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RNA干扰及其在植物中的研究进展


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草业科学 * + , , . / 0 -/+ , 01 . 2 3 ) . 3

" ! 45" 4 # " # $ ! # 6 6

! " # 干扰及其在植物中的研究进展
张森浩  严学兵  王成章  文开新  许来俊
# 河南农业大学牧医工程学院 ! 河南 郑州 7 $ $ # # # !

摘要    是一种由双链 + 介导 能够特异沉 + ), 干扰  + ),8 9 : ; < = ; < ; 9 > ; + ), 8 ), ? & @ A ' ; B C : < D 9 ? ; ?+ ), ? C + ), 默靶基因的转录后基因沉默现象  为植物基因功能的研究开辟了新途径  本研究主要综述了 + ), 干扰现象的发 近年来 + 现 + ), 干扰的过程及其特点  + ), 干扰在植物中的诱导方法及载体构建  ), 干扰在植物基 因 功 能 和 抗病性等方面的研究进展  以及对该技术的理论研究和应用 展 望  以期对 + ), 干 扰 技 术 在 植 物 中 的 深 入 研 究 提 供指导  关键词  双链 + 靶基因  植物 + ), 干扰  ), 中图分类号  # $ E F 7 G 文献标识码  , 文章编号  6 # # 6 B # G ! F ! # 6 6 # $ B # " ! 4 B # "


瑞典皇家卡罗琳医学院的 # # G年6 #月 ! 日! ! 诺贝尔大会宣布 ! 本年度诺贝尔生物医学奖由美国 马萨诸塞医 学 院 的 克 雷 格 % 梅 洛 # . < D 8 I ; ' ' &$ H .( 教授和斯坦 福 大 学 医 学 院 教 授 安 德 鲁 % 法 尔 # , 9 B

花色的关系密切 ! 基因表达量的增加或减少都可能
&' S' 导致花色产生变异 & (6 F F # 年! ) D & ' 8等 " 尝 试 在 M

花翼瓣中通过 有颜色的 矮 牵 牛 # : # + 4 $ * "' ( & * ) "$ 8 介入 .P 来加深 1基 因 使 查 尔 酮 合 成 酶 过 量 表 达! 花瓣颜色不仅未加深 ! 花瓣的颜色 ( 出人意料的是 ! 而且 7 !T 的介入 .P 1 基因的 植物 的花 全部 变 白 或 有白色或 灰 白 图 案 ( 当 时 他 们 称 之 为 基 因 的 共 抑 # $ ! 并认为这种现象与甲基化作用 > & B C @ < ; C C 8 & 9 M M # $ 有关 ( 在植物中 ! U ; : Q ' D : 8 & 9 ? C + ), 可以在基因 R
&' 组的同源序列位点 上 诱 导 V ), 发 生 甲 基 化 F ( 甲

$ 分享 ! 以表彰他们发现 + ), 干扰现象 ? < ; JK( L 8 < ; & 6' 的贡 献 (+ ), 干 扰 是 指 外 源 或 内 源 性 的 双 链 + ), 进入细胞 后 引 起 与 其 同 源 的 + ), 特 异 性 降 解! 从而抑制相应基因表达 ! 表现出特定基因缺失的 现象 ! 它与植物中的 共 抑 制 # $ 或转录 > & B C @ < ; C C 8 & 9 M M ! 后基因沉默 # & C : : < D 9 C > < 8 : 8 & 9 D 'H ; 9 ;C 8 ' ; 9 > 8 9 M M H $ ) 真菌 中 的 基 因 阻 抑 # $ 一 样! 均是生 * N 1 @ ; ' ' 8 9 O H 物体内普遍 存 在 的 一 种 生 理 机 制 象普遍存 在 于 动 植 物 中
& ' 4

基化是不对称 的 ! 且不仅限于> N 或> W N 序 列! M M M 若甲基化发生在编 码 区 ! 对该基因座的基因转录无 但是会引起转录后基因沉默 * 若发生在启 显著影响 ! 动子区 ! 则诱发转录水平基因沉默# : < D 9 C > < 8 : 8 & 9 D ' M ! ! 它与 * 具有稳定 N 1$ N 1 不 同! ; 9 ;C 8 ' ; 9 > 8 9 H H & & 6 #' 6 6' 和可遗传的特点 (6 F F 6年! L 8 < ;等 把 + ), 注 入新秀杆线虫 以 控 制 基 因 的 表 达 (6 F F ! 年! + & U D B
! 在粗糙链孢霉中发现外源 基因 的导 9 &和 I D > 8 9 &6 称之 入可以抑制具有同 源 序 列 的 内 源 基 因 的 表 达 ! & '

(+ ), 干 扰 现 (在过去的 ! # 年! + ),

& ' !

干扰作为沉默基因 表 达 的 本 能 机 制 而 出 现 ! 这种古 老的抗病毒反应可以用来特定地抑制某种目的基因 功能 ! + ), 干扰正在成为一个非常有效的研究工具
' 7 用于揭示 许 多 基 因 的 功 能 & ( 目 前! 有关 + ), 干

扰机理尚未阐明 ! 相关的研究主要集中在治疗人类
' $ 疾病和提高植物的性状方面 & ( 通过调查研究新 秀

杆线虫 # ) 果蝇# ! " # $ % & ' " ( ) * + * , # # " $ ,$ / & % , % ' * " . 0 及许 多 的 无 脊 椎 动 物 ) 植物& 如拟南 1 # " $ % " , + # &$ . 芥# $ ' ) 真 菌 & 如 粗 糙 链 孢霉 2 & " ( * ) % , * ,+ ' " * " $ " 0 # ! 但不包括酿酒酵母# 3 # 4 & % , % & " 5 & " , , "$ 6 " 5 5 ' " 7 0 $ ' ) 老鼠胎儿期 干细 胞 ) 卵 母 细 胞 & % 1 5 # , 5 # & # 9 * , * " # 8 发现了通过提供与所要沉默的基 及早期的胚胎等 ! 因序列一致的双链 + 可以从中中断任 ),# ? C + ),$
G' 何基因的表达 & (

为基因表达的阻抑作用 (6 美国康奈尔大学 F F $ 年!
&4' 的N 试图利用反义 + @ &和 X ; U Q @ ; C6 ), 技术阻 M

断线虫 M 出现了 M D < B 6 基因的表达 ! D < B 6 基 因关 闭的 & 6 7' 现象 ( Y 在植物中双链 + D : ; < Q & @ C ;等 发 现 ! ), 分子能诱 导 * 证 明 在 被 病 毒 感 染 后! N 1 的 现 象! 能同时产生与病毒基因组同源的正义 和反 义 + ), C


