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蛋白质芯片的综述


蛋白质芯片的综述
摘要 蛋白质芯片技术是一种高通量、微型化和自动化的蛋白质分析技术,已在多个领域得 到应用,如蛋白质组学研究、新药的开发、酶与底物的相互作用和疾病检测等。论文详细介 绍了蛋白质芯片技术的原理、芯片介质及蛋白质的固定技术, 论述了蛋白质芯片在肿瘤研 究, 食品检验的应用以及传染病检测中的研究概况。 分析了蛋白质芯片的问题以及应用前景。 关键词 蛋白质芯片,肿瘤,食品检验,传染病检测,应用 蛋白质芯片的研究工作起始于 20 世纪 80 年代,到 90 年代技术日趋成熟。蛋白质芯片 (protein chip)技术因具有高通量平行分析、信噪比较高、所需样品量少,以及可直接关联 DNA 序列和蛋白质信息等优点,自问世以来,已广泛应用于蛋白质组学、医学诊断学等领域研 究,具有广阔的发展。

1.蛋白质芯片介绍
1.1 技术原理

蛋白质芯片是由固定于不同介质上的蛋白微阵列组成,这些蛋白包括抗原、抗体及标志 蛋白,然后用标记的或未经标记的另外一个蛋白,如抗原、抗体或配体进行反应,有的需要经 洗涤后再加入标记的二抗进行反应,从而达到放大抗原抗体反应的目的。所用的标记物有荧 光物质,如 Cy3(青色素,一种荧光染料)和 Cy5 等;酶,如辣根过氧化物酶,化学发光物质等;其 他分子,如免疫金标记,然后再进行银染对反应结果显色。 反应结果用扫描装置进行检测或用 肉眼直接进行观察。

1.2

蛋白质芯片的介质

目前作为蛋白芯片的介质有滤膜类、凝胶类和玻璃片类,前 2 种介质的优点是能够保持 所固定的蛋白的三维结构,但缺点是由于其质地较软,所以不能满足机械点样的强度,同时凝 胶类的蛋白质芯片所点样品容易发生扩散。玻璃片的优点是成本低和性能稳定,可满足高强 度的机械点样。此外,20 世纪 90 年代中期发展的液相芯片技术使蛋白芯片技术得到进一步 提高。其被喻为后基因组时代的芯片技术,也可称为灵活的多种被分析物质的检测 ( flexible multi-analyte profiling,xMAP)技术,xMAP 技术是集流式技术、荧光微球、激 光、数字信号处理和传统化学技术为一体的一种新型生物分子高通量检测技术,这种技术将 流式检测与芯片技术有机地结合在一起,使生物芯片反应体系由固相反应改变为接近生物系 统内部环境的完全液相反应体系,因此也被称为液相芯片技术[1]。 光学蛋白芯片也是新发展起来的一项技术,是将高分辨的椭偏生物传感器技术和集成化 多元蛋白质芯片技术相结合发展形成的生物分子识别和检测技术。 该技术的优点是无需标记 待检样品,无需预处理直接检测非纯化分析物,样品用量少,检测时间短并且可以进行多元检 测。

1.3

蛋白质的固定

将蛋白质固定于芯片上的方法很多,各方法的最终目的是在单位面积/体积上固定最大 量的蛋白质并保持其天然构象,该环节成为蛋白质芯片技术的关键步骤之一。 蛋白质的固定可以分为两类:非专一性固定和专一性固定,非专一性固定即通过被动吸 附的方式使蛋白质结合到相应的介质上,如硝酸纤维素膜和多聚赖氨酸包被的玻片通过被动 吸附蛋白质的氨基或羧基来固定蛋白质,此方法产生的芯片背景值往往较高。

1. 4

蛋白质芯片的检测

蛋白质芯片的检测包括两类方式,一类是直接检测法,即直接对捕捉到的蛋白进行检测, 包括加强纳米簇共振技术、等离子体共振技术(SPR)、固相激光激发时间分辨荧光光谱法和 表面加强激光解吸离子-飞行时间质谱法(SELDI-TOF-MS)。另一类检测方法是间接检测法, 即通过使用发光物质包括荧光物质、化学发光物质、酶、同位素等对被检测物或其抗体进行 标记,然后用激光扫描或 CCD 对信号进行检测。

