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SiO


山东 医药 2 1 0 1年第 5 1卷第 2 期  l

SO i2对 人 肺 泡 巨 噬 细 胞 和 肺 成 纤 维 细 胞 

N —B影 响 的体 外 研究  FK
赵 静, 赵 杰 , 海燕 。 献华  朱 王 ( 河北联合大学病理教研室, 河北唐山0 30 ) 600 

摘要 : 目的

观察 SO 作 用后肺泡 巨噬 细胞 ( M) i  A 和肺成纤 维细胞 ( B) F K F N -B表达 的变化 , 并探讨 其在 硅肺  将入选细胞分为处理组( i2 s0 刺激) 及对照组。应用免疫细胞化学 方法检测 A F   M、 B 处理组 的 A M中 N -B表 达 明显增 高 , 体外 培养 1  FK 在 8h达高 峰, 与对照 组 同时间 点相 

纤维化过程 中的作用 。方法 中 N —B的表 达。结果 FK 0 0 。结论 .5

比 , 0 0 。经 SO 刺激的硅肺患者 A P< .5 i: M培养上清作用于 F  8h后 , FK B4   N -B表 达明显增 高 , 与对 照组相 比 ,   尸< SO 可促进 A F i2 M、B的 N .B上调 , FK FK N .B的表达与硅肺纤维化形成有关 。  
文献标志码 :  B 文章编号 :0 22 6 ( 0 1 2 -000  10 -6 X 2 1 ) 10 4 - 3

关键词 : 硅肺 ; 二氧 化硅 ; 巨噬细胞 , 肺泡 ; 肺成 纤维细胞 ; 因子 K   核 B
中图分 类号 : 15 2 R 3   

硅肺是 由于长期 吸人游离的 S   i 粉尘微粒所  O 引起 的以肺 部硅 结节 形成及 弥 漫性肺 间质纤 维 化为  基本 病变 的职业 肺 病 … 。肺 泡 巨 噬细 胞 ( M) A 是肺  
纤维 化过 程 中的最 重 要 效 应 细胞 , 具有 很 强 的生 物  学 活性 , 分 泌多 种 细 胞 因子 l 。这 些 因子 可 能 通  能 2 ]

细胞贴壁。将 2 4孔板中的细胞爬 片用 P S洗涤 3 B   次, 4℃条件下用 4 %多聚甲醛固定 1  i, 5mn 分别进 
行 苏木 素—伊 红 ( E) 色 、 士 ( i1) 色 , H 染 瑞 wr l 染 gt 光  学 显微镜 下观 察 A 的形 态 学特 点 。 M   122 A 的分组 、 ..  M 条件上 清 的制 备 及 N —B的检  FK 测 在超 净 台 内倒 掉 培 养液 及 未 贴 壁 的混 杂 细胞 ,  

过信号 转 导激 活与 细 胞 增 殖 相关 的基 因 , 进 肺 成  促

纤维细胞( B 等基质生成细胞 的增殖 , E M 的  F) 使 C 合 成 和 降 解 失 衡 , 终 导 致 肺 间 质 纤 维 化 的 发  最 生 ’ 。核 因子 一B N .B 是一种 多功 能 的转 录因  4   J K ( FK )
子, 通过 调控 多种 细胞 因子 、 黏附分 子 、 化 因子 、 趋 炎 

将细胞分 为处理 组 : 加入 S  粉 尘、 i O 不含 血 清 的  
D M 培养 基 ,i : ME SO 终浓 度 为 5  e ml对 照 组 : 0 o, ; / 仅 

加入等量无血清 的 D E 培养基。用 S B MM A C免疫 
细胞 化学 法检测 36 l 、8 2 、6h的 N —B的表  、 、2 1 、43  FK

症介质 、 白质酶等基 因的转录调控 , 蛋 介导了肺泡炎 
和肺纤维化 。20 09年 1 2月 一 00年 l 月 , 21 O 本实验 

达, 以确定 N .B表达及含量的高峰时间点。结果  FK N —B表达 于 1  高 峰 , 此 时 的 A 培 养 上 清  FK 8h达 将 M 作为条件培养上清 。   123 F 的分组 及 N —B 的检 测 ..  B FK
取 新 鲜 引 产 

