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LPS诱导巨噬细胞凋亡的研究


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中华微生物学和免疫学杂志 2003 年 7 月第 23 卷第 7 期  Chin J Microbiol Immunol , July 2003 , Vol 23 , No . 7

·基础免疫学·

LPS 诱导巨噬细胞凋亡的研究
黎庶   汪正清
【 摘要 】 目的  探讨脂多糖( LPS) 诱导巨噬细胞发生凋亡的分子机理及信号传导通路 。 方法   采用夹心 ELISA 法检测巨噬 细胞 NF -κ B 的核内浓度 ; 硝酸还原酶法 测定细胞培养液中 NO 含量 ; 吖啶 橙荧光染色及凋亡电泳试验显示巨噬细胞凋亡情况 。 结果  LPS 刺激可诱导巨噬细胞的 NF κ B 活化 、 NO 分泌并最终导致细胞凋亡 , 而特异性 PKC 抑 制剂( Cal C) 和 NF -κ B 阻 断剂( PDTC) 能 在不同 程度上 抑制 LPS 的生物活性作用 。结论  LPS 诱导 肺巨噬细胞凋亡的信号传导通路有 PKC 、NF -κ B 的参与 , 而 NO 等生物活性介质在其中发挥了重要作用 。 【 关键词 】 脂多糖 ; 巨噬细胞 ;细胞凋亡 ; 信号传导 Study on the mechanism of LPS -induced apoptosis in macrophage  LI Shu , WANG Zheng-qing . Department of Microbiology , Third Military Medical University , Chongqing 400038 , China Corresponding author :WANG Zheng-qing , E-mail :wzq @mail . tmmu . com . cn 【 Abstract 】 Objective  To study the molecular mechanism and signal transduction pathway of LPS -induced macrophage apoptosis .Methods  NF -κ B level in nuclear protein extraction of AMs ( alveolar macrophage) was detected with sandwich ELISA , NO content in cell culture medium was quantified with nitric acid reductase as say . Morphologic change of AMs in apoptosis observed with acridine orange ( A. O)staining and apoptotic fragmentation at genome DNA of AMs detected with electrophoresis assay . Results  LPS -induced NF -κ B activation and NO production of AM s which cause apoptosis were decreased and inhibited by the pretreatment of Cal C ( calphostin C) and PDTC ( pyrrolidine dithiocarbamate).Conclusion PKC ( protein kinase C), NF -κ B and NO are involved in the signal transduction pathway of LPS-induced macrophage apoptosis . 【 Key words 】  Lipopoly saccharide ; Macrophage ; Apoptosis ; Signal transduction

   G 菌感染及其引起的败血症 、 全身性炎症应答 综合征 ( systemic inflammatory response syndrome , SIRS) 等严重疾患 , 是临床上危重患者死亡的重要原因之 一 。 位于 G 菌外膜 中的脂多 糖( lipopolysaccharide , LPS) , 亦称内毒素 , 是其致病的主要物质基 础 。 LPS 通过持续刺激机体单核巨噬细胞系统 , 使之产生大 量的细胞因子 、活性氧 、 溶酶体酶 、 NO 等生物活性物 质 , 引起细胞损 伤和凋亡 , 最终导致失控 性炎症反 应 。 但 LPS 致病的确 切途径及 机制至 今仍不 太明 确 。 本实验以体外培养的大鼠肺泡巨噬细胞( alveolar macrophage , AM) 为研究对象 , 用 LPS 刺激诱导 AM 凋亡并同时采用蛋白激酶 C( protein kinase C , PKC) 的 特异性抑制剂 ( calphostin C , Cal C) 及核转录因子κ B ( nuclear factor-kappa B , NF-κ B) 阻 断剂 — — —咯啶二硫 氨基甲酸酯 ( pyrrolidine dithiocarbamate , PDTC) 进行抑 制试验 , 观察 NFκ B 活化 、 NO 表达与 AM 凋亡的关 系 , 力求阐述 PKC 、 NFκ B 在内 毒素诱导 AM 活化及 细胞凋亡中的作用及分子机理 , 为 G 菌感染后内毒
作者单位 : 400038 重庆 , 第三军医大学微生物学教研室 通讯作者 : 汪正清( E -mail : wzq @ mail . tmmu . com . cn)

