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生物化学课程论文《RNA干扰——理论发展和应用展望》


RNA 干扰
——理论发展和应用展望
南京大学化学化工学院 131130125 黄若和

摘要
RNA 干扰以及基因沉默是目前分子生物学的一个热门的研究领域, 对于基因工程和医药 研究的发展有着巨大的潜在推动力。RNA 干扰通过对 mRNA 的特异性抑制从而达到高效的 基因沉默,已经显示出了其可能带来医疗技术的突破性发展。本文是对 RNA 干扰的原理、 RNA 干扰与基因沉默的理论发展、其在未来可能的应用发展进行的简要综述。

Abstract
RNA interference (RNAi) and Gene Silence are one of the most favorite research fields in molecular biology, RNAi has great potential in the development of the Genetic Engineering and Medical Research. RNAi can make effective Gene Silence through the specific inhibition on mRNA, so it has shown that it can bring a great breakthrough in medical technology. This essay is a brief review on the theory of RNAi and its developments in theories and applications.

正文
I 概述
RNA 干扰(RNAi)主要是指外源性的双链 RNA(double-stranded RNA, dsRNA)在体内引 发的基因沉默( Gene Silence )现象 1 。 RNAi 是一种序列特异性的转录后基因沉默机制 (post-transcriptional gene silence, PTGS) ,其在生物体中是普遍存在的2。 RNAi 的作用机制可概括如下: dsRNA 进入细胞后, 通过 ATP 依赖性 RNA 酶 III (Dicer,DCR) , 变为含 21-25bp 的 siRNA(short-interference RNA) ;siRNA 是引发核酸酶降解 mRNA 的引导 物, 并与 AGO (Argonaute) 蛋白结合形成 RNA 诱导沉默复合体 (RNA-induced silencing complex, RISC) ,RISC 对 siRNA 解链放出反义 RNA 并与对应的 mRNA 结合,使其内源性降解;在靶 mRNA 被降解后,RISC 继续靶定其他的 mRNA。 同时,有些情况下还会产生扩增效应:siRNA 或其反义 RNA 可通过依赖于 RNA 的 RNA 聚合酶(RNA-dependent RNA Polymerase, RdRP)与靶 mRNA 互补的 RNA(cRNA)共同重新 合成 dsRNA,并通过上述机制生成次级 siRNA。通过扩增效应,mRNA 的表达会得到完全的 抑制,这也是 RNAi 高效的原因之一。 除了通过 siRNA 外, 在生物体内还发现了另一种 RNAi 机制: 微小 RNA (microRNA, miRNA) ,
1 2

RNA 干扰:原理与应用,P.3,汤华,科学出版社,2006 RNA 干扰技术:从基础科学到药物开发,P.3, (美)Appasani K 主编,殷勤伟等译,科学出版社,2007

miRNA 是由一种内源性发夹 (hairpin) 结构转录产物经 DCR 加工得到的单链 RNA, 并与 AGO 蛋白结合生成 miRNA-蛋白复合物(miRNA-protein complex, miRNP) ,通过与靶 mRNA 结合阻 碍其翻译,达到基因沉默的目的。

(图 1:RNAi 的作用机制)3 RNAi 理论虽然是从 1990 年代才开始发展,但它却逐渐受到人们的重视。1998 年在 《Nature》 上共同发表论文4正式提出 RNAi 理论的 Andrew Fire 和 Craig C Mello 被授予了 2006 年诺贝尔生理学或医学奖,以表彰他们在基因技术的使用方面提供了“令人激动的可能性”、 发现了一种有效中止有缺陷的基因运传的机制、 这为研发控制这种基因和与疾病作斗争的新 药提供了可能性。 从 RNAi 的作用机制中可以看出, 由于 siRNA 或 miRNA 对 mRNA 有着特异性的选择和高 效的抑制能力,只要能够确定所要作用的 mRNA 或对应的基因,就可以针对性地抑制 mRNA 的基因表达,同时也会将其对其他基因表达的影响降至最低。利用这一点,可以发展很多的 治疗技术,用于治疗目前难以治疗的由 RNA 病毒所引起的疾病,或者一些由于非人体所需 的基因表达所导致的疾病比如癌症。 RNAi 同样也是一项潜力巨大的基因工程技术。相比较传统的基因敲除、转基因以及突 变技术,RNAi 更加简易可行,并可用于较大规模的基因功能分析,对于基因工程的实验技 术发展有着潜在的巨大推动力。

