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第一章 酶学与酶工程 (6~7节)


Enzyme Engineering 酶工程

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第一章 酶学与酶工程
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第六节 影响酶活力的因素 第七节 酶的分离纯化

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第六节 影响酶活力的因素
一、 酶活力的测定
酶活力(enzyme activity)也称为酶活性, 是指酶催化一定化学反应的能力。 1. 酶活力与酶反应速度 酶活力的大小可以用一定条件下所催化的 某一化学反应的反应速度(reaction velocity)来 表示,两者呈线性关系。 酶反应速度可用单位时间内底物的减少量 或产物的增加量来表示。
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Time

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2. 酶的活力单位(U,activity unit) 酶活力的大小及酶含量的多少,用酶活力单位表 示,即酶单位(U)。酶单位的定义是:在一定条件 下,一定时间内将一定量的底物转化为产物所需要的酶 量。这样酶的含量就可以用每克酶制剂或每毫升酶制剂 含有多少酶单位来表示(U/g或U/ml)。 1961年国际酶学委员会规定“国际单位”表示酶活力; 一个国际单位(IU)是指在最适反应条件下,1每分钟催 化1 μ moL底物转化为产物所需要的酶量。 1972年又推荐一种新的酶活力单位——Katal(简 称Kat)单位。一个katal单位是指在最适反应条件下, 1每秒钟催化1moL底物转化为产物所需要的酶量。 1Kat=6?107IU,1IU=16.7nKat

3. 酶的比活力(specific activity) 酶的比活力代表酶的纯度,国际酶学委员会规定 比活力用每mg蛋白质所含有的酶活力单位数表示。对 同一种酶比活力愈大,纯度愈高。 4. 酶的转换数:Kcat值 Kcat值以一定条件下每秒钟每个酶分子转换底物的 分子数来表示酶的催化效率。 5. 酶活力的测定方法 (1)分光光度法(spectrophotometry) (2)荧光法(fluorometry) (3)同位素测定方法 (4)电化学方法(electrochemical method) 退出

二、影响酶活力的因素
1.底物浓度
随着酶反应的进行,底物浓度逐渐下降,产物逐渐积 累,酶反应速度也会逐渐变小。为了排除底物和产物浓 度变化对酶反应速度的影响,人们采用酶反应的初速度 作为衡量的指标。

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2、酶浓度
在底物浓度饱和的情况下,酶浓度的加倍将导 致V0 的加倍,即V0与酶浓度的关系图为直线图形。

3、温度
温度对酶反应速率的影响表现在两个方面, 一方面是当温度升高时,与一般化学反应一样, 反应速率加快。反应温度提高10℃,其反应速率 与原来反应速率之比称为反应的温度系数,用 Q10表示,对大多数酶来讲温度系数Q10多为2 , 也就是说,即温度每升高10 ℃,酶反应速率为 原反应速率的2倍。另一方面由于酶是蛋白质, 随着温度升高,使酶蛋白逐渐变性而失活,引起 酶反应速率下降。

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在较低的温度范围内,酶反应速率随温度升 高 而增大,但超过一定温度后,反应速率反而下降, 因此只有在某一温度下,反应速率达到最大值,这 个温度就称为酶反应的最适温度(opptimum temperature)。每种酶在一定条件下都有其最适 温度。

v

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最适温度

t/0C

4 、 pH
酶的活力受环境pH的影响,在一定pH下, 酶表现最大活力,高于或低于此pH,酶活力降低, 通常把表现出酶最大活力的pH称为该酶的最适pH (optimum pH) 各种酶在一定条件下都有其最特定的最适pH, 因此最适pH是酶的特性之一。但酶的最适pH不是 一个常数,受许多因素影响,随底物种类和浓度、 缓冲液种类和浓度的不同而改变,因此最适pH只 有在一定条件下才有意义。
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pH影响酶活力的原因可能有以下几个方面: (1) 过酸或过碱可以使酶的空间结构破坏,引起 酶构象的改变,酶活性丧失。 (2) 当pH改变不很剧烈时,酶虽未变性,但活 力受到影响。 (3)pH影响维持酶分子空间结构的有关基团解离, 从而影响了酶活性部位的构象,进而影响酶的活性。
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5、 激活剂对酶反应的影响
凡是能提高酶活性的物质都称为激活剂 (activator),其中大部分是无机离子或简单的有机 化合物。作为激活剂的金属离子有K+、Na2+ 、 Ca2+ 、 Mg2+ 、 Zn2+ 及 Fe3等离子,无机阴离子如:Cl- 、 Br- 、 I- 、 CN- 、 PO43- ,氢离子,中等大小的有机 分子以及具有蛋白质性质的大分子物质等都可作为 激活剂。 激活剂对酶的作用具有一定的选择性,即一种 激活剂对某种酶起激活作用,而对另一种酶可能起 抑制作用;有时离子之间有拮抗作用;有时金属离 子间也可互相替代。

