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RNAi技术沉默Livin基因在肿瘤中的研究进展


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ted later in sep sls of induced by cecaI ligation and puncture in
rats

83

49—56.

[J]。Annals

CliII主cal&Laboratory Science,2007,37(1):

RNAi技术沉默Livin基冈在肿瘤中的研究进展
福建省厦门市第二医院肿瘤科(厦门361026)
【关键词】RNA干扰;肿瘤;基因沉默 【中图分类号】

冯丽华综述陈毅德审校

【文献标识码】A

【文章编号】1002—2600(2010)03一0083一03

肿瘤患者虽经化疗、放疗和综合治疗,但5年生存率仍 很低。如能对肿瘤发病和进展有关的基因进行干预,将能为 肿瘤的治疗开辟新途径。研究发现,Livin基因在许多肿瘤 细胞株和原发性癌组织中呈异常升高表达,而在正常组织中 低或未见表达,提示I,ivin基因作为肿瘤的分子标志物,可 能成为诱导肿瘤细胞凋亡治疗的新靶点。RNA干扰(RNA
interference,RNAi)是新兴的基因治疗方法。近来有关应 用RNAi技术沉默livin基冈的表达而诱导肿瘤细胞凋亡及 其对化疗药物应用敏感性方面取得了可喜的成绩。本文就该

1.2

Livin基因抑制细胞凋亡机制:(1)抑制caspase途径:

Livin基因与介导细胞凋亡的caspase家族中的caspase-3和

caspase_7结合,其中主要是与caspase-3结合,抑制下游级
联反应从而抑制肿瘤细胞凋亡。“vin基因还可与未加工的

或断裂形式的caspase-9结合,可抑制Apaf-l(apoptosis
protein_activating

factor-1)、细胞色素c及dATP诱导的

caspase-9的激活。Livin基因中的BIR结构域能够特异地抑 制或结合caspase,使级联反应中caspase间的相互作用和核
酸的裂解受到抑制,从而导致肿瘤细胞的无限增殖u“。(2)

方面的研究进展作一综述。


激活TAKl/JNKl信号传导途径:Livin基因可激活MAP 激酶JNKl和JNK2,且对JNKl的激活作用远远强于 JNK2,是Livin基因对抗TNh和1CE介导的细胞凋亡作 用的一条重要途径。Livin基因还可与TABl结合,并进一 步激活TAKl。(3)其他途径:部分Livin蛋白可通过BIR 结构域与TNF受体结合,沿NFRl.Tradd—Fadd途径激活 procaspase.8。进而激活caspas争3,诱导细胞凋亡。有研究 发现Livin基因还可以通过诱导NF-KB激活Akt(丝氨酸/
苏氨酸蛋白激酶)途径发挥其抗凋亡作用。 1.3“vin基因在肿瘤表达及意义:Hariu等[5]研究证实,
I。ivin

Livin基因

I。ivin基因是于2000年同时由4个研究小组筛选克隆的 一种新型、有较强抗凋亡功能的lAP家族成员[1。4]。IAP是 一类高度保守的内源性抗凋亡基凶家族表达产物,广泛存在 于许多物种如真核生物、病毒、哺乳动物中,有抑制细胞凋 亡的作用,是一类重要的抗细胞凋亡因子,与肿瘤的发生发 展关系密切。目前,人类1AP家族已发现8个成员,Livin
基因是最晚发现的。
1.1

Livin基因的结构及生物学功能:人类的I。ivin基因位

于人染色体20q13.3,全长4.6 kb,包含7个外显子和6个 内含子[2j。因剪接方式不同其转录产物可分为两种mRNA 亚型(Livina和LivinB),分别含有1 35l和1 297个碱基,
编码含298和280个氨基酸的不同亚型结构的蛋白质;含有

mRNA在人多种类型肿瘤细胞系中高表达。Tanabe

等D)用定量RT-PCR方法检测了38例非小细胞肺癌组织及 15例非癌肺组织,前者Livin阳性表达率显著高于后者
(76.3%vs 6.7%),其中早期肺癌livin的阳性表达率为

IAPs家族成员所特有的凋亡抑制蛋白重复序列(BlR结构 域)和一个羧基端环指结构域(RING结构域)[1]。BIR结 构域主要是影响其抗凋亡的活性。RING结构域不参与抑制 细胞凋亡作用,但对Livin基因在细胞内的合理分布具有重
要的作用。

