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2013实验讲义分子生物学


分子生物学实验讲义

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实验一、DNA 的分离纯化 -------碱裂解法提取质粒 DNA
一、 实验目的: 掌握碱裂解法提取质粒 DNA 的原理与方法,了解各种试剂的作用。 二、 实验原理: 从细菌分离质粒 DNA 的方法都包含 3 个基本步骤:培养细菌使质粒扩增;收集 和裂解细胞;分离和纯化质粒 DNA。碱变性法抽提质粒是基于染色体 DNA 与质粒 DNA 的变性与复性的差异而达到分离目的。 将细菌悬浮于葡萄糖等渗液中,经 EDTA、NaOH- SDS 溶液处理,可破坏菌体细 胞壁和细胞膜,使细胞崩解。NaOH 破坏核酸碱基对使氢键断裂,细菌染色体 DNA 和 质粒 DNA 变性,但质粒超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离,所以 当以 pH4.8 的 KAc 高盐缓冲液调节其 pH 至中性时,变性的质粒 DNA 又恢复到原来的 构型,重新形成天然的超螺旋分子,并以溶解状态存在于液相中。而线状染色体 DNA 片段难以复性,与不稳定的大分子 RNA、蛋白质-SDS-细胞膜复合物缠绕附着在细胞 壁碎片上,冰浴后易沉淀,可离心除去。通过氯仿/异戊醇等有机溶剂除去蛋白质, 再用乙醇等有机溶剂沉淀 DNA,即得纯化的质粒 DNA。

三、 实验用品: 如试剂: ◆ 溶液I(葡萄糖维持渗透压、Tris-HCl 维持 pH 值、EDTA 抑制核酸酶)

50mmol/L 葡萄糖
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25mmol/L Tris.Cl(pH8.0) 10mmol/LEDTA(pH8.0) ◆溶液Ⅱ(NaOH 裂解细胞与核酸变性、SDS 裂解细胞与蛋白质变性) 0.2mol/L NaOH(临用前用 10mol/L 贮存液现用现稀释) 1%SDS ◆溶液Ⅲ(乙酸钾置换钠离子、冰乙酸调节 pH 值) 5mol/L乙酸钾 60ml 冰乙酸 11.5ml 水 28.5ml 异丙醇、无水乙醇、蒸馏水 四、 实验步骤: (一)细菌培养和收集 将含有质粒的 Ecoli 菌种接种在 LB 固体培养基(含 50 μ g/ml Amp)中,37oC 培养 12~24 小时。 用无菌牙签挑取单菌落接种到 5ml LB 液体培养基 (含 50μ g/ml Amp) 中,37 oC 振荡培养约 12 小时至对数生长后期。 (二)质粒 DNA 的少量快速提取(碱法) 1.取 1.5ml 培养液倒入 1.5ml eppendorf 管中,12000r/min 离心 1min。 ,弃 上清,倒置片刻,使液体流尽。 (可重复步骤 1 一次,以收集较多菌体) 2.菌体沉淀重悬于 300μ l 溶液Ⅰ中,剧烈振荡使菌体充分重悬,加入新配制 的溶液Ⅱ300μ l,盖紧管口,立即将离心管缓慢颠倒数次直到溶液变清亮 (千万不 要振荡)。 3.加入 300μ l 预冷的溶液Ⅲ,盖紧管口,缓缓颠倒离心管数次直到白色沉淀

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充分形成,冰浴 5min,12000r/min 离心 5 分钟。 4.上清液移入干净 eppendorf 管中,加等体积的氯仿/异戊醇(24:1) ,混匀, 放置片刻。12000r/min 离心 5 分钟。 5.将水相移入干净 eppendorf 管中,加入 0.6 倍体积异丙醇,震荡混匀后, 12000r/min 离心 5 分钟。 6.弃上清液,将管口敞开倒置于卫生纸上,使所有液体流出,加入 1ml 70%乙 醇液沉淀一次,12000r/min 离心 5 分钟。 7.吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,真空干燥 10 分钟或室温干 燥。 8. 将沉淀溶于 40-50μ l TE 缓冲液 (pH8.0, 含 20μ g/ml RNaseA) 中, 储于-20℃ 冰箱中。 【注意】 提取过程尽量保持低温。 采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好。 沉淀 DNA 通常用冰乙醇,低温条件下放置时间稍长可使 DNA 沉淀完全。 五、实验结果: 1、记录观察现象; 2、分析原因
如:质粒沉淀离心后,在管底能见到少量白色物质。 真空干燥后,无色,贴于管壁。 加 ddH2O 或 TE 能迅速溶解。 质粒中含太多杂质,则干燥后会呈白色或褐色,不易溶解。