探讨 了硅肺纤维化过程 中 N .B的作用 。现报告  FK
如下 。   1 材料 与方 法 

胎儿 , 应用 组织 贴块 法培养 F 分别 用 抗 波形 蛋 白、 B,   抗肌 动蛋 白、 Ⅷ 因子 抗 体进 行 免疫 组 化 染 色 以鉴  抗

11 材 料 S   尘购 自中国预 防科 学 院劳卫  .   i 粉 O 所 , 离 SO 游 i 占 9 % 以上 ,5 以上 的颗 粒 直 径 小  7 9%
于 5I   m。10o x 8  C干烤 6h 用 无 血 清 培养 液 D M  , ME  

定F , B 培养 至第 4代细胞进行 实验 。用胰酶 消化  F, DE B 用 M M培养液将细胞调成密度为 1 1 m , × 0/ l   接种在预先放置了无菌小盖玻片的 2 4孔培养板 内,  
每孔 1ml 含 1%F S的 D M 培 养液 培 养 2    。用 0 B ME 4

配成浓度为 5  g I 粉尘悬液 , 0 /l l l 4℃储存备用 。鼠 
抗人 N —B单 克 隆抗 体 、A C免 疫 组 化试 剂 盒 购  FK SB

自武汉博士德生物有限公司。  
1 2 方法  .

h 弃培养液 , , 加入含 05 B .%F S的 D E M M培养液 , 继  续培养 2  4h使其 同步化 。将细胞分 成三组 : 处理 

12 I A 的收集及观察  收集硅肺患者支气管  。。   M 肺泡灌洗液 ( A F 中的 A 用适量的 D E B L) M, M M培养  液将细胞稀释成 1 0/ l ×1。m 细胞悬液 , 分装至无菌  培养瓶及放 置了无菌小玻 片的 2 4孔培 养板 中 , 待 
基金项 目: 河北省科技支撑项 目( 0 7 17 ) 河北省 自然基金项 目 126 1 D ;   ( 20 0 1 7 。 C0800 )  0
4  0

组: 每孔加人经 S   i 粉尘刺激 1 h的 A O 8   M条件培养 
上清 20 l含 6 F S的 D M 培 养 液 20 0  、 % B ME 0 

( B 的终浓度为 3 )对照组 : FS % ; 每孔加人未经 S   i O 粉尘刺激的 A M条件培养上清 20 、 3 B 0 l含 %F S的  DE M M培养液 20 ( B 0  F S的终浓度 为 3 ; %) 血清  组: 每孔仅加入含 3 F S的 D E % B M M培养液4 0I。 0 l L 

山东医药 2 1 年第 5 卷第 2 期  01 1 l
每孔 各 时 间 点 设 5孔 平 行 。 四组 均 在 3 ℃ , %  7 5 胞 核呈 紫红 色 , 于胞 质 一 侧 , 胞 质 呈 紫 蓝 色 , 位 细 胞  质 内含 有大 量吞 噬颗 粒 。   22 两组 N .B的表 达  阳性 物 质 位 于胞 质 、 . FK 胞 
核内, 可见 棕黄 色 的颗粒 状 分 布 。对 照 组 N — B有  FK


C  O 的条件下培养, 分别于 3 6 l 、82 、64 、2 、、2 1 、4 3 、87  
h取 出小 盖玻 片 。用 S B A C免疫 细 胞化 学 法 检 测 各 
时 间点 的 N — B表达 。 FK  

124 判 断标 准  以细 胞 质 或 细胞 核 呈 棕 黄 或 棕  ..

