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蛋白纯化综述


蛋白纯化概述
疫苗生产中, 一个重要的工业流程便是蛋白质的纯化, 而有关蛋白质纯化的 研究,众多科学家从来没有间断过。在搜集了很多的资料后,现将有关蛋白质纯 化的基本知识概括介绍一下。本综述介绍了蛋白纯化的常用方法,对每种纯化方 法的原理以及蛋白质的分离原则等进行了分析。

蛋白质纯化的依据
蛋白质纯化主要利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染, 利用各 蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。每种蛋白间的性质都会有差 异,利用这些差异可将蛋白从混合物提取出来得到目的蛋白。具体说来,蛋白质 的以下性质均可以作为纯化的依据: 大小 蛋白质的大小各不相同,从只含几个氨基酸的小肽(分子量只有几百 道尔顿)至含有 10000 多个氨基酸的巨大蛋白质(分子量超过 1000000 Da)不等。 多数蛋白质的分子量在 10000~150000Da 之间。 形状 蛋白质的形状有近似球状的,也有很不对称的。蛋白质在离心通过 溶液运动时,或通过膜、凝放过滤境料颗粒或电泳凝胶中的小孔运动时,都会受 到它的形状的影响。例如,考虑两种质量相同的单体蛋白质,一种是球状的,另 一种是雪茄状的。在甘油梯度离心时,球状蛋白质具有较小的有效半径(斯托克 斯半径),因而通过溶液沉降时遇到的摩擦力较小。这样,它就会沉降得较快而 显得比雪茄状蛋白质大。反之,在大小排阻层析时,上述斯托克斯半径较小的球 状蛋白质更容易扩散入凝胶过滤填料颗粒的小孔内,较迟洗脱出来,因面显得比 雪茄状蛋白质要小。 电荷 蛋白质的净电荷取决于氨基酸残基所带正、负电荷的总和。一种蛋 白质中,若天冬氨酸和谷氨酸残基占优势,在 pH 7.0 时带净负电荷,则称之为 酸性蛋白质;若赖氨酸和精氨酸残基占优势,则认为是碱性蛋白质。 等电点 等电点(pI)是蛋白质上净电荷为零时的 pH 值,由蛋白质上带正、负 电荷的氨残基数目和滴定曲线所决定。 电荷分布 带电荷的氨基酸残基可均匀地分布于蛋白质的表面, 亦可成簇地 分布,使某一区域带强正电荷而另一区域带强负电荷。这种非随机的电荷分布可 用来鉴别蛋白质。 疏水性 多数疏水性氨基酸残基藏在蛋白质的内部,但也有一些可见于表面。 蛋白质表面的疏水性氨基酸残基的数目和空间分布决定了该蛋白质是否具有与 疏水柱填料结合从面利用它来进行分级分离的能力。 溶解度 蛋白质在不同溶剂中的溶解度有很大不同,从基本不溶直至极易溶

解不等。影响蛋白质溶解度的可变因素包括 pH、离子强度、离子的性质、温度 相溶剂的极性。蛋白质在其等电点处一般较不易溶解。 密度 多数蛋白质的密度在 1.3—1.4g/cm3 之间,分级分离蛋白质时一般不 常用这个性质。不过,含有大量磷酸盐(如卵黄高磷蛋白,密度为 1.8)或脂质部 分(如脂蛋白,密度为 1.03)的蛋白质,与一般蛋白质相比,在密度上确有不同, 用密度梯度法可将它们从大部分蛋白质中分离出来。 配体结合能力 有许多酶能相当紧地与底物、效应分子、辅助因子和 DNA 模板结合。这种结合的亲和性可用来将酶结合于已固定有相应配体或模板的柱 上。 金属结合能力 有许多酶能相当紧地与某些金属离子结合,这通常是通过与 胱氨酸或组氨酸残基相互作用完成的。 翻译后修饰 据。 特殊性质 某些蛋白质还有一些不寻常的性质,可在蛋白质纯化时加以利 用。一个例子是不寻常的热稳定性。大多数蛋白质加热到 95℃时会解折叠和凝 结或沉淀。利用这一性质,可容易地将一种经这样热处理后仍保持其可溶性和活 性的蛋白质从大部分其他的细胞蛋白质中分离出来。 基因工程构建的纯化标记 重组表达蛋白质中,通过在蛋白质氨基端加入 6~10 个组氨酸,可以使蛋白质与 Ni2+螯合柱紧密结合,后通过游离咪唑或者降 低 pH 至 5.9,而使这种蛋白质得以纯化。 许多蛋白质在合成后还要通过加入糖基、酰基、磷酸基团或 种种其他部分来进行修饰。在许多情况下,这些修饰提供了可用于分级分离的依

蛋白质纯化方法
蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段。 粗分离阶段主要 将目的蛋白和其他细胞成分如 DNA、RNA 等分开,由于此时样本体积大、成分 杂,要求所用的树脂高容量、高流速,颗粒大、粒径分布宽.并可以迅速将蛋白 与污染物分开,防止目的蛋白被降解。精细纯化阶段则需要更高的分辨率,此阶 段是要把目的蛋白与那些大小及理化性质接近的蛋白区分开来, 要用更小的树脂 颗粒以提高分辨率,常用离子交换柱和疏水柱。 预处理 在很多蛋白纯化过程中, 首先要将宿主细胞破碎或者将发酵液浓缩, 此过程 称为预处理。细胞破碎一般有机械法和非机械法,机械法一般有高压匀浆法、超 声破碎法、高速珠球磨法、高压挤压法,非机械法包括酶溶法、化学渗透法、热 处理法、渗透冲击法等。分离细胞碎片一般可以用离心、膜过滤或双水相分配的 方法。将发酵液浓缩,可以使用超滤膜进行超滤,方便后续流程的处理,目前常