$! " # 干扰的发现
查尔酮合成酶基因 .P # $ 与 1 > Q D ' > & 9 ;C 9 : Q D C ; R

收稿日期 + ! # 6 # B # 7 B ! G 接受日期 + ! # 6 # B # " B 6 F 基金项目 + 国家自然科学基金 # $ 4 # S S 6 $ ! S 作者简介 + 张森浩 # $ ! 男! 河南平顶山人 ! 在读硕士生 ( 6 F " F B + U D 8 ' ( > & U 3 B U D 8 ' Z Q D 9 C ; 9 Q D & H H 通信作者 + 王成章 3 + B U D 8 ' J D 9 > Q ; 9 Z Q D 9 G 4( 9 ; : ! H H H

" ! 7

$ * + , -, . / 0 -/+ , 01 . 2 3 ) . 3# % & ' ( ! "! ) & ( # $
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" # $ ! # 6 6

的植物比那些只能产生正 义 或 反 义 + ), 的 植 物 能 更有效地抵御病毒的入侵 ( 在特定的生物学系统中 把+ ), 导入到细胞中可以阻 止 内 在 基 因 功 能 的 表 达 等
& 6 $' & 6 G'

# 研究发现 ! 转基因引起基因沉默的植株 * D ' D @ @ 8等 ! O 通过 可以通过嫁接从沉默砧木传播到未沉默接穗上 !

将含有已沉默基因的植株嫁接到未沉默基因的 寄主 植株上 ! 诱发寄主植株发生了 + ) , 干扰 ( %( $( ( ,* 依 赖 性  去 除 内 源 性 ,* 后! ? C + ), 对目的基因的抑制 作 用 明 显 降 低 或 消 失 ! 而加入外 源性 ,仍 不 能 加 强 其 抑 制 作 用! 显示 + * 后! ), 8 & ' ! 6 是 一 个 ,依 赖 的 过 程 ( 等 认 为 ! * K D U & < ; 一是 + ), 8中 至 少 有 两 个 过 程 需 要 ,* 供 能+ 二是C ? C + ), 被 V 8 > ; <酶 酶 切 产 生 C 8 + ),* 8 + ), 与+ 2 1 . 结合解链后形成有活性的 + ), 诱 导 沉 默 复合物 # ( + ), B 8 9 ? @ > ; ?C 8 ' ; 9 > 8 9 & U ' ; W! + 2 1 .$ H> M

(6 美国华盛顿卡耐基研究院的 L F F "年! 8 < ; 在研究 + ), 干扰所需的结构和传递条件的试

把? 验中 发 现 ! C + ), 正 义 链 和 反 义 链 的 混 合 物 注 入线虫体内 ! 比注入 单 独 的 任 意 一 个 正 义 链 或 反 义 链的效果均要好 * 把纯化的正义或反义链注入成年 然而双链的混合物则产生强有 动物体内效果较弱 ! 力的 ) 特定的干扰 ! 这种干扰的效应不仅存在于被注 入? 在 后 代 中 同 样 有 效(实 际 上! 每 C + ), 的动物 ! 个受感染的细胞只 需 要 很 少 分 子 的 ? C + ), 便 能 引 起足 够 的 效 应 来 干 扰 内 在 同 源 基 因 # ; 9 ? & ; 9 & @ C H 的表 达 ! 并认为在干扰的进程中存在催化 U+ ),$ 或放大作用 ! 他们将这种现象命名为 + ( ), 8

%( % 参与 + ), 干扰的几个重要因子
%( %( $V 8 > ; < 酶 V 8 > ; < 酶 是 一 种 ,* 依赖性核酸 &! ' 属于 + (V 内切酶 ! ) D C ;  酶家族的成 员之 一 ! 8 > B ; <酶能产生 + ), 干扰所 必需 的 C 8 + ), 和 U 8 + ), # $ ! 这些小的 的特性 由 酶 U 8 > < &+ ), + ), V 8 > ; < 蛋 白的 结 构 决 定 * ) V 8 > ; <酶 蛋 白 包 括 + ), P3 0 2 . C * , K) + ) D C ;和 ? C + ), 结 合 域 ( 不 同 生 物 体 具 有 各V 不同数量的 V 8 > ; <酶 ! 8 > ; <酶既有功能上的 各自 又有冗 余 和 交 叉 ( 在 进 化 过 程 中 ! 独立 ! V 8 > ; <酶 的 数 量 逐 渐 减 少! 却逐步整合从而表现出更多功
! 4' ( 能&

%! " # 干扰的过程 %( $+ ), 干扰的特点
只降解与 %( $( $ 特异性 + ) , 8具有很高的特异性 ! 其序列相应的单个内源基因的 U 而对不相关序 + ) ,! 列的表达无干扰作用 ( 不同目的基因结 构序列 合成 的? 外显子 序列 的 C + ) , 产生的效应存在显著差异 ! 而只针对内 ? C + ) , 能产生特 异 和 高 效 的 基 因 抑 制 ! & ' 6 S 含子序列的 ? 则不能产生这种作用 ( C + ) , %( $( % 高 稳 定 性 C 8 + ),# C U D ' ' 8 9 : ; < = ; < 8 9 ),$ H+ 分子是 4 端有突出 的 非 配 对 碱 基 的 双 链 分 子 ! 在细 [
& 6 "' 胞内可稳定存在 47? ! 半衰期 远长 于反义 寡聚

%( %( % 小干涉 + ),C 8 + ), 是 通 过 V 8 > ; <酶 或 类 V 8 > ; <酶从长的 双 链 + ), 切 割 产 生 或 通 过 化 学 途 大小 为 ! $ ! 径合成的 ! 6! $个核苷酸# 9 : C 8 + ), 可
&' 以与多细胞蛋白结合形成 + 2 1 .$ (

