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广东省自然科学基金标书范本


顺 序 号 类 别 申报学科 代 码 1

05004715 A C03010502

广东省自然科学 基金

自由申请 重 点 博士启动

项目


申 请 者:张 璐





项 目 名 称:多巴胺受体对吗啡诱导的信号传导和基因表达的调控作用

所 在 单 位: 南方医科大学(原第一军医大学)基础部 邮 政 编 码: 510515 通 讯 地 址: 广州同和南方医科大学 申请者电话: 020-61640114-89103 传 真: 020-87705671

电 子 邮 件: 申 请 日 期: 2005-3-5 广东省自然科学基金管理委员会 二○○一 年 制









一、填写申请书前 ,请先查阅广东省自然科学基金有关项目申 请办法及规定。申请书各项内容 ,应实事求是,逐条认真填写。表 达要明确、严谨,字迹清晰易辨。外来语要同时用原文和中文表 达 。第一次出现的缩写词 ,须注出全称。 二、申请书请用 A4 复印纸,于左侧装订成册。第三页起各栏 空格不够时,请自行加页 。一式八份(至少一份为原件),由所在 单位审查签署意见后,按申报通知送广东省自然科学基金管理委员会 办公室 。 三、封面右上角“顺序号”由各单位根据广东省自然科学基金 管理委员会办公室的要求填写;“项目类别”栏由申请者填写, 申 请“省自然科学基金自由申请项目”此栏为“A”, “省自然科学基 金重点项目”为“C”,“省自然科学基金博士启动项目”为“D”。

一、简表
名 称 研 究 项 目 情 况 类 别 多 巴 胺 受 体 对 吗 啡 A. 自由申请项目 C. 重点项目 D.博士启动项目 申报 学科 申请金额 所用实 验室 姓名 申 请 者 情 况 所在 单位 全称 系(所) 姓名 基础部 身份 号码 专业技术职务 所在单位全称 代码 项目中 的分 专业 技术 职务 代码 012 名称 副教授 实验室全称 实验室类别 张璐 名称 1 名称 2 神经毒理学 分子神经生物学 6 万元 A 诱 导 的 信 号 传 研究 类型 导 和 基 因 表 达 的 调 控 作 用

A. 基础研究 B. 应用基础研究 C03010502 C010601 2006 年 1 月至 2007 年 12 月 A

代码 1 代码 2 研究期限

南方医科大学广东省功能蛋白质组学重点实验室 A. 国家重点 性 别 A. 男 B. 女 学 位 B A.博士 B.硕士 C.学士 A B. 部门开放 C 身份 号码
44011119701216882x

实验室 编号 民 族 其 中国 他 身 代码 156 份 代码 名称 代码 A. 院士 B. 博士生导师 C. 在站博士后 汉 01 □ □ □

C. 省重点实验室

最终 学位 授予 国

国(地 区)名

D. 留学回国人员 D 51051501

南方医科大学(原第一军医大学)

主 要 成 员 ( 不 含 申 请 者 )

项 目 组 情 况

人 员 统 计

人 4 1

中 1 1

在站博士后



博士生 2



硕士生

单位 1

1

阿片类毒品成瘾的核心问题是长期使用阿片类药物后,中枢神经系统产生可塑性变化, 而这种可塑性变化的基础是基因和分子水平的变化。本研究针对阿片类毒品成瘾时细胞内信
研 究 内 容 和 意 义 要 摘

号传导通路和基因诱导表达的变化,应用 D1 与 D3 多巴胺受体基因敲除小鼠模型,采用分子 生物学、细胞生物学、免疫组织化学等综合性手段研究阿片类药物吗啡对 MAPK 信号传导通路 的激活作用, 并对 D1 和 D3 多巴胺受体在吗啡诱导的 MAPK 信号传导通路、 早期反应基因 c-fos 和 CREB、晚期反应基因表达中的调控作用进行系统研究,从而在分子水平上阐明阿片类毒品 成瘾的发生机制,为该领域的基础研究和临床治疗提供新的理论和方法。

(主题词应反映研究内容,主题词数量不多于三个,各主题词之间以逗号分隔)