用的为切向流过滤。 蛋白粗级分离 实验室进行蛋白纯化,第一步经常使用蛋白沉淀法将蛋白沉淀后离心或过 滤,将蛋白质与其他的杂质快速分离。蛋白质沉淀法常使用硫酸铵沉淀,蛋白质 沉淀在硫酸铵中比较稳定,也可以使用 PEG 尽心蛋白沉淀,通过提高冷的蛋白 溶液中 PEG 的浓度,是蛋白质沉淀出来。蛋白沉淀只能达到几倍的纯化效果, 需要进行后续的精细纯化得到目的蛋白。 层析纯化 层析纯化可以将目的蛋白从复杂的蛋白质溶液中分离出来, 因此常用于蛋白 的精细纯化。常用的层析纯化包括:离子交换层析、疏水层析、亲和层析、凝胶 过滤层析等。 离子交换层析是以离子交换剂为固定相, 依据流动相中的组分离子与交换剂 上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。 离子交换剂是一类具有高交换功能的高分子材料, 功能基是由固定在骨架上的带 电基团与可进行交换的离子(称为反离子) 。反粒子可以溶液中带同种电荷的离 子进行可逆性交换,在一定条件下,被交换的离子被解吸,离子交换剂又恢复到 原来的形式。离子交换层析纯化生物大分子有两种方式:一是将产物离子化,然 后被交换到介质上,杂质不被吸附而从柱中流出,适用于处理目的产物浓度低、 工作量大的溶液。二是将杂质离子化,目的产物不被交换而直接流出,适用于产 物浓度高的工作液。在某个特定的 pH 下不同的蛋白所带电荷数不同,与离子交 换剂的结合力也不同,随着缓冲液中盐浓度的增加或 pH 的变化,蛋白按结合力 的强弱被依次洗脱 。在工业化生产中更多地是改变盐浓度而不是去改变 pH 值, 因为前者更容易控制。由于工业生产中盐浓度很难精确控制,所以在洗脱时常用 分步洗脱而不使用连续升高的盐梯度。 离子交换层析特异性好, 有众多的参数可以调整已获得最优的纯化效果, 但 是即使用最精确的控制条件,仅用离子交换层析的方法也无法得到纯蛋白,还需 要后续的纯化方法。 亲和层析利用固定化配基与目的蛋白之间特异的生物亲和力进行吸附, 如抗 体与抗原、受体与激素、酶与底物或抑制剂之间的作用。在亲和层析中起可逆结 合的特异性物质称为配基,与配基结合的支撑物称为载体。亲和层析的过程大致 为:1、配基固定化,选择合适的配基与不溶性的载体结合成具有特异性的分离 介质;2、分离介质选择性的吸附目的蛋白质,杂质与分离介质没有亲和力而不 被吸附,被洗涤除去;3、选择合适的条件,将目的蛋白从亲和介质中解吸下来。 亲和层析选择性强,在产物纯化中具有较大的潜力,成功的关键在于控制好配基

的脱落问题。 凝胶过滤层析(gel filtration chromatography) 主要是根据蛋白质的大小和形 状,即蛋白质的质量进行分离和纯化。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结 构物质, 多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质, 小分子物质能进入其内部, 在柱中慢慢移动,而大分子物质却被排除在外部,快速移动,当一混合溶液通过 凝胶过滤层析柱时,溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。凝胶过滤层析主要 用于两个方面:1、用于蛋白质分离过程中的脱盐和更换缓冲液;2、用于蛋白质 分子的分级分离。 疏水层析主要利用蛋白质分子表面上的疏水区域 (非极性氨基酸的侧链, 如 丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和苯丙氨酸)和介质的疏水基团(苯基或辛基)之间 的相互作用,不同蛋白质分子的疏水性不同,疏水作用力的大小也不同,当降低 盐离子浓度时,蛋白质逐步恢复自然状态,疏水作用力减弱,蛋白质分子被洗脱 出来。疏水性树脂的选择性是由疏水性配基的结构决定的,常用的直链配体为烷 基配体(alkyl ligands)和芳基配体(arylligands),链越长结合蛋白的能力也越强。理 想树脂种类的选择应根据目的蛋白的化学性质而定,不能选择结合力太强的树 脂,结合力太强的树脂会很难洗脱,所以开始时应选用中等结合力的苯基树脂探 讨条件。 反向层析(RPC)与疏水层析一样,基于生物分子与配基间疏水基团的相互 作用来进行分离。反向层析填料疏水取代更多,吸附力更强,通常需要用有机溶 剂洗脱。主要用来分离肽类、分子量小于 25000 的蛋白以及其他在水相、有机相 都稳定的生物小分子。 层析法进行蛋白纯化时, 层析的次序选择很重要, 合理的层析次序能提高分 离效率,同时有利于各个步骤间的过渡。当几种方法连用时,最好以不同的分离 机制为基础,经前一种方法处理的样品能适应后一种纯化方法。

蛋白纯化原则
良好的蛋白纯化策略,具有以下的特点:1、良好的稳定性和重复性。步骤 之间尽量能衔接,减少工艺的步骤,工艺与设备相互匹配。3、技术条件温和, 能保持产物的生物学活性。4、工艺过程中尽可能少用试剂,避免增加分离纯化 步骤。5、周期尽量短。6、目的蛋白选择性好,能从复杂的混合物中将产物有效 的分离出来。7、工艺和技术快速高效,易操作,能耗低。8、较高的安全性。保 证产品质量和作用安全以及生产过程的安全。


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