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第七节 酶的分离纯化
一.分离纯化酶的原则 设计酶的纯化方案时要考虑到应用,下 列各点是应认真遵循的原则: 第一,要注意防止酶变性失效,这一点在 纯化的后期更为突出。 第二,从理论上说,凡是用于蛋白质分离 纯化的一切方法都同样适用于酶。 第三,酶具有催化活性,检测酶活性可以 跟踪酶的来龙去脉,为酶的抽提、纯化以及 制剂过程中选择适当的方法与条件提供直接 的依据。

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二.防止酶变性失效的方法
(1)除了少数例外,所有操作都应在低温条件下 进行,尤其是在有机溶剂存在的情况下更应特别小 心。 (2)大多数酶在pH<4或pH>10的情况下不稳定, 故必须控制整个系统不要过酸过碱;同时要避免在 调整pH时产生局部酸碱过量的现象。 (3)酶和其它蛋白一样,常易在溶液表面或界面 处形成薄膜而变性,故操作中应尽量减少泡沫形成。 (4)重金属等能引起酶失效,有机溶剂能使酶变 性,微生物污染以及蛋白水解酶的存在能使酶分解破 坏,所有这些也都应予以足够的重视。
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整个纯化工作包括三个基本环节:抽提、纯 化和精制。 常用的抽提方法除细胞自溶外,还有有机溶 剂或表面活性剂处理等化学方法;近年来为 适应日益增多的胞内酶分离提纯的需要,发 展和设计了不少细胞或菌体的破碎设备,如 超声波振荡器、高压喷挤设备、匀浆装臵及 振动球磨。

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三、纯化方法
酶分离纯化工作是酶学研究的重要组成部分,亦 是酶制剂工业生产的主要内容。要研究或使用一个 酶,就得采用分离纯化方法去得到它。酶的化学本 质是蛋白质,所以用于蛋白质的分离纯化方法一般 都适用于酶的分离纯化。此外根据酶与底物、底物 结构类似物、辅助因子、抑制剂等的特异亲和力, 可发展酶独特的亲和色谱技术。 整个纯化工作包括三个基本环节:抽提、纯化和 精制。如果欲分离的目标分子是细胞内产物,首先 涉及的是细胞的破碎,接下来的分离过程可分成粗 分离和精制分离。
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(一)酶的抽提

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抽提的要求是将尽可能多的酶、尽量少的杂质从 原料引入溶液。 过去多用动物或植物的器官组织作为酶的来 源,近年来则主要采用微生物作材料。但是不管 什么原料,通常都需要先进行适当的预处理。例 如,动物材料要剔除结缔组织、脂肪组织;油质 种子最好先用乙醚等脱脂;种子研磨前应去壳, 以免丹宁等物质着色污染;微生物材料则应将菌 体和发酵介质分离。经过这些处理后,材料须尽 可能以非常新鲜的状态直接应用,否则就应将完 整材料立即冰冻起来。

1. 预处理

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2. 破碎细胞

酶根据它的分布可分为细胞内酶和细胞外酶, 根据它的存在状态,即是否与细胞内的颗粒体或 膜结合,细胞内酶又可分为结酶与溶酶。细胞外 酶没有破细胞问题;但是细胞内酶却只有在细胞 破裂后才能释放出来,而且抽提效果也往往与细 胞破碎程度有关。至于结酶,还有一个切断它与 颗粒体或膜的连结问题。

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破碎细胞的手段:

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动、植物材料: 通常用绞肉机作成组织糜,如果需要破碎得更彻底 些,可用高速组织捣碎器捣碎,或者加砂研磨。高 速捣碎器操作简便、破碎效果好,但易引起局部温 度过高,导致酶失效,故必须考虑酶的特点谨慎使 用。加砂研磨,特别是用玻璃粉或氧化铝代替砂时, 要注意有时可能发生吸附变性。在上述机械处理后, 为了有利于下一步抽提,还可进一步作成丙酮干粉, 或者进行反复冰冻融解处理,量少时,某些组织还 可采用匀浆器将细胞研磨破碎。

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微生物材料: 不同的微生物材料处理的方法与难易程度也各有 差异。 霉菌材料比较容易,可通过机械剪切、研磨或加 细胞壁溶解酶解决。 细菌,少量材料常用超声波破碎器和溶菌酶等处 理;大量材料通常采用丙酮干粉法,或采用自溶 法。 酵母细胞壁厚较难对付,过去多用自溶法,现在 可采用的办法有: (1)细胞壁溶解酶处理法; (2)盐振荡法; (3)冷热破壁法。

3. 抽提

细胞破碎后,可采用两种方式进行抽提:
一是“普遍”抽提; 二是先后用不同溶剂进行选择性抽提。

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抽提条件的选择: 由于大多数酶属于球蛋白类,因此一般部可 以用稀盐、稀酸或稀碱的水溶液进行抽提。但抽 提液的具体组成和抽提条件的选择取决于酶的溶 解性、稳定性以及有利于切断酶和其它物质的联 系。需要考虑的因素有: pH;盐;温度;其它。

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a. pH

首先应考虑酶的酸碱稳定性,选择的pH不应超出酶 的稳定范围; 其次从最佳的抽提效果着眼,最好远离待抽提酶的 等电点。也就是说,酸性蛋白质宜用碱性溶液抽提 碱性蛋白质宜用酸性溶液。例如,肌肉甘油醛— 3—磷酸脱氢酶以稀碱抽提时产量较高,胰蛋白酶 选用0.25N硫酸。 第三,在某些情况下抽提还要兼顾到有利于切断酶 和细胞内其它成分间可能的联系,从这点考虑以选 用pH4—6为佳。
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b. 盐 大多数蛋白质在低浓度的盐溶液中有较大的溶解 度,所以抽提液一被采用等渗盐溶液。最普通的 加0.020—0.050M的磷酸缓冲液、0.15MNaCl等。 焦磷酸钠和柠檬酸钠的缓冲有助于切断酶和其它 物质的连系,并有络合某些金属的作用,因此用 得也很多。 少数情况用水抽提效果亦佳,如霉菌脂肪酶的抽 提,这可能与低渗可破坏细胞结构有关.
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c. 其它

在破细胞后,某些亚细胞结构也往往受到损伤,这 样就可能给抽提系统带来各种不稳定因素。为此, 有时还需要在抽提液中加入某些物质。 例如,为防止蛋白酶的破坏性水解作用可加入苯甲 基磺酰氟;为防止氧化等因素的影响可加入半胱氨 酸、惰性蛋白和底物等。

抽提液的用量:

通常采用原料量的l—5倍,有时为了抽提效果好些, 要反复抽提,液量可能大些。
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4. 固体成份除去:

抽提后的细胞残渣或发酵液的固体成份多可 用离心法或压滤法除去。植物原料的抽提液在 冷室中放臵过夜往往就会自动澄清。某些情况 下,在抽提液离心时加入氢氧化铝凝胶或磷酸 钙胶等物质 , 有助于除去悬浮的胶体物质。

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(二) 浓缩

抽提液和发酵液中酶的浓度一般都很低,所 以在进行纯化前须先加以浓缩。常用的浓缩方 法有: 1. 蒸发; 2. 超过滤; 3. 胶过滤;4. 冰冻浓缩; 5. 其它

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1 蒸发
减压蒸发浓缩除了效率低、费时外,有时还 要加热,同时也可能产生泡沫,因此对稳定性 差的酶不适宜。另外,蒸发过程可能产生增色 现象,达也影响产品质量。 超蒸发法,即让暖空气流通过冷的酶溶液表 面,或让暖空气流通过装有酶液的透析袋使之 加速蒸发,但此法效率不佳。