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素诱发的失控性炎症反应等的防治提供一定的实验 依据 。 材料和方法 大鼠肺巨噬细胞的分离 培养 : 雄性 Wistar 大鼠 ( 本校动物中心 , 体重 180 ~ 200g ) , 无菌条件下行气 管插管 。 用 4 ℃预冷的 Hanks 液 6 ~ 10ml 反复灌洗 肺部 , 收集灌洗液 , 以 2 500r min 离心 15 min 沉淀细 胞 , 并以 RPMI 1640 培养基 重悬 。 台盼 蓝染色证实 活细胞比例 >95 %, 瑞 氏染色法证实肺巨噬细胞比 例> 90 %者用于实验 。 将细胞密度调至 10 ml , 接种 于细胞培养板上 , 置 37 ℃、 5 % CO2 的孵箱中孵育 , 待 巨噬细胞贴壁生长后进行实验 。 实验分组 : 根据预实验结果 进行实验分组 。 实 验共分 4 组 : ① 正常对照组 , 此组细胞不接受任何刺 激; ② LPS( Sigma) 处理组 , 用 1mg L LPS 作用 60 min , 检测细胞 NF-κ B 的核内浓度 , 培养 24 h 后测定培养 液中 NO 含量 ; ③ Cal C( Sigma) 阻断组( Cal C +LPS ) , 以 300nmol L Cal C 预处理 30 min 后 , 再用 1mg L LPS 刺激 60 min , 检测细胞 NF-κ B 的核内浓度 , 培养 24 h
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后测定培养 液中 NO 含量 ; ④ PDTC ( Sigma ) 阻 断组 ( PDTC + LPS) , 以 200μ mol L PDTC 预处理 30 min 后 , 再用 1mg L LPS 刺激 60 min , 检测细胞 NFκ B 的核内 浓度 , 培养 24 h 后测定培养液中 NO 含量 。 夹心 ELISA 检测细胞核内的 NF -κ B 含量 巨噬细胞核蛋白的提取 : 参照文献〔1〕的方法 , 稍加改动 。 即于 4 ℃ 以 2 500r min 冷冻离心 10min 沉 淀细 胞 , 加 入 850μ l 裂 解液 A ( 10mmol L HEPESNaOH , pH7 . 9、 10mmol L KCl 、 0. 1mmol L EDTA 、 2mmol L MgCl2 、 1mmol L DTT 、 1mmol L PMSF 、 5mg L leupeptin 及 2mg L pepstain) 重悬细胞 , 放置冰上 15 min 后加入 10 % NP-40 25μ l , 涡动 10 s 。 于 4 ℃ 以 12 000r min 冷 冻离心 5 min , 收集沉淀的细胞核小团 , 加入 50μ l裂 解液 B ( 20mmol L HEPESNaOH , pH7 . 9 、25 %甘 油 、 0. 42mol NaCl 、1mmol L EDTA 、1mmol L DTT 、0 . 5mmol L PMSF 及 5mg L leupeptin) 放置冰上 30 min 。 于 4 ℃ 以 12 000r min 冷 冻离心 10 min , 收集 上清 ( 含 核蛋 白) , 于70 ℃储存 。 采用 Lowry 法测定核蛋白浓度 。 ELISA 测定 : 参照文献 〔2〕, Sandwich ELISA 法定 量测定 NF-κ B。 一氧化氮测定( 硝酸还原酶法) : 选用南京建成 生物工程研究所提供的一氧化氮检测试剂盒进行测 定。 细胞凋亡的观察 吖啶橙染色观察细胞凋亡的形 态学改变 : 参照 文献〔3〕的方法 , 稍作修改 。 凋亡细胞基因组 DNA 的提取 : 参 照文献〔4〕所 示方法 , 稍作修改 。 DNA 浓度的测定及凋亡电泳 : 用 Bio-Rad SmartTM Spec 3000 型分光光度计测定基因组 DNA 浓度 。 各 标本取等量加入 1 . 5% 琼脂糖凝胶中进行电泳( 80V , 60 min) , 并在紫外光下观察电泳结果 。 统计学方法 : 实验数据以 x ±s 表示 , 进行双因 素方差分析及相关分析处理 。 结 果

高于正常对照组 。

图 1  有效剂量 LPS 及 Cal C 、PDTC 对 NF -κ B 核内水平 的影响 Fig 1 . The effect of LPS, Cal C and PDTC on intranuclear NF -κ B level
** P <0 . 01 vs control ;#P <0. 05 , ## P <0 . 01 vs LPS group