核苷酸 * + ), 8还具有对靶 U+ ), 的 切 割 位 点 的 准 确性和高穿透性等特点 ( %( $( & 高效性 + ), 干 扰 抑 制 基 因 表 达 具 有 很 高 对目的基因 表 达 的 抑 制 可 以 达 到 缺 失 突 变 的效率 ! 体表 型 的 程 度 * 而且数量相对很少的 ? C + ), 分 子 # 数量远少于内源 U+ 即能完全抑制相 ), 的 数 量 $ 许 多 生 物 学 和 遗 传 学 证 据 表 明! 应 基 因 的 表 达! + ), 干扰效应中存在信号分子的扩增机制 ( %( $( ' 可 传 播 性 和 遗 传 性 ? C + ), 分 子 能 够 通 过 细胞膜 ) 细胞间 隙 和 细 胞 屏 障 而 被 转 运 ( 如 经 线 虫 小肠微注 射 或 浸 润 喂 食 线 虫 的 方 法 进 入 其 体 内 的 在各组织中 对靶 ? C + ), 能被有效转运至全身各处 ! 基因进行抑制 ! 在体细胞和生殖细胞中都能检测到 并且其子代也产生了对靶基因强烈而 + ), 的表达 ! 特异的抑制效应 ( 说明 + ), 干 扰 机 制 中 可 能 存 在 维持 U+ ), 降解 序 列 特 异 性 的 信 号 分 子 ( 但 这 种
' 6 F 子二代往往又回复到野生型& ( 遗传只限于子一代 ! & 6 G'

%( %( &+ ), 诱导的基因沉默复合 物 + 2 1 . 是 一种 包括蛋白质和C ! 可 核酸和蛋白质的复合物 # 8 + ),$ 以将同源的 U+ ), 分解 成 C 8 + ),* + 2 1 . 已经 在果 蝇和人类 细 胞 中 得 到 纯 化 ! 而且都含有 , < & 9 D @ : ; H & ! 7' 蛋白家族的成员 ! 这种蛋白被 认 为 是 该 复 合 物 的
' &G' ! $ (的 研 究 表 明! 核心成分 & D A D < D等 ! , < & 9 D @ : ; H

蛋白质 + V 3 B 6) E V 3 ! 和 ,N\ 6是 + ), 8过 程 中 至 其作用与蠕虫 ) 果蝇和植物中的干涉 关重要的成分 ! 过程类似 (, < & 9 D @ : ;及其同源 蛋 白 质 的 分 子 量 大 H 约6 称为 * 均含有 * # #] V! * V 蛋 白 质! , K和 * 8 Y 8 结构域 * * , K 结构域有一个 很 稳 定 的 褶 层 和 一 个 桶 状中心 ! 侧旁 的 附 属 物 能 与 长 于 $9 :的 单 链 + ),
&S' 和双链 + ( ), 呈现很弱的结合 !

%( %( '+ ), 依 赖 的 + ), 聚 合 酶  + ), 依 赖 的 ! + ), 聚 合 酶 # + ), B ? 8 < ; > : ; ?+ ), M & ' U ; < D C ; R 在转 录 后 基 因 沉 默 中 起 着 重 要 作 用 ( 现 已 + ? + *$

" # $ ! # 6 6

草业科学 # 第! "卷# $期$

" ! $

从植物中分离 纯 化 了 + 通过 1 ? + *! V 1 B * ,N 3 及天 然条件下 蔗 糖 密 度 梯 度 离 心 测 定 其 分 子 量 分 别 为 二者相差约6 揭示 + 6 ! "和6 6 $] V! #T ! ? + *可能 & ' ! " 是一种球状 蛋 白 ( 实 验 显 示 ! + ? + *在无引物条 其主要作用是放大 + 件下也可以 催 化 转 录 ! ), 沉 使双 链 + 默信号 ! ), 得 到 扩 增 ( 目 前 已 发 现 多 种 " + ? + * 蛋 白 ! 如 +1 N 1 ! 1 V 3 6)+ V + !)3 N\ B 6)
&F' ( E V 3 B 6等 !

量 ,端 * 参与的 情 况 下 ! + ) D C ;在 距 离 C 8 + ),4 [ 并使其 降 解 ! 从而达到转录 6 !9 :处切割靶 U+ ),! & ' $ 后基 因 沉 默 # 的结果4 (哺 乳 动 物 中 的 * N 1$ 但植物中的 + + ), 8主要以 + 2 1 . 为主 ! ), 8还可以 另外 一 种 形 式 进 行 ! 即 + ), 依 赖 + ), 聚 合 酶
G (在 + 首 先! 被导入的 + ? + *4 ? + M 介导的沉 默 中 + 然后 在 V ? C + ), 直接与目标 U+ ), 形成双链 ! 8 > ; < & '

酶的 作 用 下 形 成 C 再进一步以C 8 + ),! 8 + ), 的 反 目 标 U+ 在+ 义链为 引 物 ) ), 为 模 板 ! ? + * 作用下 发生类似 * 形成新的 ? 新形成的 . + 反 应! C + ),! 达到 干 扰 目 ? C + ), 被 V 8 > ; <再次切割形 成 C 8 + ),! & & 4 S' 4 "' 的基因表达的效果 (1 8 UU ; <等 在裂殖酵母上 的研究表明 ! # 可以在体内从目标 + + ? + + ? 6$ ), M M 模板 合 成 + ! 产 生 的 这 些 不 与 发 夹 结 构 ), + ), # $ 同源 ( Q D 8 < 8 9C : < @ > : @ < ; M

%( &+ ), 干扰的机理  遗传学 和生 物学的 研究
涉及许多未知 表明 ! + ), 8是一个非常复杂的 过 程 !
4 #' 功能的 蛋 白 质 & ( 近 年 来 的 研 究 表 明! 长的双链

通过 + ), 在类似于 + ) D C ; ' 9的 V 8 > ; <酶的 作用下 ! 以 ,核酸内切 作 用 ! *依赖的方式在胞浆中断裂 生成! 而具有发夹环结构 ) 6! 49 :的C 8 + ), 分子 ! 长度为 S #" #9 :的 单 链 + ), 前 体 # < ; B U 8 + ),$ M 则被切 割 为 ! 6! $9 :的 双 链 U 8 + ),* C 8 + ), 和 与核蛋白粒子# $ 结 U 8 + ), 的作用机理相 似 ! + ) * C 分别形成 C 合! 8 + ), 核 蛋 白 复 合 物 和 U 8 + ), 核 蛋 &6 ' 白复合物 ! 然后重排为 + ( ), 诱 导 沉 默 复 合 物 4 一般将含有 C 而将含有 8 + ), 的 复 合 物 称 为 + 2 1 .!
&!' (复合物中只含 U 8 + ), 的复 合 物 称 为 U 8 + ) *4 的一 条 单 链 ! 由 于 反 义 链 # 与靶 + 有小 + ), ), 互