定 量 的基 础 表达 ,8h达 高峰 , 1  以后 逐 渐 下 降 ; 处 

褐色判断为阳性细胞 , 将每张 阳性染色 的细胞爬 片  进行半定量分析 , 取其平均光密度为量化指标 。   13 统 计 学 方 法 采用 S S 1. 计 软 件 , 量  . P S3 0统 计
资料 以 x±s表 示 , 间 均 数 比较 用 t 验 。P≤  组 检
0 0 为有统 计 学差 异 。 .5   2 结 果 

理 组 N .B在 各时 间点 的表 达量 明显 增 多 , 1   FK 于 8h

达高峰 , 在各 时 间点 分别 为对照 组 的 14 、 . 1  .320 、 19 、.5 18 、.7倍 。在 6h后 与 同期 对 照 组  .0 23 、.7 17  
相 比有 统计 学 差异 。见表 1  。 23 硅 肺 患者 1   M 条 件培 养上 清对 F . 8hA B中 N — F 

K B表达的影响 免疫组化法结果显示 , 胞质 内可见 

21 A .   M的光镜 形态学观察 硅肺患者 B L A F中,   H E染 色 可见 A 体 积较 大 , 圆形 、 圆形 , 核呈  M 呈 椭 胞 嗜碱 性 , 质 呈 嗜酸性 , 质 内可见 大量 黑 色吞 噬颗  胞 胞
粒 。Wrh 染 色 可见 AM体 积较 大 , it g 形状 不 规则 , 细 

棕黄色颗粒状物质 , 随表达量增高 , 在细胞核内也逐  渐 有 阳性 表 达 。3 6h阳 性 物 质 位 于 胞 质 中 ,2h 、  1  
后 胞 质及胞 核 中均可 见 。见表 2  。

表 1 两组不 同时间 N - 的表达 ( I ) F-   i-   - ¥

注: 与对 照 组 比 较 , P<0 0     .5

表 2 1   M 条件培养上清对硅肺 患者 F   8hA B中 N .l表达 的影 响( =5 i± ) F ?I c J 。 s  l
组别  3h    6h    1   2h
0 56 0 28 . 0  ̄. 6 “ 3 0  n1 8 n 4 5 ± ∞B   0

1   8h

2   4h

3   6h
Q 岛8 0 17 2  ̄ 05 “ . n1 2 n 0 3 4 ± 06   6

4   8h

7   2h

对照组 Q1 0 00  “ 0 11 0 14 7  ̄.13 . 5 + .3 “ 5 4 2  0 血  组 Q1 ± 1 2 n1  ± 0   3 8 n0   1 4 3 8 Q 41 3 1

0 t  ̄ . 1 “ 03 3 0 B9 . ̄5 01  3 ( 1 2 .¥  ̄. “ 2 O Q1  ± 04   55n 4 4 1 Q1 3 n 1 1 7 ± 09  0

0  ̄3 0 12 . 4  ̄ 07 “ n1 0 0 02 3 . 4  ̄ 08   0 . n1 0 0 07 2 + 06   2 . Q1 3 n 09 1 ± 06   6

注: 与血清组比 ? 00 , . < .1与对照组比 z <  5 较。 P< .5 .P 00 ; 较, p 0   X 0

’  

3 讨论  硅肺 最 典 型 的病 变 特点 是 肺 纤维 化 , 接 影 响  直 着患者的生命健康 。近年研究 表明, M通过 分泌  A 多种 细胞 因子 和 炎 性介 质 参 与硅 肺 的形 成 , 在 硅  且 肺发病中起重要作用。   N —B是 一类 能与 多种 基 因启动 子或 增强 子 部  FK 位K B位点发生 特异性 结合 并促进 其转 录的蛋 白   质。正常情况下 ,FK N —B在胞质中与其抑制蛋 白-B K  (K ) IB 结合成非 活性状态 , 当细胞受 到刺激 , B磷  I K
酸化 后被解 离 , FK N —B从 细胞 质 转 位 于 细胞 核 与靶 

A 中, M 尚有一些未 曾接触粉尘 的 A 在体外 培养  M 时 , 们 接 触 粉尘 后 被 激 活 , 化 的 A 可 能更 活  它 活 M 跃, 释放 细胞 因子 的能力更 强 。处理 组 和对照 组  A 的 N .B表 达 均 在 1  M FK 8h达 高 峰 。 前期 研 究 表  明,8h 1  培养上清中含有较多的细胞因子 , N —B 而 FK   作 为参 与纤 维化 过程 的细胞 因子 的重要 调控 转 录因  子, 其表达高峰与细胞 因子 的表达高峰相呼应 。因  此, 在实验中应用 1  培养上清作 为条件上清刺激  8h F, B 成功建立体外硅肺纤维化模型。  
应 用 1  8h的 A 培 养 上 清 与 F M B共 孵 育 , 以  并