2. 有效剂量 LPS 、Cal C 及 PDTC 对 NO 合成量 的影响 : 图 2 显示 , LPS 的作用可刺激巨噬细胞分泌 大量 的 NO , LPS 处 理 后 细 胞 培 养 液 中 NO 含 量 ( 181 . 840 ±14 . 401μ mol L) 较正 常 对照 组 ( 4. 759 ± 0. 382μ mol L) 有显著增高( P <0 . 01) , 而 Cal C 、 PDTC 的预 处理可明显削 弱 LPS 的作用 ( Cal C 阻 断组的 NO 含 量 为 48 . 407 ± 3 . 306μ mol L , 而 PDTC 组 为 35 . 194 ± 2. 343μ mol L) , 但均明显高于对照组 。

图 2  有效剂量 LPS 及 Cal C 、PDTC 对 NO 生成量的影响 Fig 2 .The effect of LPS、Cal C and PDTC on NO production
** P <0 . 01 , vs control ;##P <0. 01, vs LPS group

3. 有效剂量 LPS 、Cal C 及 PDTC 对大鼠肺巨噬 细胞凋亡的影响 细胞的形态改变( 吖啶橙染色法) : 实验分组同 前 。 吖啶橙染色结果显示 , LPS 刺激可诱导 AM 发生 凋亡 。 凋亡细胞的形态学改变为细胞变圆 、与周围 细胞分离 、 胞浆内溶酶体颗粒明显增多 、 胞浆浓缩甚 至最终消失 、核内染色质浓缩边聚 、核仁裂解 、核固 缩进而形成凋亡小体 、 散在分布于正常细胞中 , 有的 甚至被巨噬细胞所吞噬 。 正常对照组的细胞片内也

1. 有效剂量 LPS 、PKC 及 PDTC 对 NF -κ B 核内 水平的影响 : 如图 1 所示 , LPS 处理组的 NFκ B 测值 ( 0. 268 ±0 . 016 ) 显著高于正常对照组( 0. 039 ± 0. 007) 、 Cal C 阻断组( 0. 147 ±0 . 010) 及 PDTC 阻断组 ( 0. 097 ±0 . 011) ; 用 Cal C 及 PDTC 阻断后 NF-κ B的 核内水平均 明显低于 LPS 处理 组 , 其中 PDTC ( P< 0. 01) 的抑制作用强于 Cal C( P <0 . 05) , 但二测值均

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有少量的凋亡小体存在 , 但比例极低 , 可能是机体清 除受伤 、 衰老或无用的细胞的正常生理反应 。 用 LPS 刺激后约 4 ~ 6 h , 细胞片内凋亡 小体明显增 多 , 且 LPS 的作用时间越长 , 凋亡小体的数目越多 。 Cal C 、 PDTC 预处理可减少 LPS 作用后细胞凋亡发生的数 量和比例( 图 3) 。

图 4  分组实验的凋亡电泳图 Fig 4 .Apoptotic electrophoresis of experimental groups
1: 1kb DNA ladder marker ; 2: control ; 3: LPS group ; 4: Cal C group ; 5: PDTC group


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LPS 是 G 菌诱发细胞损伤与凋亡的主要物质 , 它的作用及致 病机理一 直是人们 关注和研 究的焦 点 。 多年的研究发现 , LPS 致病可能涉及数条胞内信 号通路及多种转录因子的参与 , NFκ B 就是其中的重 要环节 。 但 LPS 诱导的 NFκ B 活化在细胞凋亡和损
图 3  LPS、Cal C 及 PDTC 对大 鼠肺巨 噬细胞 凋亡的 影 响(×400) Fig 3 . The effect of LPS , Cal C and PDTC on apoptosis of rat AM (×400)
A: normal control ; B: LPS group ; C: Cal C +LPS group; D: PDTC + LPS group

伤中的相互关系与作用机制还不十分清楚 。 本实验 研究发现 , LPS 诱导的肺 巨噬细胞 凋亡有 PKC 、 NFκ B、 NO 等因素的参与 。 介导和调控自身及其它细胞的凋亡是巨噬细胞 实现其免疫调节和效应细胞功能的重要方式之一 。 导致巨噬细胞凋亡的因素很多 , 如生物因素 : 激素或 生长因子 、 免疫细胞 ; 化学因素 : 某些毒素 、 药物 、 NO ; 病理因素 : 某些细菌 、病毒感染等 。 实验中 , 我们采 用 LPS 模拟 G 菌感染以诱发巨噬细胞凋亡 , 结果显 示 1mg L LPS 能诱导巨噬细胞发生凋亡 , 凋亡细胞在 细胞形态学及电泳图谱上的改变都很明显和典型 。 且细胞的凋亡与 LPS 刺激之间存在时效关系 : 即随 着 LPS 刺激时间的延长 , 凋亡细胞所占比例不断增 加 , 凋亡严重程度不断增强 , 直至细胞完全破坏 , 溶 解。 许多物质参与了 巨噬细胞凋 亡的调控 , 如 NFκ B、 PKC 、Ca 列
〔5〕 2+