&! " # 干扰在植物中的诱导方法及载体构建
植物 中 + ), 8的 诱导 方法 包 括农 杆 菌 # 介 导 法) 粒 子 轰 击 法) 聚乙二醇 , < & A D > : ; < 8 @ U$ H # 介 导 法) 电 击 穿 孔 法) 病毒介导法# * 3 N$ _ 8 < @ C B 8 9 B
' 4 F ! 等& (农杆菌介导法 % 2 N 1$ ? @ > ; ?H ; 9 ;C 8 ' ; 9 > 8 9 H 快速 ) 可靠 ) 成 本 低! 用于将 ? C + ), 引 入 植 物 使 基 ' 7 # 因沉默 & ! 也是常用的 + 粒子轰 ), 8的 诱 导 方 法 *

补$ 的$ 端 热 力 学 稳 定 性 较 差! 因此反义链形成复 [ 合物的机率 较 高 ! 沉 默 效 率 也 较 高! 该过程需消耗 $ ! 称为 ,* (C 8 + ), 为 + ), 8的触发物 # : < 8 ; < H H 小干涉 + 它是 + ),! ), 干 扰 赖 以 发 生 的 重 要 中 间 效应分子 ! C 8 + ), 的 序 列 与 所 作 用 的 目 的 + ), 的 ' ! ! 序列具有同源性 & ( 长的双链 + 被切割成 ), C 8 + B ), 的过程 中 ! V 8 > ; < 酶 起 重 要 作 用 (* , K结构 端突出的 ! 个单链碱 域首先识别双链 + ), 分子 4 [ 起 锚 定 作 用! 基! ? C + ^ V 结构域识别并结合双链 端! 与* + ), 分子 $ [ , K结构域联合固定 V 8 > ; <酶 ! 最后在 + ) D C ; ' 9 活性域的作用下切割 双链 + ), 分 两 子成 C 8 + ), 分 子 (C 8 + ), 是 + ), 8的 效 应 物 ! 磷酸基团和4 末 端 具 有 !9 条单链末 端 具 有 $ [ [ :突 出的非配对的 碱 基 ( 这 种 结 构 对 于 C 8 + ), 有 效 地 引发 + ), 8反应是 相 当 重 要 的
& ! !' & 4 7' & ' 4 4

击法 相 对 快 速 ! 但 转 化 效 率 较 低* * 3 N 介导法及电 击穿孔法等已在 多 种 不 同 种 属 的 植 物 中 成 功 应 用 ! 但其周期过长不适于大规模鉴定基因功 能 ( 病毒介 导的基因沉默是一种研究基因瞬时表达的新方法 ! 它 利用改造的病毒作为载体 ! 这种改造的病毒无致病能 并 且能 复制 ! 把这 种载 体 力或只表现出很轻的病症 ! 通过体外转录直接侵染植物或通过农杆菌介导 ) 基因 枪的方法 ! 就可把目的基因序 列导 入宿主内 ! 病毒 便
' 4 F 在植物内复制和传播 ! 从而诱导基因沉默& (

在植 物 + 无论是验证未知 ), 干 扰 的 研 究 中 ! 基因功能还 是 改 良 作 物 品 质 ! 构建相应的 + ), 干 尤 扰表达载体都是最 基 本 的 试 验 步 骤 和 必 要 方 法 ! 其是在应用 + ), 干 扰 技 术 进 行 作 物 品 质 改 良 时 ! 要得到可稳定 遗 传 的 转 基 因 植 株 ! 构建 + ), 8的 表 达载体必不 可 少 + 由于要诱发植物中的 + ), 干 扰 必须要求导 入 的 外 源 基 因 片 段 具 有 正 反 相 连 机制 ! 的+ 构建高效的植物 + ), 8结构 ( 所 以 ! ), 8表 达 载体 ! 对于 + ), 8技 术 在 植 物 学 领 域 的 应 用 具 有 重
7 6' 要的推动作用 & ( 用能够表达产生 ? C + ), 的 质粒

(双链C 8 + ), 与

一种蛋白复合物相 结 合 ! 这种蛋白复合物含有一个 在C C 8 + ), 和 一 个 蛋 白 核 酸 酶 分 子 ! 8 + ), 的 指 导 下! 蛋白复合 物 形 成 了 一 种 有 活 性 的 + ), 诱 导 的 基因 沉 默 复 合 体 + 然后 + 2 1 .! 2 1 . 中的C 8 + ), 引 导沉默 复 合 物 识 别 靶 向 同 源 U+ 接着 + ),! ), 解 在少 旋酶完成靶向 U+ ), 与 C 8 + ), 正 义 链 换 位 !

或病毒载体转化植 物 ! 或者通过转基因及病毒感染 的方法在植物中过量表达 单 链 + ), 从 而 引 起 共 抑

" ! G

$ * + , -, . / 0 -/+ , 01 . 2 3 ) . 3# % & ' ( ! "! ) & ( # $

" # $ ! # 6 6

制反应 ! 都可以在 植 物 中 引 发 + (其中利用 ), 8 B ), 8的 技 术 路 线 在 V ), 插入在植 物 中 诱 导 产 生 + & ' & ! 7 4' 拟南 芥 7 和水稻# 等模式植物的 ; & < ", " + * 9 "$ 8 功能基因组学研究中得到了较为广泛的应用 ( 该路 线的原 理 如 下 + * . + 扩增目标基因的> V ), 片 段 ! 分别以正向和反向 插 入 双 元 植 物 表 达 载 体 ! 由强启 正反片段之间由一段载体上的内含 动子驱动转录 ! 子序列隔开以维持 载 体 的 稳 定 性 * 该系统在植物细 胞中转录 产 生 带 发 夹 结 构 的 ? 引发 + ! C + ),! ), 8 & 7 7' 从而抑制目的基因的表达 (

品种的发 + B * . + 方法从小麦 # > & * + * 5 4 1" # , + * 9 4 1$ 基 因 部 分 片 并以 育籽粒中 克 隆 出 1 1 2 2 2 > V ), 段 ! 6 # 6 质粒为 基 础 构 建 了 由 4 $ 1启动子调控的 MYI 还以 M L G . $ F 7 6质粒为 1 1 2 2 2基因的反义表达 载 体 ! 把这两 基础构 建 了 1 1 2 2 2基 因 的 + ), 8干 扰 载 体 ! 可降低或抑制 1 种载体导入 小 麦 中 ! 1 2 2 2基 因 的 表 达! 通过分析转基 因 小 麦 籽 粒 内 支 链 淀 粉 组 分 的 变 化来研究 1 1 2 2 2基因在调 控 小 麦 支 链 淀 粉 合 成 中 的 作用 ( 高 效) 特异地使靶基因失 + ), 8技术 能 快 速 ) 活! 从而可以非常有效地鉴定特定基因的功能 ! 为解 析植物基因的功能开辟了一条捷径 ( 研究鉴定植物 中的优良基因或致 病 基 因 ! 可以给育种工作及减轻 病害提供帮助 ! 在农业生产上有指导意义 (