2.蛋白质芯片技术用
2.1
2·11

蛋白质芯片在肿瘤研究中的应用
蛋白质表达谱的检测

蛋白质芯片可以检测两种不同样品(患病组与健康组,药物治疗前与治疗后)之间蛋白质 表达水平的相对差异。根据蛋白表达差异推测参与疾病发生发展相关蛋白,还可以根据治疗 前后蛋白表达不同判断患者对药物治疗的敏感性。在研究血管生成因子与肿瘤的关系 时,Huang 等[2]利用蛋白质芯片检测 143 例各类型肿瘤患者 5 种血管生成因子的表达水平。 发现多数肿瘤病人均有某种血管生成因子升高,而且不同肿瘤类型血管生成因子升高也不 同。血管生成在肿瘤生长和扩散中起重要作用,因此血管生成因子所反应的肿瘤血管生成的 活跃程度对组织病理分级,治疗方案的选择具有重要的指导意义。Laura Smith 等[3]利用抗 体芯片分析 MDA-MB-231 乳腺癌细胞系及其衍生系对阿霉素的抵抗性。抵抗组与敏感组相比 丝裂原活化蛋白磷酸化激酶,周期蛋白 D2,细胞角蛋白 18,细胞周期素 B1 等明显下降。根据 药物治疗前、 后表达的不同蛋白,可以预测患者对药物治疗的敏感性并给予个体化治疗,使患 者能在最大程度上受益。 2.12 蛋磷酸化检测 蛋白质芯片还可以用来研究蛋白质的磷酸化水平改变。原理与普通抗体芯片相同,区别 在于加入的抗体是荧光染料(如 Cy3、Cy5 等)标记的磷酸化酪氨酸(或是丝氨酸、苏氨酸)抗 体。 KNMendes 等[4]用特异性抗体芯片检测了 52 种不同信号蛋白的磷酸化水平并进行分析。 发现几种不同类型肿瘤均有 PI3-K 表达上调,还发现各肿瘤类型有其特异的信号通路变化, 比如,胰腺癌中表皮生长因子介导的信号通路中, p16ink 和 Rb 成逆相关。Boyd 等利用反相 蛋白质芯片检测 30 个乳腺癌细胞系 100 种蛋白质的磷酸化水平。发现表皮生长因子受体和 丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶相关激酶的抑制剂使 Akt 信号通路中的磷脂酰肌 醇(-3)激酶补偿性上调。 由于蛋白质的磷酸化在生物体内信号转导过程中起相当重要和广泛 的作用,因此对于蛋白质磷酸化检测具有重要的生物学意义。 2·13 肿瘤标志物联合诊断 蛋白质芯片具有同时并行测多个假定标志物的特点,因此可以更完整的描述癌症患者 血清的变化。RandalOrchekowski 等利用抗体芯片来检测与胰腺癌有关的血清蛋白,并利用 联合诊断的方法对样品进行分级。与良性病变和健康者相比,胰腺癌患者 Anti-PIVKA-II,Anti-CA15-3,Anti-IgA, Anti?cathepsin D 升高而 Anti?serum amyloid A 降低。一般认为 Anti-PIVKA-II 升高与肝癌和维生素 K 利用障碍有关,而胰腺癌引起的胆道 梗阻可以导致维生素 K 利用障碍;Anti-IgA 升高可能与胰液分泌增多和漏出有关;组织蛋白 D 则与癌细胞的侵袭行为有关。 将这些与肿瘤相关的标志物联合起来可以显著提高诊断的准确 率。 很多用于诊断的特异肿瘤标志物还没有发现,因此单个指标将被多指标联合诊断所取代。 有研究表明,卵巢癌单个肿瘤标志物 CA125 已经被 IL-18, FGF-2 和 CA125 联合诊断所取代。 胞浆丝氨酸羟甲基转移酶, T 型盒转录因子 3 和抗肌萎缩蛋白 utrophin 被用作检测乳腺癌 和卵巢癌的标志物。 联合这些互补又不重合的标志物,可以显著提高诊断的准确率,与单个肿 瘤标志物相比具有明显优势。

