(还没做) 用琼脂双扩散的方法测定抗血清效价

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