'! " # 干扰在植物中的研究进展 '( $ 在基因功能研究中的作用  在后基因 组时
人们迫切需要一 种 工 具 大 规 模 地 研 究 基 因 的 功 代! 通过特异地 能 (+ ), 8技术有 逆 基 因 分 析 的 特 点 ! 抑制靶基因的表达 ! 获得功能丧失或降低的突变体 ! 进而找出该基因对 细 胞 发 育 ) 分化及功能的相应联 同 时 对 邻 近 基 因 的 结 构) 功 能 及 表 达 无 影 响( 系! + ), 干扰在植物 中 被 发 现 作 为 干 扰 核 酸 的 机 制 而 存在 ! 例如通 过 小 的 # $ ! #! G9 : + ), 分 子 干 扰 病 也 是 植 物 的 一 种 防 御 方 式( 近 毒和转基因的 表 达 ! 来研 究 发 现 ! 内源干 + ), 干 扰 通 过 多 种 途 径 发 生 ! 扰途径在基因转录 ) + ), 的稳定性及翻译水平上发 挥了重要作用
& ' 7 $

'( % 在抗病性研究中 的 作 用  利 用 +), 8技 术
的原理 ! 根据病毒的基因序列 设计 与之 同 源 的 ? C + B 导入到植物中 ! 引发 + ! 可 以对 病毒 进 行 特 ),! ), 8 异性的切割 ! 达 到 抑 制 病 毒 的 作 用( 小 麦 条 纹 花 叶 病毒 # ! 通过小麦 J Q ; D : C : < ; D ]U & C D 8 >_ 8 < @ C Y1 I%$ $ 传 播! 对美国和加拿大 卷叶缨螨 # J Q ; D :> @ < 'U 8 : ;
&F' 平原地区的经济有很大影响 (! # 6 #年! L D Q 8 U等7

在澳大利亚发现了 小 麦 条 纹 花 叶 病 毒 ! 该病毒在小 麦种植区迅速传播 ( 由于在小麦体内很难找到抵御 促使其通过基于 + 这种病毒的抗 体 ! ), 8的 方 法 构 建转基因 抗 体 ( 小 麦 可 以 和 两 种 质 粒 稳 定 地 共 转 表 达 包 含 Y1 化+ I% 序 列 的 发 夹 + ), # Q D 8 < 8 9 M 的M 1 : D < D : ; B ) 2 D 质粒和含有 9 : 2 2选择性标 + ),$ H M 记的 M & @ : Q ; < 9印迹杂交分 .I 9 ; & 1 0 1 ! 质 粒 (1 而且来自 析表明 ! Q + ), 整合到 了 小 麦 基 因 组 中 ! M Q + ), 转基因序 列 的 小 + ), 的 积 累 与 免 疫 力 呈 M 正 相 关 关 系! 证明通过这种技术产生非标记的 这是第一 次在 Y1 I% 免疫的转基因植株是可行的 ! 小麦中报告运用捻接内含子 Q 表 + ), 达的 策 略 来 M 对 Y1 I% 产生免疫 ( 马铃薯 # 是世界上广泛种 6 % " $ 4 1+ 4 ( # & % , 4 1$ 植的粮 ) 菜) 饲兼用型作物 ! 在我国干旱 ) 半干旱地区
$ #' 种植面 积 较 大 ! 但 对 病 害 比 较 敏 感& (马铃薯中

(
& ' 7 G

在拟南芥中可以通 ! # 6 #年! % D 8 C : 8 `等 证 明 ! 过+ 通过运用设计 ), 干扰来抑制 U 8 + ), 的积累 * 的靶向初级 U 8 + ), 转录和启动子 的 发 夹 + ), 8结 可以显著地降低 U 靶 构! 8 + 6 G 4和 U 8 + 6 S 6 D的积累 * 向的启动 子 区 域 V ), 的 甲 基 化 表 明 抑 制 U 8 + ), 初期的转录 是 可 行 的 ! 可以实现 U 表 达 的 敲 8 + ), 从而为打乱 U 除! 8 + ), 的目标配对和研究 U 8 + ), 的功能提 供 了 一 个 简 单 的 方 法 ( 在 棉 花 # = % , , * 7 8 0 $ 纤维 中 基 因 编 码 的 类 成 束 蛋 白 阿拉伯半 4 1C B M M( 乳聚 糖 蛋 白 质 # = D C > 8 > ' 8 9 B ' 8 ] ;D < D A 8 9 & ' D > : D 9M < & B H ! $ 的作用通过构建 + : ; 8 9 C L 0 , C ), 干 扰 体 进 行 验 证* 根据 N Q ,N * 7 的序列的 + ), 干扰使 U+ ), 的 水平显 著 下 降 ! 其他4个 L , 0 C蛋 白 则 部 分 受 到 抑 制* 在转基因植株中 ! 纤维的初始长度和伸长受到抑 制! 成熟的转基因棉 花 纤 维 的 长 度 明 显 变 短 并 且 纤 维质量变 差 ( 对 N Q ,N * 7的 + ), 干 扰 影 响 了 纤 维细胞中纤维素 的 沉 积 ( 在 培 养 过 程 中 ! N, 4 可以 上调 L 特别是 N 0 , C 基 因 的 表 达! Q ,N * !和 N Q B 结果表明 L ,N * 7! 0 , C基 因 对 纤 维 的 初 始 长 度 和 伸长 起 着 十 分 重 要 的 作 用
& 7 S'

1 : + L * 6 基因抵抗晚疫 病 的 功 能 已 经 通 过 表 达 和 构 建+ 发现过表达 ), 干扰媒 介 进 行 了 深 入 的 研 究 ! 用+ 1 : + L * 6 基因的植株致病比正常植株慢 ! ), 干 扰把 1 : + L * 6 基 因 沉 默 掉 则 对 病 原 体 的 感 染 敏 感! 证明 1 : + L * 6 基因对抵抗马铃薯 中的 致病 疫酶 起着
$ 6' 很重要的作用 & (

(康国章等

& ' 7 "

采用

" # $ ! # 6 6

草业科学 # 第! "卷# $期$

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棉花病虫害是制约其产量和品质的重要因素之 每年可造成 大 量 减 产 ( 棉 花 曲 叶 病 毒 在 巴 基 斯 一! 坦) 印度等 热 带 地 区 经 常 肆 虐 ! 减产和经济损失严
&!' 重! 通过构建含棉花曲叶病毒 V , C D ?等 $ ), 的载