2.2 蛋白质芯片技术在食品检验的应用
2.21 食品中残留农药、兽药和抗生素的分析

目前农药、 兽药和抗生素在食品生产和加工过程中广泛使用。 各类禽肉中普遍检出各类 兽药和抗生素的残留,主要包括有盐酸克伦特罗(瘦肉精)、青霉素、氯霉素和磺胺二甲嘧 啶等。蔬菜和水果的生产加工中也普遍存在着农药残留的状况。目前用于农药、兽药和抗生 素残留检测的方法主要有生物化学技术、 气相色谱法和高效液相色谱法和 ELISA 等。 生物化 学方法作为传统方法一直起到巨大的作用, 但由于现在食品生产加工技术和生物技术的飞跃 发展,该技术暴露出了明显的过程复杂、速度慢和精确度低的缺点;气相色谱法和高效液相 色谱法灵敏度较高, 但存在前处理过程复杂、 速度慢、 仪器化程度高等不足; 微生物法简便, 但灵敏度和特异性低;ELISA 特异性高,检测限低,但检测组分单一,不适合多组分同时检 测。 而基于竞争免疫反应原理的蛋白质芯片测定方法相对于以上各种方法具有高通量、 并行 性、多组分同时测定、灵敏度高、特异性强等诸多优点。北京博奥生物芯片公司已开发基于 免疫原理的蛋白质芯片和配套的样品制备扫描和检测装置,可用于重点兽药残留的检测[5]。 军事医学科学院已成功地制作了检测农药阿特拉津半抗原的蛋白质芯片和检测罂粟碱的蛋 白质芯片,最低检测限分别为 0.001 g/mL 和 0.01μ g/mL[6]。左鹏采用蛋白芯片的方法检测 食品中的氯霉素和磺胺二甲嘧啶残留, 充分体现出了该方法快速、 高通量、 并行性等特点[7]。 2.22 食品中污染病原菌和生物毒素的检测 食品卫生检验中微生物和生物毒素的检测一直都是重点。 由于不同食品中致病微生物的 种类繁多且复杂, 带来了检测的困难, 用单一的生物化学方法或 ELISA 检测都有着检测种类 单一、处理复杂的缺点,特别是在遇到突发的罕见微生物污染时,传统的检测方法这些缺点 体现的很明显。而蛋白芯片以其高精度、高通量、快速的特点几乎可以在很短的时间内将常 见的的微生物都检测出来. 生物毒素和致病微生物蛋白芯片是利用抗原/抗体的特异性反应原理进行检测的。该类 蛋白质芯片所固定的配基是单克隆抗体,因此,制备芯片的原料就是可以是所有可能的致病 菌 (甚至包括其不同种、 菌株) 所分泌的特定毒素或其保守基因表的蛋白。 用事先实验设计、 验证好的单克隆抗体按一定规律点印在芯片上制作蛋白质芯片,就可以制成需要的蛋白质芯 片。需要说明的一点是,利用蛋白芯片进行检测时,样品也可以是未经提纯的样品液,但由于 样品中存在的其它物质的影响,可能出现假阳性结果,因此在对样品进行适当必要的提取、 纯 化等预处理是必要的。 2.23 转基因食品的检测 蛋白质芯片通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有高通量、微 型化、自动化和信息化的特点,是转基因食品检测的方向。转基因食品蛋白质芯片可以将待 检的蛋白质固定于玻片上制成检测芯片,可以对一个基因的信号通路上下游蛋白同时进行分 析,为研究新的蛋白对人体免疫系统影响机理提供完整的技术资料。通过分析确定该类转基 因食品对人体的危害。非常适合于转基因作物及加工品检测,使之具有广阔发展前景。

2.3 蛋白质芯片技术在传染病检测中的应用
相比细菌引起的传染病而言,病毒性传染病具有更大的威胁。由于病毒病没有特效药进 行治疗,因此,病毒性传染病的早期确诊对于人或动物的及时治疗及相应措施的实施至关重 要。 2.31 对 SARS 的检测 SARS ,即严重急性呼吸系统综合征,是由冠状病毒引起的一种人类传染病,曾在 2003 年给 世界造成很大的经济损失。Zhu H 等[8]用酵母表达系统表达 SARS 病毒的全基因组,用表达 产物制作蛋白芯片进行 SARS 的诊断,发现所表达的 SARS 病毒的 N 蛋白的 C 末端及 N 蛋白的 全长作为诊断抗原时,有很高的反应性,该片段富含一段短的赖氨酸序列,是 SARSV 所独有的, 显示出很高的抗原反应性。通过比较发现,其敏感性与 ELISA 相当,但特异性要比 ELISA 高。

