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RT-PCR的实验原理与操作步骤


提取组织或细胞中的总 RNA, 以其中的 mRNA 作为模板,采用 Oligo(dT)或随机引 物利用逆转录酶反转录成 cDNA。再以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增,而获得目的基 因或检测基因表达。RT-PCR 使测的灵敏性提高了几个数量级,使一些极为微量 RNA 样品分析成为可能。该技术主要用于:分析基因的转 录产物、获取目的基 因、合成 cDNA 探针、构建 RNA 高效转录系统。 (一) 反转录酶的选择 1. Moloney 鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶:有强的聚合酶活性,RNA 酶 H 活性相 对较弱。最适作用温度为 37℃。 2. 禽成髓细胞瘤病毒(AMV)反转录酶:有强的聚合酶活性和 RNA 酶 H 活性。最适 作用温度为 42℃。 3. Thermus thermophilus、 Thermus flavus 等嗜热微生物的热稳定性反转录酶: 在 Mn2 存在下,允许高温反转录 RNA,以消除 RNA 模板的二级结构。 4. MMLV 反转录酶的 RNase H-突变体: 商品名为 SuperScript 和 SuperScriptⅡ。 此种酶较其它酶能多将更大部分的 RNA 转换成 cDNA,这一特性允许从含二级结 构的、低温反转录很困难的 m 模板合成较长 cDNA。 (二) 合成 cDNA 引物的选择 1. 随机六聚体引物: 当特定 mRNA 由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其 全长序列时,可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长 mRNA。用此 种 方法时,体系中所有 RNA 分子全部充当了 cDNA 第一链模板,PCR 引物在扩增 过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的 cDNA 中 96%来源于 rRNA。 2. Oligo(dT):是一种对 mRNA 特异的方法。因绝大多数真核细胞 mRNA 具有 3’ 端 Poly(A )尾,此引物与其配对,仅 mRNA 被转录。由于 Poly(A )RNA 仅占总 RNA 的 1-4%,故此种引物合成的 cDNA 比随机六聚体作为引物和得到的 cDNA 在数量 和复杂性方面均要小。 3. 特异性引物:最特异的引发方法是用含目标 RNA 的互补序列的寡核苷酸作为 引物,若 PCR 反应用二种特异性引物,第一条链的合成可由与 mRNA 3’端最靠 近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的 cDNA,导致更为特异的 PCR 扩 增。生物科研 www.biom.cn 二、实验耗材与试剂 1.RNA 提取" target="_blank" >RNA 取试剂 2.第一链 cDNA 合成试剂盒 3.dNTPmix:含 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 各 2mM

4.Taq DNA 聚合酶 三、实验步骤 (一) 总 RNA 的提取 见相关内容。 (二) cDNA 第一链的合成 目前试剂公司有多种 cDNA 第一链试剂盒出售,其原理基本相同,但操作步骤不 一。现以 GIBICOL 公司提供的 SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。 1. 在 0.5ml 微量离心管中,加入总 RNA 1-5μ g,补充适量的 DEPC H2O 使总体积 达 11μ l。在管中加 10μ M Oligo(dT)12-18 1μ l,轻轻混匀、离心。 2. 70℃加热 10min,立即将微量离心管插入冰浴中至少 1min。 然后加入下列试剂的混合物: 10×PCR buffer————2μ l 25mM MgCl2————2μ l 10mM dNTPmix————1μ l 0.1M DTT————2μ l 轻轻混匀,离心。42℃孵育 2-5min。 3. 加入 SuperscriptⅡ1μ l ,在 42℃水浴中孵育 50min。 4. 于 70℃加热 15min 以终止反应。 5. 将管插入冰中, 加入 RNase H 1μ l , 37℃孵育 20min, 降解残留的 RNA。 -20℃ 保存备用。 (三) PCR 扩增 1. 取 0.5ml PCR 管,依次加入下列试剂: 第一链 cDNA————2μ l 上游引物(10pM)————2μ l

下游引物(10pM)————2μ l dNTP(2mM)————4μ l 10×PCR buffer————5μ l Taq 酶(2u/μ l)————1μ l 2. 加入适量的 ddH2O,使总体积达 50μ l。轻轻混匀,离心。 3. 设定 PCR 程序。在适当的温度参数下扩增 28-32 个循环。为了保证实验结果 的可靠与准确,可在 PCR 扩增目的基因时,加入一对内参(如 G3PD)的特异性引 物,同时扩增内参 DNA,作为对照。 4. 电泳鉴定:进行琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察结果。 5. 密度扫描、结果分析:采用凝胶图像分析系统,对电泳条带进行密度扫描。 四、注意事项 1. 在实验过程中要防止 RNA 的降解,保持 RNA 的完整性。在总 RNA 的提取过程 中,注意避免 mRNA 断裂。 2. 为了防止非特异性扩增,必须设阴性对照。 2. 内参的设定:主要为了用于靶 RNA 的定量。常用的内参有 G3PD(甘油醛-3-磷 酸脱氢酶)、β -Actin(β -肌动蛋白)等。其目的在于避免 RNA 定量误差、加样误 差以及各 PCR 反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。 4. PCR 不能进入平台期,出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二 级结构以及目标 DNA 起始的数量有关。 故对于每一个目标序列出现平台效应的循 环数,均应通过单独实验来确定。 5. 防止 DNA 的污染:采用 DNA 酶处理 RNA 样品,在可能的情况下,将 PCR 引物 置于基因的不同外显子,以消除基因和 mRNA 的共线性。 6. 所有的玻璃器皿均应在使用前于 180℃的高温下干烤 6hr 或更长时间。 7. 塑料器皿可用 0.1% DEPC 水浸泡或用氯仿冲洗(注意:有机玻璃器具因可被 氯仿腐蚀,故不能使用)。 8. 有机玻璃的电泳槽等,可先用去污剂洗涤,双蒸水冲洗,乙醇干燥,再浸泡 在 3% H2O2 室温 10min,然后用 0.1% DEPC 水冲洗,晾干。

9. 配制的溶液应尽可能的用 0.1% DEPC,在 37℃处理 12hr 以上。然后用高压灭 菌除去残留的 DEPC。不能高压灭菌的试剂,应当用 DEPC 处理过的无菌双蒸水配 制,然后经 0.22μ m 滤膜过滤除菌。 10. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套,实验过程中手套要勤换。 11. 设置 RNA 操作专用实验室,所有器械等应为专用。


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