的转基因植 株 (+ 在油酸含 B * . + 分 析 结 果 表 明! 的转基因植株中未检测到在非转基因植 量达" 4( FT 株中普遍存在的 L , , 一 种典 D ? ! 基 因转 录 U+ ),, 型的 + 通过对植株生长发育状态的 ), 干扰 现 象 ! 该高油 酸 含 量 转 基 因 株 系 并 未 表 现 出 双 观察比较 ! 突变体中由于 L D ? !基因的失活所引起的植株抗寒 能力差 ) 发育迟缓 ) 花 蕾 死 亡) 结实率低等不利的农
$ "' 艺学性状 ( 李 兰 玉 等 & 利用甘蓝型油菜种子特异

表达病毒正义和 体转化 烟 草 # 3 * 5 % + * " $ "+ " ( " 5 4 1$ ! 结果 ! 反义的 + ), C $T 的转基因烟 草显示 稳 定 的 病毒抗 性 ( 姜 洋 等 通过农杆菌 0 ^ , 7 7 # 7 介 导! 转化 携 带 M 的 烟 草 叶 片 ! 获 得携带 8 . $ "B V ), 因植株 ! 转基因植 3 0 2 1 , 分 析 生 长 素 的 结 果 表 明! 仅为 M 物叶片的 内 源 生 长 素 含 量 明 显 降 低 ! 8 . $ " 说明转基因烟草中发生 B V ), 转化植 株 的 $ GT ! 为利用该基因序列启动 8 D D P 基 因 转 录 后 沉 默! 抑制冠瘿瘤病发生提供了依据 ( 对抗病 + ), 干扰 ) 毒转基 因 烟 草 进 一 步 研 究 发 现 了 ? C + ), 和 C 8 + B 说明转 录 后 基 因 沉 默 是 最 有 可 能 引 起 抗 病 毒 ),! 的机制 * 这些研 究 为 以 后 在 棉 花 上 应 用 + ), 8进 行 抗棉花曲叶病毒研 究 指 明 了 方 向 ! 也为其他抗病毒
$ 7' (在植物的抗病性 研究工作 提 供 了 有 益 的 参 考 & & ' $ 4

反向吲哚乙酰胺 水 解 酶 基 因 # 序列的转基 正) 8 D D P$

性贮存蛋白基因> < @ > 8 = ; < 8 9 启动子及 )\ 1 终止子构 建了无选择标记基因且含有反义结构的油酸脱饱和 酶基因的 + 通过农杆菌介导法 ! 获得 ), 8表达载体 ! 了无选择标记 转 基 因 植 株 ( 再 生 植 株 的 * . + 检测 外源基因已高频率地整合到油菜基因组中 ! 而 表明 ! 且脂肪酸含量分析 表 明 ! 获得的转基因种子油酸含
$ F' 指 出! 纤维素 量比对照有了很大的提高 ( 钱 春 等 &

酶) 果胶裂解酶和伸展蛋白是参与草莓# A & " " & * " . 果实成熟软化的关键 因子 ! 并提 出了 利用 " $ " $ " , , "$ 降低相 + ), 干扰等生物技术对关键基因进行调控 ! 关酶的 U+ 提高草莓果实硬度从而延长保 ), 表达 ! 存时间的研究思路 ( 利用 + ), 8可以 改 善 植 物 中 营 养 物 质 的 含 量 (
&#' 利用 + \ 8 : D等 G ), 8技术抑制 咖啡 植物 中编 码可 H 基 因 的 表 达! 转基因植物 可碱合成 酶 # . D IaI6$

研究方面 ! 通过 + 可以特异地抑制相应的 ), 8技术 ! 致病基因 ! 不仅保护了植物 ! 在农业生产上也增加了 收益 (

'( & 在遗传改良研究中的作用  随着生活 水平
的提高 ! 人们对植物所提供产品的要求也越来越高 ! 例如要求食物的主要营养成分含量更高且比例更平 衡! 抗营养成分 更 少 ( 传 统 的 育 种 方 法 显 然 不 能 完 全满足人们的需 求 ! 而+ ), 8技 术 的 出 现 使 一 切 成 为可能 ( 利用 + ), 8技术可以改变花色 ( 应用 + ), 8技 术干涉与色素形成 有 关 的 基 因 ! 能诱导产生一些不 同寻常颜色甚至花 型 的 花 ! 如日本和澳大利亚研究 中二氢黄酮 者利用 + ), 8沉 默 玫 瑰 # ? % , "& 4 % , "$ . (1 Q & 8 ` 等 在郁金香 # $ 花 色 试 验 证 明 ! > 4 * ". # , $ # & * " $ " 0 % 8 : 6 基因的表达 和 L 3 + 6基因的抑制对花被 H H 底部的蓝色是至关重要的 (
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中可可碱含量下降了 4 咖啡因含量下降 #T " #T !
&6' 克隆了玉米# $ #T S #T ( 柴 晓 杰 等 G B # "1 " ,$ 8 淀粉分支酶 # ! 基因 ! C : D < > QA < D 9 > Q 8 9 9 Z U ; C 1 ^ 3$ H; R

构建了高效的 C 通过花粉 管通 道法 8 + ), 表达体系 ! 导入玉米 自 交 系 ! 该目的 ) & < : Q ; < 9 杂 交 分 析 表 明! 基因在转 基 因 植 株 中 能 正 常 转 录 并 导 致 内 源 1 ^ 3 直链淀粉的含量提高了约$ U+ ), 含 量 下 降 ! #T ( & ' G ! 郭志鸿等 采用 + ), 8技术通过沉默内源 1 A ; 6和
4 获 得 高 直 链 淀 粉 含 量 的 马 铃 薯( 马 建 等 G 1 A ;!! 的实验证明 ! 应用 + ), 干 扰 技 术 可 有 效 抑 制 大 豆 & '

醇7 还 原 酶 基 因! 培育出了蓝色玫瑰 B

& ' $ $

# 籽粒中脂肪氧化酶基因表达 ! 降低脂 = 5 * $ #1 " C$ 8 肪氧化酶活性 ! 提 高 大 豆 脂 肪 含 量! 改 良 大 豆 品 质! 创造优良大豆种质 ( 利用 + ), 8还可以改良牧草 ( 牧草种质资源是 是筛选和培育优 发展草地畜牧业的 重 要 物 质 基 础 !
G 7' 良牧草新品种 的 基 本 材 料 & (黑麦草# D % * 4 10 # 7