多巴胺受体,吗啡,基因表达













一、简表内容必须逐项认真填写,采用国家公布的标准简化汉字。简表中所有代码,以国家自然科学 基金规定的代码为准填写。 二、凡选择性栏目,将相应提示符A、B等之一填入该栏的右下角。 三、部分栏目填写要求: 项目名称──应确切反映研究内容和范围,最多不超过25个汉字(包括标点符号)。 基础研究──指以认识自然现象、探索自然规律为目的,不直接考虑应用目标的研究活动。 应 用 基 础 研 究 ─ ─ 指 有 广 泛 应 用 前 景 ,但 以 获 取 新 原 理 、 新 知 识 、 新 方 法 为 主 要 目 的 的 研 究 。 申报学科──申请项目所属的最基础学科。 如涉及多学科可填写两个,先填写主学科。 申请金额──以万元为单位,用阿拉伯数字表示。 研究期限──研究期限一般从申请的次年1月算起。终止时间为完成年度的12月。 所用实验室──系指研究项目将利用的实验室。 留学回国人员——指在国外取得学位或访问学者一年以上的回国人员。 所在单位名称及代码──按单位公章填写全称。首次申请广东省自然科学基金的单位,尚未编入 单 位 代 码 ,其 代 码 应 向 广 东 省 自 然 科 学 基 金 管 理 委 员 会 办 公 室 申 请 后 填 写 。 参 加 单 位 数 ─ ─ 指 研 究 项 目 组 主 要 成 员 所 在 单 位 数 , 包 括 主 持 单 位 和 合 作 单 位 (合 作 者 所 在 单 位 ), 以阿拉伯数字表示。 项目组主要成员──指在项目组内对学术思想、技术路线的制订与理论分析及对项目的完成起重 要作用的人员,本人应在申请书上亲自签名。

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二、立论依据
1.目的意义 吸毒是全世界广泛关注的问题。据公安部门的最新资料,我国登记在案的吸毒人数达 105 万人, 但实际人数远远高于此。广东省吸毒现象在全国较为突出。至2002年底,广东省累计登记在册 的吸毒人员达18.8万人,这些吸毒人员一年至少吸掉40亿元。在我国,毒品问题主要是海洛 因等阿片类(opiate)毒品,因此开展对阿片类毒品成瘾机理的研究,寻找有效的治疗阿片成瘾的 药物,具有深远的社会意义。

毒品成瘾(drug addiction)指不择手段、不记后果地强制性地获取、使用某种毒品(drug)。 阿片成瘾的形成是一个综合性的过程,受多种因素调控,既受心理性的、社会性因素影响,也受 基因遗传性因素影响。阿片成瘾一旦形成,即可能成为一种终生性的状态。成瘾者不择手段地攫 取(crave)毒品,具有极高的复发性(relapse),甚至在戒断(abstinence)多年后仍有可能复发 (relapse),造成很大的社会问题。阿片成瘾的形成是一个循序渐进的过程,在此过程,机体在 分子、 细胞学水平发生了代偿性变化, 进而导致成瘾的一系列症状 (Koob et al, 1998; White and Kalivas, 1998; Nestler, 2001; Hyman and Malenka, 2001; Laakso et al, 2002)。阿片类 药物成瘾的核心问题是长期使用阿片类药物后, 中枢神经系统产生可塑性变化,而这种可塑性变 化的基础是基因和分子水平的变化。 激活多巴胺系统是包括阿片类、可卡因在内的多种毒品成瘾 性的共同神经生物学特点。 多巴胺受体在毒品介导的基因表达调控中发挥重要作用。以往关于多 巴胺受体与成瘾性的关系多集中在可卡因类毒品, 对于多巴胺受体在阿片类毒品成瘾性中的分子 机制尚不甚明了。 本研究拟应用 D1 与 D3 多巴胺受体基因敲除动物模型研究多巴胺受体对阿片类 毒品诱导的细胞内信号传导及基因表达的调控作用, 它有两方面的意义:一方面是探讨阿片类毒 品作用下细胞内信号传导及基因表达变化, 为阿片类成瘾提供分子机制;另一方面探讨不同多巴 胺受体亚型对细胞内信号传导及基因表达的作用, 可进一步在分子水平上阐明多巴胺受体在阿片 成瘾中的作用,为该领域的基础研究和临床治疗提供新的理论和方法。 2.国内外研究现状 多巴胺信号通路与多巴胺受体