3

Derek MD, Carl DN, Phillip A. Killing the messenger: Short RNAs that silence gene expression.Nature, 2004, 431: 343~349 4 Fire A, Xu S, Montgomery MK. Potentandspeci?c geneticinterferenceby double-strandedRNAin Caenorhabditiselegans. Nature, 1998, 391:806~811

II

Dicer 酶

2001 年,Bernstein 从果蝇体内分离出一种能够特异性地切割 dsRNA 的多蛋白核糖核酸 酶,并命名为 Dicer(DCR) 。Bernstein 发现一种 CG4792 酶(Dicer-1)可以将 dsRNA 全部切 割成 22 个碱基长度的 RNA 片段,他认为这种酶与 RNAi 有着很大的相关性5。 DCR 的结构中主要包含了三个结构域:以α 螺旋为主的 RIIIa 结构域和 RIIIb 结构域,以 6 及包含α 螺旋和β 折叠的 PAZ 结构域 。

(图 2:鞭毛虫的 DCR 结构)7 这三个结构域中 RIIIa 结构域和 RIIIb 结构域通过切断 dsRNA 中的磷酸二酯键来将 dsRNA 剪切为 siRNA,而 PAZ 结构域则在识别 dsRNA 时起到关键的作用。 在 DCR 剪切模型的发展中,仍存在着不同的看法。一种是 Blaszczyk 于 2001 年提出的包 含两个活性中心的 DCR 模型;另一种是 Zhang、Kolb 等于 2004 年提出的包含一个活性中心 的 DCR 模型。 在 Blaszczyk 模型中,两个活性中心都与Mg2+或Mn2+配位,由二价金属离子辅助剪切 dsRNA 中的两个磷酸二酯键。该模型是建立在对细菌的 Aa-RNase III 结构域进行 X 射线晶体 结构研究的基础之上的, 发现两个 Aa-RNase III 可以首尾相连共同剪切一个 dsRNA, 产生 9bp 8 的 siRNA 产物。 在 Zhang 模型中, DCR 中只含有一个 dsRNA 剪切的活性中心, 由同一 DCR 分子中的 RIIIa 结构域和 RIIIb 结构域组成。活性中心仍然与Mg2+或Mn2+配位,不过与 Blaszczyk 模型不同 的是,在剪切第二个磷酸二酯键时 dsRNA 会由原位置旋转约30° ,由 PAZ 结构域重新识别后 9 再剪切。

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Bernstein E, Caudy AA, Hammond SM. Role for a bidentateribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature, 2001, 409: 363~366 6 MacRae IJ, Zhou K, Li F. Structural Basis for Double-Stranded RNA Processing by Dicer. Science, 2006, 311:195~198 7 MacRae IJ, Zhou K, Li F. Structural Basis for Double-Stranded RNA Processing by Dicer. Science, 2006, 311:196-Fig.2 8 Blaszczyk J, Tropea JE.Crystallographic and Modeling Studies of RNase III Suggest a Mechanism for Double-Stranded RNA Cleavage. Structure, 2001, 9:1225~1236 9 Zhang H, Kolb FA. Single Processing Center Models for Human Dicer and Bacterial RNase III.Cell, 2004, 118:57~68

(图 3:DCR 剪切 dsRNA 的模型)10

III

RISC

RNA 诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex, RISC)是在 RNAi 的最后阶段中起 到剪切降解靶 mRNA 作用的关键反应物。RISC 是由 siRNA 或 miRNA 与 AGO(Argonaute)蛋 白形成的复合体, 其组装经由 RISC 装载复合体 (RISC loading complex, RLC) , 使 siRNA 与 AGO 蛋白组合。而 RISC 对靶 mRNA 的剪切则是通过 AGO 蛋白的 PAZ 结构域的识别以及 PIWI 结 构域及剪切完成的。 目前也有研究表明在细胞核中也有 RNAi 的相关成分参与了 DNA 甲基化等反应, 其中有 与 RISC 类似的 RNA 诱导的转录性基因沉默启动复合体 (RNA-induced transcriptional silencing 11 complex, RITS)的存在 ,说明 RISC 在 RNAi 中具有重要的地位。 AGO 蛋白中的主要活性区域是 PAZ 和 PIWI。 PAZ 结构域对于 3′端单链结构的单链 RNA 和 dsRNA 具有强烈的亲和作用,因此可以识别 siRNA 以及 mRNA。而在 PIWI 结构域中具有 一个剪切 mRNA 的活性中心,可以切断 mRNA 的磷酸二酯键,在这个活性中心处,siRNA 与
10