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利用 + ), 8 技 术 可 以 提 高 油 酸 含 量( 陈 苇 利用已获得的甘蓝型油菜 # 种 @ & " , , * 5 "$ " 4 ,$ 0

子贮存 蛋 白 , , ,十 字 花 科 蛋 白 # 基因的 > < @ > 8 = ; < 8 9$ 构建了无选择标记基因且同时具 启动子和终止子 ! 有正义和反 义 结 构 的 油 酰 去 饱 和 酶 基 因 # 种 L D ? !$ 子特异表达 + 并通过农杆菌介导转化 ! 获 ), 8载体 ! 得了只含有油菜原 有 基 因 且 L D ? !基因表达受抑制

原产于亚洲和北非的 温带 地区 ! 具 有 抗 寒) 耐 & # $ $ #$ 践踏 ) 再 生 能 力 强) 成 坪 快) 营 养 丰 富) 生 物 产 量 高) 可消化性高 ) 适口性好等特点 ! 成为我国最重要的冷
&S' G $ B G G' 季牧 草 之 一 & (^ 通过反义 + Q D ' ' D等 G ), 技

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术! 构建 表 达 ' 用基因枪 & ' $基因反义 + ), 载 体 ! M 使' 将其转入 多 年 生 黑 麦 草 中 ! & ' $基因表达受到 M 获得可育的 ) 该基因表达遭到破坏 抑制或表达下调 !
&" ' 的) 低 致 敏 的 转 基 因 黑 麦 草 (1 通 8 9 Q和 ^ Q D ' ' DG H

& ' 曹 家 树( 查尔酮合成酶基因& ' 细胞生物学杂 S b (  蒋明 ! 志! ! # # S! ! F+ $ ! $ B $ ! F( & ' " D & ' 8.! 0 ; U 8 ; @ W .! b & < ; 9 C ; 9 +( 2 9 : < & ? @ > : 8 & 9& =D ) M H > Q 8 U ; < 8 > > Q D ' > & 9 ; C 9 : Q D C ;H ; 9 ; 8 9 : &* ; : @ 9 8 D < ; C @ ' : C 8 9 R < ; _ ; < C 8 A ' ; > & B C @ < ; C C 8 & 9& = Q & U & ' & & @ CH ; 9 ; C 8 9 : < D 9 C M M H & ' ! # $ + b ( * ' D 9 :. ; ' ' 6 F F #! ! 7 ! S F B ! " F( & ' F D C C ; 9 ; ; < I! P ; 8 U ; C1! 1 c 9 ; <P 0( , 98 9 = ; > : 8 & @ C Y H H H _ 8 < & 8 ?+ ),< ; ' 8 > & 9; _ & ' _ ; ? = < & UD 9 8 9_ 8 : < & B ; 9 ; < D : ; ? M H 9 & 9 B 8 9 = ; > : 8 & @ C_ 8 < & 8 ?? ; ' ; : 8 & 9U @ : D 9 :_ 8 DD> & U ' ; U ; 9 B M & ' ! + : D < ; ' ; : 8 & 9 8 9_ 8 _ & b ( 3I^ \b & @ < 9 D ' 6 F F 7! 6 4# ! 7$ R? G 6 S ! B G 6 S S( & ' 6 # & 9 ; C0! + D : > ' 8 = =L! ^ D @ ' > & U A ;V .( + ) , B ? 8 < ; > : ; ?: < D 9 B b C > < 8 : 8 & 9 D ' ; 9 ; C 8 ' ; 9 > 8 9 8 9M ' D 9 : C> D 9A ; 8 9 Q ; < 8 : ; ? 8 9 ? ; B M H H ; 9 ? ; 9 : ' = : Q ;+ ) ,: < 8 ; < D 9 ?< ; @ 8 < ; CI ; : 6= & <U D B M R& H H O & ' ! ! + 8 9 : ; 9 D 9 > ;b ( . @ < < ; 9 :^ 8 & ' & # # 66 6S 7 S B S $ S ( H R! & ' 6 6 8 < ;,! , ' A ; < : C & 9V! P D < < 8 C & 91! # + " -( * < & ? @ > : 8 & 9& = L D 9 : 8 C ; 9 C ;+ ),' ; D ? C: &; = = ; > : 8 _ ;D 9 ?C ; > 8 = 8 >8 9 Q 8 A 8 B M ' # # " $ ,U @ C > ' ;& b ( V ; B : 8 & 9& =H ; 9 ;; W < ; C C 8 & 98 9!E M . ! _ ; ' & U ; 9 : 6 F F 6! 6 6 4+ $ # 4 B $ 6 7( M & ' + 6 ! & U D 9 &)! I D > 8 9 &N( E @ ; ' ' 8 9 : < D 9 C 8 ; 9 : 8 9 D > : 8 _ D : 8 & 9 + H & =H ; 9 ;; W < ; C C 8 & 98 9) ; @ < & C & < D> < D C C DA < D 9 C = & < B M M R: & ' U D : 8 & 9J 8 : QQ & U & ' & & @ CC ; @ ; 9 > ; C b ( I & ' ; > @ ' D <I 8 B H O ! # $ + 6 F F !! G ! ! 4 4 7 4 B 4 4 $ 4( > < & A 8 & ' & H R & ' ! 6 4 @ &1 X ; U Q @ ; CXb ( " < B 6! DH ; 9 ;< ; @ 8 < ; ?= & <; C B N M O 0 ! # # " $ ,; U A < & C ; 9 > & ? ; CD : D A ' 8 C Q 8 9 & ' D < 8 : 9 !E R HM R8 . " @ : D : 8 _ ;1 ; < Q <] 8 9 D C ;: Q D :8 CD C UU ; : < 8 > D ' ' 8 C B M R R? & ' ! # $ + : < 8 A @ : ; ? b ( . ; ' ' 6 F F $! " 6 7 G 6 6 B G ! #( & ' 6 7 D : ; < Q & @ C ;* I! N < D Q D U I Y! Y D 9 % 8 < @ C < ; B Y HI ^( C 8 C : D 9 > ;D 9 ?H ; 9 ; C 8 ' ; 9 > 8 9 8 9M ' D 9 : C > D 9A ; 8 9 ? @ > ; ?A H R C 8 U @ ' : D 9 ; & @ C; W < ; C C 8 & 9& =C ; 9 C ;D 9 ?D 9 : 8 C ; 9 C ;+ ), M & ' b ( * < & > ; ; ? 8 9 C& = : Q ;) D : 8 & 9 D ', > D ? ; U =1 > 8 ; 9 > ; C H R& ! 6 F F "! F $+ 6 4 F $ F B & =: Q ;/ 9 8 : ; ?1 : D : ; C& = ,U ; < 8 > D 6 4 F G 7( & ' 6 $ ; ' ' ; 9 Y! 0 8 > Q : ; 9 C : ; 8 9.( YQ D :U D ] ; CD 9U+ ),D 9 B ) ! : 8 B C ; 9 C ; B 8 : 8 _ ;& b' ( < ; 9 ? C8 9^ 8 & > Q ; U 8 > D '1 > 8 ; 9 > ; C # $ + 6 F F 4! 6 " 6 6 7 6 F B 7 ! 4( & ' ! 6 G 8 < ;,! a @1 I & 9 : & U ; < # + " -( * & : ; 9 :D 9 ?C ; B L H R I! M > 8 = 8 >H ; 9 ; : 8 >8 9 : ; < = ; < ; 9 > ;A & @ A ' ; B C : < D 9 ? ; ?+ ),8 9 R? ' ! + ! " # $ % & ' " ( ) * + * , # # " $ ,& b ( ) D : @ < ; 6 F F "! 4 F 6# G G G F$ . " # G B " 6 6( & ' 6 S D J D C D ] 8P! D 8 < D X( 1 Q & < :Q D 8 < 8 9: ;& =? C + ), X M R M $ < & U & : ; <C 8 9 8 = 8 B : Q D :D < ;> & 9 : < & ' ' ; ?A + ),# % D ' M H R: > D 9 : ' 8 9 ? @ > ;+ ), 8U ; ? 8 D : ; ?H ; 9 ; C 8 ' ; 9 > 8 9 8 9 : Q ; > B R H R ' : & ' D C U& =Q @ U D 9> ; ' ' C& b ( ) @ > ' ; 8 >, > 8 ? C+ ; C ; D < > Q! M ! # # 4! 4 6+ S # # B S # S( & ' 符立梧 ( ' 生物化 6 " + ), 8及其在肿瘤中的应用 & b (  石智 ! # $ + 学与生物物理进展 ! ! # # 7! 4 6 G 7 F ! B 7 F F( & ' ! ! 6 F D ' ; 9)b L ' ; ; 9 & <b L 8 < ;,! # + " -( ? C + ), B U ; ? 8 D : ; ? . M