基因的 K B位点结合 , 导和增强其基 因转录, 诱 其表 

3 %血清组作对照 , 在体外培养不 同时间点 , 处理组 

达产物可有细胞因子、 趋化 因子等 , 在炎症反应和免  疫反应 中起 枢 纽作 用 , 此 在硅 肺 纤 维 化 的形 成 过  因
程中起关键性作用  。   本研究应用 S : i 粉尘刺激硅肺患者后 , M 中  O A N —B阳性表达增强 , 且在 1  FK 并 8h达高峰 ; 未处理
.  

及对照组 A M上清均有较强的促细胞增殖作用 ,B F  爬 片 中 N 。B的表 达在 2  高 峰 ,  达 无差  FK 4h达 3h表
异,h 6 后差异具有统计学意义。因此认为 ,   处理组  和对照组 A M条件上清均能促进 F B的增殖 ; F K  N —B 在 2  达到高峰, 4h 说明 N .B在 F FK B细胞增殖过程  中有表达 , 并且有较高 的表达量 , F 在 B转化过程中  起到了关键作用 ;B中 N —B的表达较 A 的 N 一 F FK M F 

的硅肺患者 A 中 N —B有一定 的基 础表达。提  M FK 示A M具有较强 的活力 , 台盼蓝计 数细胞存活率  在

9 %以上的 A 5 M存 活 , 再次 染尘后活力较强 的 A   M
对 so 粉尘 的刺激 反应较灵 敏。另外在 B L iz A F的 

K B表达高峰推迟。考虑 B L A F中 A 已被激活, M 并 
且有较高的基 础表达量 , F 而 B细胞是未被活化 的 
41  

山东 医药 2 1 0 1年第 5 卷 第 2 期  1 1
细胞 。有学者 认 为 , 纤 维 化 过 程 中 A 活化 后 释   肺 M 参考 文献 :  
[] 才, 1 李 张一宁 , 黄谨 , 器 官纤维化基 础与临床 [ . 民卫 生  等. M] 人
出版社 。03:9 -9 . 20 10 1 1  

放大量细胞因子 , 细胞 因子的基 因转录启动区或增  强子上 均有 N —B 的 D A结 合 位 点 , FK FK N N .B活 化  后 促进 这些 因子 的基 因转 录 , 示 A 的 N —B活  提 M FK 性增强与肺纤维 化关系 密切。并且证 实在 T FB G —  致 纤维 化过程 中 , 虽然 N .B不 能控 制 T FB的基  FK G—
因启 动 子 , N —B能 活 化 转 谷 酰 氨 酶 的启 动子 , 但 FK   而在 组 织 中此 酶是 潜 活 性 T F p的激 活 物 。在 大  G— 鼠F B中发现 N —B存 在并 能被 活 化 , 可 造 成 F   FK 且 B 增 生 J 。因此 F B在 受 到 A 条件 上 清 中 的细 胞 因  M

[] 2 高春芳 , 陆伦根. 纤维化疾病 的基 础与 临床[ . 海科学技术  M] 上 出版社 , 0 : 22 3 2 4 2 -1. 0 1   [ ]C re  .Pt l yo p lo a   b s [ ] m Jp y o, 3 o h E a o g  f u nr f r i J .A    h s l u ho   m yi o s i  
1 9 2 9:   9— 8   9 0, 5 1 5 1 4. 1 1