74.2%。Hariu等¨】发现Livin基因可在许多肺癌细胞株和 原发性肺癌组织中呈异常表达,而在正常的肺组织中却未见 表达,且“vin基因表达与肿瘤的组织类型无关。在化疗药 物耐受的肺癌细胞中Li、,in蛋白表达水平较高。提示“vin 基冈可能作为肿瘤的标记物和肿瘤免疫的靶点。Yagihashi 等【71采用ELlSA法检测37例肺癌患者血清抗I。ivin抗体, 阳性表达率为58%,提示,“vin抗体是一种鉴别肿瘤有价 值的标志物,还可能对患者预后有意义。Yagihashi等邛3用
ELISA法检测46例乳腺癌患者血清中survivin和livin蛋白

许多研究证实。Livin基因有抑制凋亡的功能。Kasof 等[1】将I。ivin基因转染Hela细胞,发现可有效阻断由FADD
(Fas.associated protein with death domain)、DR6
ceptor

(death

re—

6)等诱导的细胞凋亡,且Livin基因抗细胞凋亡的作

用甚至略强于Survivin。Vucic等f3】研究证实,Livin基因对 Fas、DR4及DR5等介导的细胞凋亡具有显著的抑制作用。 Ashhab等H1在研究人Jurkat T淋巴细胞中发现Livin基因 可明显抑制由TNFa及抗CD95抗体诱导的细胞凋亡,其抗 细胞凋亡作用强于Bcl一2,且也证实I,ivina和LivinB的抗细 胞凋亡作用存在一定差异。另外研究还发现,转染I。ivin基 因的癌细胞可一定程度上对抗化疗药物引起的细胞凋亡,表 明“vin基因在肿瘤耐药方面发挥了重要作用D“。

表达情况。发现survivin阳性表达率23.9%。Livin阳性表 达率32.6%,且I』vin表达与survivin表达无相关性,说明 Livin是乳腺癌的重要的肿瘤标志物。Yag.hashi等[91用荧光 定量RT—PCR检测多种消化系肿瘤细胞株,包括胰腺癌细 胞株、胃癌细胞株、结肠癌细胞株以及肝癌细胞株。发现在
胃肠道肿瘤中Livin mRNA过表达,且胃肠道肿瘤患者的血

清中抗Livin抗体也显著增高,说明Livin基因与人消化系 肿瘤的发生有关,预示Livin基因可作为胃肠道肿瘤的一种

万方数据

84

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细胞周期和凋亡的变化,后在转染细胞中加入常规化疗药阿 霉素和顺铂,结果发现,转染后细胞凋亡率增加,细胞周期

新的肿瘤标志。此外,Livin基因在黑色素瘤、膀胱癌、宫
颈癌、前列腺癌、白血病瘤株、原发成神经细胞肿瘤中均有

表达,提示I。ivin基因高表达与肿瘤密切相关。


分布改变,且增加了对化疗药的敏感性,说明合理的联合
livin.RNAi和化疗药可能在非小细胞肺癌的治疗中发挥重要

RNAi技术

RNAi即用核苷酸组成的短的双链RNA(dsRNA)代
替传统反义核酸进行转录后基困沉默,它町高效、特异地阻

作用。Liang等【141在体外化学合成靶向livin的siRNA后以
质粒为载体转染乳腺癌细胞株ZR一75—30,发现转染Iivin- siRNA的细胞livin mRNA表达率明显低于未转染细胞,

断体内特定基因的表达,导致其降解,从而引起生物体内特
异基因的沉默,使细胞表现出某种基因表型的缺失,是近年 来新兴的一种常用的研究基因功能、寻找医学顽症如肿瘤治 疗方法的实验室技术。
2.1

livin蛋白的表达率也明显下降,且加入表阿霉素后细胞凋
亡率较对照组明显增加。表明靶向livin的siRNA联合蒽环

类有望成为livin表达阳性乳腺癌患者的重要治疗方法。 CrnkovbMertens等【”I研究发现,肾癌组织中Livin基因的
表达率为92.9%,相关细胞株中Livin基因的表达率为 80.o%,通过RNAi技术沉默livin基凶后增加了肾癌细胞