凋亡电泳 : 图 4 显示 , 用 1mg L LPS 刺激 24 h , 细 胞的基因组 DNA 经电泳后可以清楚看到特征性的 凋亡电泳图谱 , 即阶梯状的 DNA 电泳 条带 , 也称为 凋亡的 ladder pattern 现象 。 电泳条带的间距在 200bp 左右( 通过与 1kb DNA marker 相比较确定 。 如 : 凋亡 电泳最后 2 个 条带的间 距与几乎 位于同一 水平的 1kb DNA marker 中 250bp 与 500bp 间距 — — —250bp 相 比较要小 1 5 左右 , 故认为凋亡条带为 200bp 左右) , 这与细胞凋亡后核内 DNA 受胞内核酸内切酶裂解 成 180 ~ 200bp 的核苷酸小段的理论相符 。 Cal C 阻 断组的基因组 DNA 电泳泳道中也可以看到较弱的 梯状电泳条带 , 但与 LPS 处理组 相比明显减弱 。 正 常对照组及 PDTC 阻断 组则几乎不 见 ladder pattern 现象 。 4 组细胞的基因组 DNA 提取物经 1 . 5 %的琼 脂糖凝胶电泳后均在同一位置水平出现 1 条明亮的 DNA 条带 , 表明这些 DNA 均提取自 同一细胞 , 即大 鼠 AM 。

、 NO 、 PTK 等 。 在多数凋亡相关基因的

启动子 或 增 强 子 上 都有 NFκ B 的 特异 性 结 合 序 。 NFκ B 可通过调节这些基因的转录与表达参 与对细胞凋亡的调控 。 但 NF-κ B 对细胞凋亡存在着 〔6〕 双向调节关系 , 它既可以促进凋亡的发生 , 也可抑 制凋亡
〔7〕

。 PKC 亦 然

〔8 ,9〕

。 但 到底是抑制还 是诱导

凋亡取决于细胞的类型及刺激因素的不同 。 分组实

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验时我 们用 Cal C 和 PDTC 分别阻 断 、抑 制 PKC 及 NFκ B , 以观察二者在巨噬细胞凋亡中的作用 。 实验 发现 , 当细胞 PKC 通路及 NFκ B 转录被预先阻断后 , 凋亡现象显著减弱 , 主要表现为细胞凋亡的数量减 少、 凋亡改变不典型及特征性 ladder pattern 现象的减 弱或不出现 。 这说明对 LPS 所致的巨噬细胞凋亡而 言 , PKC 和 NFκ B 都参与并发挥了重要作 用 。 实验 中细胞凋亡的发生明显晚于 NFκ B 的活化也证明了 这一点 , 因为这样一个时间差正是 NF-κ B 活化后各 种凋亡 相关基因转录与 表达所需 要的 。 但 NFκ B、 PKC 在细胞凋亡中的作用并非是直 接作用 , 而是由 NFκ B 活化后表达的一系列生物活性物质所致 。 NO 对凋亡的调控也具有双 向性
〔10, 11〕

LPS 能激活 PKC 、 NFκ B , 启动多种凋亡相关基因的转 录和表达外 , 还与 LPS 刺激引起细胞分泌 NO 等多种 生物活性物质的介导有关 。
参 考 文 献