[] 4 戴令娟 , 候杰 , 黄妹 , 肺纤维化形 成 中 I Ⅲ型 前胶 原的变化  等. 、 [ ] 江苏医药 , 9 , :4 - 7 J. 1 9 2 858 . 9 5 4  [ ] gsn C S iDM, e e z o .I m n  et   l    i  5 A o i   。 i e   Sm n t G m u e f e r e sni o ti vI a  e oc li d - pt epl oa f r i J .C r o i P m M d 1 7 3 5 : a i u nr i o s ] u p  u   e , 9 , ( )  h  m y b 6[ r n l 9
3 -5 , 483 5 

子刺激后 , 导 出较高 的 N .B活性 , FK 诱 FK N —B被激  活后诱导大量细胞 因子产生, 从而促进胶原合成 , 导  致纤维化的进一步形成。  

[] 6 孙铭柱 , 曼, 徐 邹万忠. 肾小管间质纤维化 中转化生长 因子 p 的 l  
表达特征[ ] 中华 肾脏病杂志 , 0 ,6 5 : 1 9 . J. 2 01 ()2 - 5 0 92   ( 收稿 日 : 1-31 ) 期 2 1 -   0 0 7

?

告读者 ?  

《 山东医药》 编委会 ( 内科 ) 2 1 暨 0  1山东省心脑血管疾病  高峰论坛在济召开 
2 1 年 5月 2 01 8日,《 “ 山东医药》 编委会 ( 内科 ) 0 1 东省心脑血管疾病 高峰论坛” 暨2 1 山 在济南舜耕 山   庄召开。编委会副主任 高海清, 山东卫生报刊社 副社长、 山东医药》 《 主编戴 良科 , 山东大学附属省立 医院、  

山东大学齐鲁医院等近 3 O位编委 , 以及全省从 事心脑血管疾病临床 工作的9 0多位特约嘉宾参加 了会议 。  
会上 , 良科 简要介绍 了山东卫生报刊社及《 戴 山东医药》 杂志的发展情 况。他说 近年来面对全 国卫生改 

革与新闻出版体制改革的冲击, 报刊社审时度势, 积极应对 , 山东医药》 《 工作取得 了新的进展 , 些均与卫  这
生厅党组领导、 编委及全省各级 医务工作者支持是分不开的。高海清在会议致辞 中充分肯定 了《 山东医药》   取得的工作成绩 , 他指 出, 山东医药》 《 杂志在促进全省 医学科技发展、 繁荣学术交流、 推动 医学科技进步、 提  高广大医务人 员医疗水平、 培养人 才方面发挥 了重要的作用; 求编委们充分发挥编委的作用, 要 为提 高《   山 东医药》 杂志的学术质量尽职尽责 ; 同时希望《 山东医药》 杂志越办越好 , 努力办成 国内一流期刊。   会上, 山东医药》 《 内科编辑部主任 郭淑文汇报 了近 3年来编辑部在期刊管理 、 质量、 经营、 服务等方面  的工作情况 ; 执行主编孙敬诚 宣读 了新增编委名单, 并发放“ 编委意见调 查表” 广泛征求编委对《 , 山东医药》  
的办刊 意见及 建议 。在 “ 编委 意 见调 查表 ”中, 多编 委 就如 何提 高 办刊 质 量提 出 了宝贵 的 建议 , 许 同时提 出  

每年不定期召开编委会 , 以更加有的放 矢地为《 山东医药》 服务。  

、  

在“0 1山东省心脑血管疾病高峰论坛” , 21 上 山东省介入 心血管病 学术委 员会主任委 员、 山东省立 医院   崔连群教授 , 青岛大学医学院附属心血管病 医院王其新教授分别作 了“ 他汀稳定逆转斑块启示” 高血压  及“
防治面临的挑 战和治疗策略” 的精彩学术讲座 。  

《 山东医药》 创刊于 15 97年, 为山东卫生报刊社主办、 东省卫生厅主管的综合类 医学期刊 , 山 多年 来一  直保持“ 中国科技论文统计源期刊” “ 、 中国综合性 医药卫生类核心期刊” 双核心的荣誉 , 先后被美国《 化学文  摘》 波兰《 白尼索引》 美国《 、 哥 、 乌利希期刊指 南》 及英 国《 国际农业与生物科学研究中心》 等数据库收录。  
本 刊编辑 部 
4  2


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