RNAi原理:主要是利用dsRNA在细胞内切酶的识

别、结合、酶切下,产生有活性的长度为21~23 nt小分子 干扰RNA片段(siRNA),siRNA和另一些尚未完全确认 的蛋白质结合形成复合物一RNA诱导沉默复合体(RNA— inducedsilencingcomplex,R1SC)。RISC再识别、结合与
siRNA中的反义链互补的同源基因mRNA并使之降解,从

对化疗药如依托泊甙、5一Fu、长春花碱等的敏感性,特别是
在Livin基因表达明显的细胞其作用尤为明显,故认为Livin

基因在肾癌细胞凋亡抵抗中发挥了重要作用,利用RNAi技
术抑制I。ivin基因的表达可增加’肾癌细胞对化疗药的敏感

而抑制该基因的表达,而RISC义可参加下一个RNAi的作
用循环。
2.2

性。Crnkovic—Mertens等I”1还利用RNAi技术抑制肝癌细胞
Livin基因的表达,发现可抑制肝癌细胞的生长,且增加其

RNAi的特点:(1)特异性:RNAi只引起与dsRNA

同源的目的基因mRNA降解,与其他基因无关;(2)高效 性:仅需少景dsRNA就能有效抑制靶基因的表达;(3)
dsRNA长度限制性:引发有效RNAi的dsRNA在21~23 个碱基时才发挥干扰作用;(4)可传播性:RNAi可突破细 胞界限,在细胞群落之间传播;(5)ATP依赖性;在去除 ATP的样品中RNAi现象降低或消失;(6)浓度、时间双

对依托泊甙或TNF-a的敏感性,但发现是livin-口在其中起 作用,而不是livin-a。Lopes等l”I用RT—PCR、原位杂交、 免疫组化等方法检测胰腺癌细胞中IAPs家族的表达情况, 发现许多1APs都表达,其中I知in基因、clAp2、survivin 和xIAP表达明显;同时发现这种过表达与胰腺癌细胞对化 疗药如紫杉醇、阿霉素、顺铂和5一Fu的耐药有关,故认为
抑制这些凋f抑制基因的表达有望成为治疗胰腺癌的一种有

重依赖性:dsRNA诱发的RNAi效应的强度随浓度的增高、
时间的延长而增强。与基因敲除技术相比,后者需较长时间

效治疗方法。所有这些都说明利用RNAi技术沉默Livin基 因可诱导肿瘤细胞凋亡及提高其对化疗药的敏感性。 Livin基因在许多肿瘤细胞中都高表达。而在正常组织 中低表达或未见表达,说明I,ivin基因可能与肿瘤的发生、 发展、预后和耐药有着密切关系,并为肿瘤的早期诊断、基 因治疗和细胞治疗提供新靶点。目前,已有许多实验成功地
应用RNAi技术沉默Livin基因表达,发现可引起肿瘤细胞

才能,解缺失功能基因后的生物学现象,而RNAi则在转染
细胞48 h后即可了解抑制靶基因表达后的生物学现象;与 反义RNA技术相比,RNAi放大效应明显、用量少、抑制 基因表达效果明显。RNAi的发现为基因功能学和基因治疗

学等提供r更为有效的方法,成为近年来分子生物学领域研
究的热点。


RNAi技术沉默Livin基因在肿瘤中的相关研究

凋亡增加,也提高了对化疗药等的敏感性;但还处于实验阶
段,而且许多研究局限于特定的细胞株、特定的肿瘤类型,

目前国内外一些学者已开始利用RNAi技术沉默1ivin 基因表达研究对肿瘤细胞凋亡及其对化疗药等敏感性的影 响,都取得了可喜的成果。crnkovic—Mertens等‘…1用RNAi 技术沉默其I。ivin基因的表达,发现可增加肿瘤细胞对促凋
亡剂如阿霉素或TNFa的敏感性,且和caspase-3的激活有 关,这种作用在I,ivin基因高表达的肿瘤细胞更明显。wang 等[11 3利用RNAi技术沉默LoVo和SPCA一1肿瘤细胞株的

其毒副反应尚不明确、一些具体的反应机理尚不了解等。相 信经过深入的研究,这些问题终将得到解决。针对Livin基 因的RNAi技术在不久的将来能够成为肿瘤治疗的一个新
途径。 参考文献
1 Kasof tein