MacRae IJ, Zhou K, Li F. Structural Basis for Double-Stranded RNA Processing by Dicer. Science, 2006, 311:197-Fig.4 11 Craig C. Mello, Darryl Conte Jr.Revealing the world of RNA interference. Nature, 2004, 431:338~342

mRNA 互补配对。

(图 4:人类 AGO-2 蛋白结构)12 RISC 的组装模型至今没有定论,不过基本上都是通过 RLC 中间复合体进行的,RLC 是由 剪切 dsRNA 的 DCR 和 siRNA/miRNA 与 AGO 蛋白结合的中间体, 再解离出 DCR 和 RISC。 在不 同的生物体中,组装的模式和参与组装的底物也不同。

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Elkayam E, Greene EM.

The Structure of Human Argonaute-2 in Complex with miR-20a.

Cell, 150:100~110

(图 5:可能的 RISC 组装模型)13 2004 年,Song 在研究激烈火球菌(Pyrococcusfuriosus)AGO 蛋白晶体结构的基础上提 出了一种可能的 RISC 剪切模型。 他发现在 AGO 蛋白中 PAZ 和 PIWI 结构域中有可能容纳底物 的沟槽状结构, PAZ 和 PIWI 分别位于这个沟的两侧, Song 推测 PAZ 识别 siRNA 后会诱导 siRNA 以及与其互补的靶 mRNA 进入沟,并在 PIWI 的活性中心处将靶 mRNA 的磷酸二酯键切断, 达到抑制靶 mRNA 表达的作用。

(图 6:可能的 RISC 剪切模型)14
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Tang G. siRNA and miRNA: an insight into RISCs. TRENDS in Biochemical Science, 2005, 30:106~114 Song JJ, Smith SK, Hannon GJ. Crystal Structure of Argonaute and Its Implications for RISC Slicer Activity. Science, 2004, 305:1434~1437

IVRdRP
依赖于 RNA 的 RNA 聚合酶(RNA-dependent RNA Polymerase, RdRP)普遍存在于真菌、 植物以及线虫中,对于这些生物体中的 RNAi 是必须的,RdRP 可以以 siRNA 为底物合成新的 dsRNA。

(图 7:脊髓灰质炎病毒的 RdRP 结构)15 图 7 中是一种典型的 RdRP 的结构图, 其蛋白质结构中主要是α 螺旋结构。 RdRP 的作用 是将游离的 siRNA 与靶 mRNA 结合,并以此为模板聚合成新的 dsRNA。而新的 dsRNA 再通 过 DCR 剪切形成 siRNA(次级 siRNA) ,次级 siRNA 又可以通过 RdRP 再一次进行该反应,因 此可以通过这种扩增机制产生大量的 siRNA,使得靶 mRNA 得到完全抑制。 这里值得注意的一点是,由于 RdRP 用 siRNA 和靶 mRNA 为模板,而 siRNA 的长度明显 小于靶 mRNA,因此合成的 dsRNA 被 DCR 剪切形成的次级 siRNA 不仅仅是原 siRNA,还会包 含原 siRNA 的上游序列或者下游序列。 这些次级 siRNA 所靶定的 mRNA 的区域可能并非原来 所期望的区域,因此产生了过渡性 RNAi(transitive RNAi) 。不过,所有的次级 siRNA 所抑制 降解的仍是原靶 mRNA,因此过渡性 RNAi 并不会使 RNAi 发生错误。

15

Hansen JL, Long AM, Schultz SC. 1997, 5:1109~1122

Structure of the RNA-dependent RNA polymerase of poliovirus.

Structure,

(图 8:过渡性 RNAi 机制)16

VRNAi 在医疗中的应用
由于 RNAi 在疾病预防和治疗领域表现出巨大潜力,从这一现象发现开始,就不断有大 量的研究将 RNAi 应用于医疗, 虽然 RNAi 仍然是一个比较新的领域, 但是其在医疗方面的应 用已经出现了不少令人期待的成果。 目前 RNAi 已被应用于 HIV 病毒的预防的治疗,在 2008 年,Priti Kumar 在《Cell》上发 表论文称观察到细胞外导入的 siRNA 可以有效地抑制 HIV-1 病毒对 T 细胞的感染17。 2002 年,Lassus 等人用 RNAi 技术分别沉默了 Caspase-1 和 Caspase-2 的基因表达,发现 Caspase-2 蛋白质水平降低后可以降低由于药物造成 DNA 损伤导致的细胞凋亡18。由于细胞 凋亡与器官功能衰退以及恶性肿瘤的形成有着密切的联系,因此 RNAi 技术也有望应用于治 疗器官衰竭和恶性肿瘤。