通过将血清样本重复 3 次,其重复性能达到 98%。 特异性与间接荧光相比稍差,可能与血清样 品的稀释度有关,间接荧光方法的血清稀释度是 1∶10,而蛋白芯片的为 1∶200,显示出蛋白 芯片中的血清用量更少。 2.32 对禽流感的检测 禽流感不仅是禽类养殖中的重大威胁,而且已成为人类健康的一个重大隐患,目前东南 亚国家死于禽流感的人数在不断增加,我国也有禽流感病毒感染死亡的病例。 石霖等[9]制备 了可以同时鉴别诊断禽流感(AI)、新城疫(ND)2 种禽病血清抗体的可视化蛋白芯片。抗原来 自于超速离心法和蔗糖密度梯度法纯化的 2 种病毒蛋白抗原,芯片与待检血清杂交后,再与 胶体金标记的二抗杂交,银染显色后根据灰度值来判断结果。结果显示其芯片无交叉反应, 而且呈现较强的杂交信号。与琼扩(AGP)抗体检测方法相比,检测灵敏度是 AGP 方法的 400 倍以上。同时他的另外一个研究可以同时检测 4 种禽类疾病,大大提高了工作效率[10]。 2.33 对乙肝病毒的检测 乙肝病毒的检测应用 ELISA 检测时间长,操作复杂,需要分别对几种抗体和抗原进行检 测。将几种方法合并将会使该病毒的检测时间缩短,大大提高工作效率。董亚芳等[11]通过 研究实现了此功能,其采用 PVDF 膜制备不同的蛋白质芯片,以辣根过氧化物酶标记抗体,结 合酶联免疫反应,检测乙肝病毒素面抗原(HBsAg)、表面抗体(HBsAb),乙肝病毒 e 抗原 (HBeAg)、e 抗体(HBeAb)。结果显示,所制备的蛋白质芯片可检测到微量乙肝病毒抗原、抗 体的存在,其中 HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb 的最低可检测浓度分别为 11、4.8、2.1、18 μ g/mL,而且两种抗原或两种体间并无交叉反应。 此法制备芯片需 3.5 h,而检测过程仅需 20 min,且结果直接可用肉眼观察。

3.蛋白质芯片的问题与展望
蛋白质芯片技术最近几年的发展极为迅速,已被证明是整个基因组研究和大规模发现研 究的有力工具,越来越多的应用实例证明了蛋白质芯片的广阔应用前景及其市场价值。但目 前的蛋白质芯片技术也存在一些问题:(1)目前大多数来于 cDNA 文库的克隆体系不能通过正 确地阅读框架编码蛋白质;或者不能正确表达产生具有氨基酸全序列的蛋白质;或者缺少活 性必需的翻译后修饰;或者通过细菌表达的蛋白质不能形成正常的空间构象,这些都将直接 影响有关蛋白质功能的研究。(2)蛋白质芯片技术本身面临着亟待解决的问题,包括:什么样 的片基表面化学分子可以高亲和性、高特异性、高选择性地固定阵列分子;蛋白质在点样过 程中如何保持活性;如何选择适当的荧光标记程度以避免降低蛋白质活性或者造成信号的遗 失;如何优化固定阵列分子的条件;如何选择最适的芯片保存条件等。(3)目前蛋白质芯片在 灵敏度、 特异性,可重复性方面还无法完全达到一些实验的要求。 (4)由于生物细胞中蛋白质 的多样性和功能的复杂性,目前的蛋白质芯片在多样品并行处理能力,摄取蛋白质的数目和 种类,数据处理和资料分析的软硬件设备方面还有待进一步提高。 (5)蛋白质芯片还不能完全 做到试验样品微量化,使得一些研究由于样品来源不足(如从少量组织样本中寻找肿瘤标记) 而受限。(6)目前的检测方法或者标记困难,检测灵敏度低,或者需要昂贵的检测仪器和苛刻 的实验条件。这些问题不仅在某些程度上限制了蛋白芯片技术的发展,还会直接影响该技术 临床应用的进程。 目前,各芯片技术开发商针对上述问题加强相关技术研发,创立了早期检测研究网络 (early detec-tion research network,EDRN),美国国家癌症研究所在生物标记物研究中发 挥了领导作用。这一网络将学术界和生产部门的专家联合起来,以加速生物标记物的研究和 论证。 它为蛋白质组学加快已发现的蛋白标记物转化为临床早期诊断工具和风险评估提供了 公共平台。我们有理由相信,不断改进的蛋白质芯片技术将逐步实现它对蛋白质组学、医学 研究、药物开发和临床诊断等的巨大推动作用,而各种不同途径的数据整合也必将会不断加 深我们对生命的理解。 参考文献:

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