“vin基因表达后,发现可明显抑制肿瘤细胞的体外增殖能
力,同时也可抑制其体内致瘤性。肿瘤细胞凋亡率增加,也

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I。ivin,a novel inhibitor Biol chem,

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增加了对化疗药的敏感性。crnkovbMertens等fl 2】用RT— PCR方法检测非小细胞肺癌组织标本中Livin基因的表达情
况,发现Livin基因明显表达,同时在许多肺癌细胞株中也 明碌表达;利用RNAi技术沉默I。ivin基因的表达后发现可
3 2

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JH,Deng
inhibitor of

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MI,一lAP。a

no—

增加肺癌细胞对化疗药依托泊甙的敏感性,且在Livin基因 表达率高的细胞中该作用更明显。这些都说明Livin基因在 非小细胞肺癌的凋亡抵抗中发挥重要作用,I。ivin基因有望 成为非小细胞肺癌的一个新的治疗靶点。Yuan等【l 3l构建靶 向Livin基因的RNAi后转染A549和103H肺癌细胞,观察


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Hoppe‘SeyIer F,Butz K.

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索拉非尼应用于胆管癌治疗的研究现状
福建医科大学附属第一医院肝胆胰、腔镜微创外科(福州350004)
【关键词】索拉非尼,胆管癌 【中图分类号】R735.8 【文献标识码】A 【文章编号】1002—2600(2010)03~0085一03

黄发昆1

综述石铮审校

胆管癌是肝胆胰外科常见的恶性肿瘤之一,通常是指原

脲]一苯氧基}吡啶一2一羧酸甲胺,分子量464.8[4]。索拉非 尼具有多重的抗肿瘤作用。胆管癌细胞最常见的基冈突变发 生在MAPK信号通路(即RAS/RAF/MEK通路),变异发 生率超过60%,其中Ras变异率56%、陆Raf变异率 22%[5]。最新的胆管癌基闪和完整的胆管癌微阵列资料分析 研究也证实了这一点。Chunxia wang等收集了全部公开发
表NCBl Pubmed涉及胆管癌新生的基因和完整的胆管癌微

发于胆管系统的癌,包括肝内和肝外胆管癌。胆管癌发病率 约占消化道肿瘤发生率的3%[“,是第二常见的肝脏肿瘤。
多数发生在50~70岁,男性多发[1]。胆管癌高度恶性且预 后不良。

胆管癌的治疗手段仍然非常有限,外科切除和肝移植只 能用于少数患者,大部分患者只能行胆汁引流、放疗和缺乏 统一标准的化疗[2]。吉西他滨和氟嘧啶为基础的化疗方案部 分有效率小于20%,使用该方案的患者中位生存时间约为6 个月。只有不到5%的患者能存活到5年[3]。为此,寻找新
的更有效的化疗药物追在眉睫。本文阐述索拉非尼应用于胆

阵列资料,证实MAPK通路相关基因任胆管癌始终增强[6]。
索拉非尼可通过抑制Raf.1、野生型和V599E突变的BRAf

的丝氨酸和苏氨酸激酶活性。阻断RAS/RAF/MEK/ERK 信号通路,从而阻断细胞周期。诱导肿瘤细胞凋亡。直接抑 制肿瘤细胞增殖[4]。肝癌具有相似的过表达的MAPK,从 而联想索拉非尼在胆管癌治疗中可能具有相似的效果。索拉 非尼可能是针对该信号通路很有前景的治疗药物。其次,索
拉非尼可抑制FI。T3和c—KIT受体酪氨酸激酶活性,抑制肿 瘤细胞的增殖[4]。另外,索拉非尼通过抑制血管内皮生长因

管癌治疗的研究现状。
1索拉非尼的作用机制 索拉非尼(sorafenib),是Bayer和0nyx公司共同研制

的多靶点的生物靶向新药,临床前研究和临床试验提示索拉
非尼具有广泛的抗肿瘤作用。2005年12月获美国FDA批 准上市,2006年末在中国上市。目前用于晚期肾细胞癌和 肝癌的治疗。

子受体和血小板衍生生长因子受体(VEGFR和PDGFR) 而阻断肿瘤新生l血L管的形成,减少肿瘤细胞的营养供应而达
到抑制肿瘤生长的目的[7]。

索拉非尼化学名4一{4一[3(4一氯一3一三氟甲基一苯基)一酰
l福建医科大学2007级研究生

万方数据


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