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薄膜蒸发浓缩法(现在多采用的方式),即 使待浓缩的酶溶液在高度真空条件下变成极薄 的液膜,同时使之与大面积热空气接触,其中 水分就能瞬时蒸发而达到浓缩的目的。 由于水分蒸发时能带走部分热量,所以只要 真空条件好,酶在浓缩过程中实际受到的热作 用并不太强,可用于热敏性酶类的浓缩。薄膜 蒸发浓缩器有三种形式:升膜、降膜和刮板。 对于较粘稠的样品,后一种形式似乎更为适合, 不过薄膜浓缩也往往会带来增色现象。
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2 超过滤

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在加压情况下,将待浓缩溶液通过一层只容 许水分子和小分子选择性地透过的微孔超滤膜, 而酶等大分子被滞留,从而达到浓缩目的的一种 有效方法。 优点:没有热破坏,没有相变化,保持原来 的离子强度和pH。只要膜选择适当,浓缩过程还 可能同时进行粗分,此外成本也不高,已渐渐为 人们所采用。超过滤可用于小量样品,也可用于 工业生产规模。 注意:超滤膜有干型和湿型两种,后者必须 保持于溶液中。

3 胶过滤
这是利用葡聚糖凝胶sephdex G—25或G— 50等能吸水膨润、而酶等大分子被排阻于胶 外的原理进行的浓缩。通常采用“静态”方 式,即将干胶直接加入样品溶液(干胶用量 可根据胶的吸水量计算),胶吸水膨润一定 时间后,再借助过滤或离心等办法分离浓缩 的酶液。胶过滤浓缩法的优点是,条件温和, 操作简便,也没有pH与离子强度等的改变。
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4 冰冻浓缩 原理:溶液相对纯水融点升高,冰点降低。这 有两种方式: 1.先将溶液冻成冰块。然后使之缓缓融解, 这样几乎不含蛋白质和酶的冰块就浮于液面,而 酶等则融解并集中于下层溶液(约为原体积的1 /4); 2.让酶溶液缓缓冻凝,尔后移去水形成的冰 块. 问题:浓缩过程可能会发生离子强度与pH的变 化,从而导致酶失效;其次是需要大功率的致冷 设备.

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5. 其它 还有聚乙二醇等浓缩法,它们 一般只适用小量样品,而且往往 成本很高。

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(三)酶的纯化
在抽提液中,除了待纯化的酶外,通常不可避免地杂 有其它小分子和大分子物质.其中小分子杂质在以后的 纯化步骤中一般会自然地除去,因此比较容易解决;大 分子物质包括核酸,粘多糖和其它蛋白质.核酸和粘多 糖往往干扰以后的纯化,特别是细菌等的抽提液中常会 有大量核酸,最好设法预先除去.核酸可加硫酸链霉素, 聚乙烯亚胺,色精蛋白或MnCl2等使之沉淀移去,必要时 也可使用核酸酶.粘多糖则常用醋酸铅,乙醇,丹宁酸和 离子型表面活性剂等处理解决,有时也可用酶。这些杂 质移除后,余下的是杂蛋白. 纯化的主要工作,同时也是比较困难的工作,就是要 将酶从杂蛋白中分离出来.

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1、纯化方法的选择 为了获得理想的分离效果应注意: 第一,工作前应对所要纯化的酶的理化性 质(溶解度、分子大小和解离特性)以及酶的 稳定性等有一个较全面的了解,这样就可知 道应选择哪些办法与条件,避免哪些处理, 以及了解在什么情况下酶比杂蛋白更稳定而 能加以利用。
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第二,判断选择的方法与条件是否适当, 始终应以活力测定为准则。一个好的步骤应 该是比活力(纯度)提高多,总活力回收高 (回收率高),而且重现性好。一般地说, 纯化过程不宜重复相同的步骤和方法,因为 这样只能使酶的总活力下降,而不能使酶的 纯度进一步上升。 第三,要严格控制操作条件,特别是随着 酶逐渐纯净、杂蛋白逐渐移除、总的蛋白浓 度下降,蛋白质间的相互保护作用随之减小, 酶的稳定性亦越小,就更应注意防止变性。
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2、酶的纯化方法

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现行的方法(根据酶和杂蛋白在性质上的差 异而建立的): (1) 根据溶解度的不同; (2) 根据分子大小的差别; (3) 根据解离电学性质的特点; (4) 利用稳定性的差异; (5 基于酶和底物、辅助因子以及抑制剂 间具有专一的亲和作用的特点。 实际有许多方法中往往包含两种或两种以 上的因素在同时起作用。


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