VI

RNAi 在基因工程中的应用

目前已经发现了 4 种在细胞基因组水平发挥作用的 dsRNA 介导途径,分别为 RNA 指导 的 DNA 甲基化(RNA-directed DNA methylation, RdDM) 、RNAi 介导的异染色质的形成、DNA 19 切除以及减数分裂性沉默 。 应用 RNAi 可以将特定的 mRNA 的基因表达沉默,因此很适合用于遗传学研究,只要筛 选出靶 mRNA 对应的 siRNA,就可以通过细胞外导入 siRNA 来达到基因沉默的目的,这样可 以很方便地观察某个基因的功能,同时也不会对其他的基因和细胞功能产生影响。

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Nishikura K. A Short Primer on RNAi: RNA-Directed RNA Polymerase Acts as a Key Catalyst. Cell, 2001,107:415~418 17 Kumar P, Kim SS. T Cell-Specific siRNA Delivery Suppresses HIV-1 Infection in Humanized Mice. Cell, 2008, 134:577~586 18 Lassus P. Requirement for Caspase-2 in Stress-Induced Apoptosis Before Mitochondrial Permeabilization. Science, 2002, 297:1352~1354 19 RNA 干扰:原理与应用,P.124,汤华,科学出版社,2006

(图 9:RNA 指导的 DNA 甲基化)20

References
I 参考书目
1 2 RNA 干扰:原理与应用,汤华,科学出版社,2006 RNA 干扰技术:从基础科学到药物开发,P.3, (美)Appasani K 主编,殷勤伟等译,科 学出版社,2007

II 参考文献
1 2 3 4 5 6 Derek MD, Carl DN, Phillip A. Killing the messenger: Short RNAs that silence gene expression. Nature, 2004, 431: 343~349 Fire A, Xu S, Montgomery MK. Potentandspeci?c geneticinterferenceby double-strandedRNAin Caenorhabditiselegans. Nature, 1998, 391:806~811 Bernstein E, Caudy AA, Hammond SM. Role for a bidentateribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature, 2001, 409: 363~366 MacRae IJ, Zhou K, Li F. Structural Basis for Double-Stranded RNA Processing by Dicer. Science, 2006, 311:195~198 Blaszczyk J, Tropea JE.Crystallographic and Modeling Studies of RNase III Suggest a Mechanism for Double-Stranded RNA Cleavage. Structure, 2001, 9:1225~1236 Zhang H, Kolb FA. Single Processing Center Models for Human Dicer and Bacterial RNase III. Cell, 2004, 118:57~68
Craig C. Mello, Darryl Conte Jr.Revealing the world of RNA interference. Nature, 2004, 431:338~342

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Craig C. Mello, Darryl Conte Jr. Revealing the world of RNA interference. Nature, 2004, 431:338~342 Elkayam E, Greene EM. The Structure of Human Argonaute-2 in Complex with miR-20a. Cell, 150:100~110 Tang G. siRNA and miRNA: an insight into RISCs. TRENDS in Biochemical Science, 2005, 30:106~114 Song JJ, Smith SK, Hannon GJ. Crystal Structure of Argonaute and Its Implications for RISC Slicer Activity. Science, 2004, 305:1434~1437 Hansen JL, Long AM, Schultz SC. Structure of the RNA-dependent RNA polymerase of poliovirus. Structure, 1997, 5:1109~1122 Nishikura K. A Short Primer on RNAi: RNA-Directed RNA Polymerase Acts as a Key Catalyst. Cell, 2001,107:415~418 Kumar P, Kim SS. T Cell-Specific siRNA Delivery Suppresses HIV-1 Infection in Humanized Mice. Cell, 2008, 134:577~586 Lassus P. Requirement for Caspase-2 in Stress-Induced Apoptosis Before Mitochondrial Permeabilization. Science, 2002, 297:1352~1354 Meister G, Tuschl T.Mechanisms of gene silencing by double-stranded RNA. Nature, 2004 431:343~349 Bartel DP. MicroRNAs: Genomics, Biogenesis, Mechanism, and Function. Cell, 2004, 116:281~297 TijstermanM, Ronald H.A. Plasterk. Dicers at RISC: The Mechanism of RNAi.


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