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实验二、核酸的检测 (琼脂糖凝胶电泳)
一、 实验目的: 学习琼脂糖凝胶电泳分离 DNA 的原理,掌握 DNA 电泳分析技术。 二、 实验原理: DNA 分子带负电荷,在电场中受到电荷效应、分子筛效应向正极移动过程中,因 DNA 分子的大小及构象差别而呈现迁移位置上的差异,对于线形 DNA 分子,其电 场中的迁移率与其分子量的绝对值成反比。电泳时加溴化乙锭(EB) ,其与 DNA 结合形成一种荧光络合物,在 254-365nm 紫外照射下可产生桔红色的荧光,可用 于检测 DNA。 三、 实验用品: 四、 实验步骤: 1、 琼脂糖凝胶板的制备: 1g 琼脂糖+50ml 电泳缓冲液,加热熔化均匀,冷却

到 60-70℃,加 10ul EB 混合,倒入凝胶盒,厚 3-5mm,插上点样梳,凝固后 放入水平电泳槽,使电泳缓冲液淹没过胶 1-2mm 为止。 2、 加样:取出点样梳,10ul 样品+2ul(吸嘴一小滴)上样缓冲液,混合后取

10ul 加入点样孔。同时设立 Marker(DNA 分子量标准物) 3、 4、 电泳:60-90v,待溴酚蓝移至凝胶的 2/3 距离时,停止电泳。 凝胶成像系统观察电泳结果。

五、 实验结果: 1、 画出电泳图。 2、 简单说明分析。

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如:质粒 DNA 在电场中带负电向正极移动,用酚、氯仿法从工程菌中提取的质粒一般有三种构像,即超螺旋,
线形和开环。 (开环质粒是指双链环状的质粒 DNA 有部分解链,因此电泳速度最慢)三种构像的质粒在琼脂糖 电泳的前后顺序是超螺旋>线形>开环,线形的质粒在中间,而开环的质粒在最后。

实验三、聚合酶链技术 (PCR 鉴定质粒)
一、实验目的: 1、熟悉 PCR 反应的基本原理; 2、掌握 PCR 反应的操作方法。 二、实验原理: 体外快速的 DNA 特异性扩增技术。模拟体内 DNA 复制过程,通过变性、退火、 延伸三步反应的循环完成,靶基因的双链 DNA 变性为单链,特异的引物在退火过程 中与单链 DNA 模板聚合,在靶 DNA 的指导下引物的 3’末端延伸靶 DNA 的互补链,完 成一个循环。理论上,每一循环使 DNA 分子扩增一倍,n 次循环后,DNA 分子扩增为 2 n; 高温变性:94℃,目的基因变性为单链,以作为扩增的模板; 低温复性:55~60℃,一对特异性引物分别与模板 3’端互补结合; 适温延伸:72℃,延伸反应; 本实验 PUC19 质粒多克隆位点两侧含有恒定序列,用此序列为特异性引物进行 PCR 扩增,产物长度为 158bp,以此鉴定 PUC19 质粒。 三、实验用品: 四、实验步骤:
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1、50ul 反应体系的配制,如表: ddH2O 10*buffer MgCl2(25mM) dNTP(10mM) P1(10uM) P2(10uM) Taq酶(5U/ul) DNA模板 充分混合,放入 PCR 仪扩增 3、 反应条件: 94.0℃ 预变性 3min → 94.0℃ 30s 58.0℃ 20s 72.0℃ 40s 4、2℅琼脂糖凝胶电泳检测(步骤同实验二) 五、实验结果: 1、画出电泳图。 2、简单说明分析。 → 30 cycles → 72.0℃ 5min 32.6ul 5ul 5ul 1ul 1ul 1ul 0.4ul 4ul

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