过引入突变使黑麦草花粉致敏蛋白结构折叠发生改 而使花粉不能对人产生致敏的副作用 ( 变!

(! " # 干扰存在的问题展望
尽管仅 ! + ), 干扰技术被发现以来 ! # 年时间 ! 但在植物上的发展相当迅速 ( 目前该方面还存在一 些问题需要进一 步 深 入 研 究 ! 如+ ), 8具 体 的 作 用 机制 ) 切割靶 U+ + 2 1 . 的形成及作用机理 ) ), 的过 程) 设计合成有效 的 C 选择合适的C 8 + ),) 8 + ), 转 染试剂 ) 构建有效的干扰载体等 ( 此外 ! 并非所有的 被 识 别) 切 + ), 序列都能比较 容 易 的 接 近 C 8 + ),) 割! 有些靶序列可能隐藏在二级结构下 ! 或者位于高 度折叠的区域中 ! 而有些序列可能与蛋白质形成紧 阻碍了与C 一些与靶基 密的复合物 ! 8 + ), 的 识 别 * 因同源性高的基因可能会被沉默等 ( 这些都有待于 科研工作者进 行 更 加 深 入 的 研 究 ( 令 人 兴 奋 的 是 ! 安全性和特异 + ), 8与其他技 术 相 比 具 有 高 效 性 ) 且 操 作 简 单) 成 本 低( 随 着 已 知 基 因 数 目 和 性! 测 序 项 目 的 增 加! 人 3 1 -# ; W < ; C C ; ?C ; @ ; 9 > ;: D M O H$ 技术的不断 们对植物体基因组研究的深入和 + ), 8 完善 ! + ), 8在植 物 中 的 研 究 及 应 用 前 景 将 更 加 广 阔! 也将在不断的应用中进一步发展 ! 同时给人们带 来更大的科研价值及经济价值 ( 参考文献
& ' 章 静 波( 解 剖 学 报! 6 + ), 干 扰 & b' ( ! # # G!  赵 永 娟! # $ + 4 S G S ! # B S ! 4( & ' 水稻穗颈伸长基因G 杭 ! " S !的功能验证& V' (  黄伟素 ( 州+ 浙江大学 ! ! # # G( & ' 4 8 ? D Q U ; ?, I! Y 8 ' ] 8 ;^( 3 9 ? & ; 9 & @ CD 9 : 8 _ 8 < D 'U ; > Q D B 1 H + 9 8 C U C& =+ ),8 9 : ; < = ; < ; 9 > ; D> & U D < D : 8 _ ;A 8 & ' & ; < B M H RM & ' ! b ( I ; : Q & ? C8 9I & ' ; > @ ' D <^ 8 & ' & ! # 6 #! G ! 4+ C ; > : 8 _ ; M H R 4 B 6 F( & ' ! + 7 & > ; ' ' 8 91 * < & _ ; 9 Z D 9 & I( + ),8 9 : ; < = ; < ; 9 > ; ' ; D < 9 8 9 I H ' b ( b & @ < 9 D '& = ; 9 ;] 9 & > ] ? & J 9= < & U> ; ' 'M Q C 8 & ' & H R H R& ! # $ + # # 7! 4 F B 7 7( < D 9 C ' D : 8 & 9 D 'I ; ? 8 > 8 9 ;! & ' $ D 9 N D ' 8 ' 8N( / C 8 9 ), 8 : &8 U < & _ ;M ' D 9 :9 @ B HN 0! H+ M += : < 8 : 8 & 9 D '_ D ' @ ; < & U U ; > Q D 9 8 C U: &D ' 8 > D : 8 & 9& b' ( M M ! # $ + < ; 9 ? C 8 9^ 8 & : ; > Q 9 & ' & ! # # 7! ! ! F 7 G 4 B 7 G F( H R & ' G & & 9 8.! + & U D 9 & )! I D > 8 9 & N( 1 @ < ; C C 8 & 9& =H ; 9 ; . H M M & ' b ( , 9 : & 9 8 ;_ D 9 ; W < ; C C 8 & 9A & U & ' & & @ C: < D 9 C ; 9 ; C M RQ H H 0 ; ; @ J ; 9 Q & ; ]! 6 F F 7! G $+ ! # $ B ! # F(

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