1  Lentsch AB , Czermak BJ , Bless NM , et al . NFκ B activation during IgG immune complex- induced lung injury . Am J Pathology , 1998 , 152( 5) : 1327 -1336. 2  郭甫坤 , 李亦蕾 , 吴曙光 . Sandwich ELISA 法测定 NFк B. 中国 药 理学通报 , 2000 , 16( 1) : 227 -228 . 3  杨帆 , 王文亮 , 王伯 . 细胞 凋亡的几 种形态学 观察 . 细胞与 分 子免疫学杂志 , 1997 , 13( 1) : 8-9. 4  颜子颖 , 王海林 , 译 . 精编分 子生物学 实验指南 . 北京 : 科学 出 版社 , 1998 , p39. 5  Lee HH , Dadgostar H , Cheng Q , et al . NF-kappa B -mediated up - regulation of Bcl -x and Bf l -1 A 1 is required for CD40 survival signaling i n B lymphocytes . Proc Natl Acad Sci USA , 1999 , 96( 16) : 9136-9141 . 6  Lin KI , Lee SH , Narayanan R , et al . Thiol agents and Bcl-2 identify an alphavirus -induced apoptotic pathway that requires activation of the tran scription factor NF-kappa B . J Cell Biol , 1995 , 131( 5) : 1149 -1161 . 7  Van -Antwerp DJ , Martin SJ , Kafri T , et al . Suppression of TNF-alpha in duced apoptosis by NF-kappa B . Science , 1996 , 274( 5288) : 787 -789 . 8  Bang OS , Park JH , Kang SS , et al . A ctivation of PKC but not of ERK is required for vitamin E -succinate-induced apoptosis of HL-60 cells .Biochem Biophys Res Commun , 2001 , 288( 4) : 789 -797 . 9  Jun CD , Oh CD , Kwak HJ , et al . Overexpression of protein kinase C isoforms protects RAW 264 . 7 macrophages from nit ric oxide-induced apoptosi s:involvement of c-Jun N - terminal kinase st ress -activated protein kinase , p38 kinase , and CPP - 32 protease pathways . J Immunol , 1999 , 162 ( 6) : 3395 -3401 . 10 Messmer UK , Brune B . Nitric oxide-induced apoptosis : p53-dependent and p53 -independent signalling pathways . Biochem J , 1996 , 319 ( Pt 1) : 299 -305 . 11 Kim YM , Talanian RV , Billiar TR . Nitric oxide inhibits apoptosis by preventing increases in caspase-3 -like level via two dist inct mechanisms . J Biol Chem , 1997 , 272( 49) : 31138 -31148. 12 常卫红 , 曹雪涛 . 一氧化 氮与细 胞凋亡 的调 控 .癌症 , 2001, 20 ( 9) : 998-1000 . 13 杨光 , 李鸣真 . 一氧化氮与炎症及免疫调节 . 国外医学免疫学 分 册 , 1995, 6( 6) : 303 -307 . ( 收稿日期 : 2003 -01 -02)

。 这种复

杂性与 NO 的产生水平 , 细胞类型及 NO 与铁 、 巯基 、 〔12〕 蛋白和超氧化物的相互作用密切相关 。 NO 诱导 细胞凋亡的机理在于其作为细胞间信使的同时也是 巨噬细胞细胞毒效应的作用基础 。 其细胞毒作用可 通过以下 4 种方式发挥 : ① 激活的巨噬细胞可同 时产生 NO 和 O2 , 二者相互作用生成的氧化硝基阴 离子 ( ONOO ) 进一 步 分解 成 毒性 更 大的 ·OH 和 NO2 , 后者进入靶细胞引起细胞毒作用和组织损伤 ; ② 作 为信使 , NO 可激活 可溶性 鸟苷酸 环化酶 , 使 cGMP 生成速度加快 50 ~ 200 倍 , cGMP 又可调节蛋 白激酶 、 磷酸二酯酶及离子通道而发挥舒张血管 、 抑 制血管平滑肌细胞增殖 、抑制血小板粘附 、聚集及神 经传递作用 ; ③ NO 可和某些含有亚铁原卟啉( heme) 基因的亚铁原子结合 , 形成亚硝酰铁络合物 , 导致线 粒体 NADPH 、 泛醌氧化还原酶和三羧酸循环中鸟苷 酸酶 失活 , 使线 粒体呼吸抑制 及靶细胞铁丧 失 ; ④ NO 使核酸亚硝基化 , 导致 DNA 的断裂 , 抑制核糖核 苷酸还原酶 , 干扰 DNA 的合成 。 我们的实 验中 NO 与细胞凋亡表现出相似的变化趋势 , LPS 作用后 NO 的合成大幅上升 , 细胞凋亡的发生率也不断升高 ; 而 用 Cal C 及 PDTC 阻断后 , NO 浓度降低的同时细胞凋 亡的发生率也下降 , 表明二者之间有一定相关联系 。 综上分析 , LPS 可诱导巨噬细胞凋亡 , 其诱因除
〔13〕


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