神经解剖学基础:机体包括三条多巴胺传导通路:黑质纹状体通路(nigrostriatal pathway),
起源于中脑黑质(substantia nigra)的多巴胺合成神经元,投射到远侧纹状体尾壳核(dorsal striatum,caudoputamen)该通路主要参与感觉传动的协调与运动的起始,该通路的退行性变化 可导致 Parkinson 疾病;中脑边缘(mesolimbic)多巴胺通路, 起源于腹侧背盖区(ventral tegmental area, VTA), 主要投射到腹侧纹状体伏核(nucleus accumbens, Nac),该通路主要参 与动机(motivation)行为; 第三条通路中脑皮质(mesocortical) 多巴胺通路起源于 VTA,投射 到前大脑皮质区(prefrontal cortex),该通路与学习和记忆有关。

神经生物学共点: 激活中脑边缘系统多巴胺系统是多种毒品成瘾性的共同神经生物学特点。在
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毒品的作用下,腹侧背盖区(ventral tegmental area, VTA)多巴胺神经元的放电活动增强, 从 而导致伏核区(nucleus accumbens, NAc)及其他一些神经核的多巴胺释放增强。并且,不同的药 物有其相对独特的特点:可卡因(cocaine)主要作用于突触前多巴胺转运体(transporters),从 而使得突触间隙的多巴胺素显著增高; 而阿片类(opiate)毒品通过抑制腹侧背盖区的γ-氨基丁酸 能(GABA)神经元,从而使得 NAc 的多巴胺释放明显升高,影响多巴胺传导通路的功能。

多巴胺受体:迄今,已克隆出 5 种多巴胺受体,分为两大类:D1 类和 D2 类。D1 类受体包括 D1
和 D5 受体,而 D2 类受体包括 D2、D3 和 D4 受体。D1 类受体与激动型 Gs 蛋白结合,激活酰苷环 化酶及增高 cAMP 含量;而 D2 类受体与拮抗型 Gi 蛋白结合,抑制酰苷环化酶及降低 cAMP 含量。 D1 多巴胺受体是体内分布最广泛的受体,主要分布于纹状体、伏核与嗅球,同时在边缘系统、 下丘脑与丘脑中也有表达。D3 多巴胺受体主要分布于 NAc,嗅球与 Calleja 岛,同时在 CPu 也 有一定的表达。 多巴胺受体与毒品诱导的基因表达调控 阿片类、可卡因等毒品通过多巴胺受体影响细胞内信号传导通路,而影响基因的表达,这些基因 表达的变化参与神经元可塑性(neuron plasticity)的形成,并最终导致成瘾后行为学上的改变。 在分子水平上,这种量变到质变是个多步骤过程。①早期反应基因(immediate early gene, IEG) 的诱导表达: 单一毒品注射即可在短时间内诱导早期反应基因表达。fos 与 jun 家族编码早期反 应基因。Fos 家族包括 c-Fos, FosB, Fra-1, Fra-2;Jun 家族包括 c-Jun, JunB 和 JunD。Fos 与 Jun 家族蛋白形成二聚体活化蛋白 1(activator protein-1, AP-1),AP-1 进一步与靶基因调 控区中相应的 AP-1 位点结合, 调节基因的转录。 多巴胺受体参与毒品成瘾性的发生与发展(Xu et al., 1994a; Xu et al., 1994b; Xu et al., 1997; Xu et al., 2000; Carta et al., 2000; Caine et al., 2002)。并且,多巴胺受体通过调控 Fos 家族而参与对毒品成瘾的调节(Graybiel et al, 1990; Nestler 2000)。例如急性可卡因刺激可以通过 D1 多巴胺受体诱导 c-Fos 的表达;给予动 物双侧伏核注射 c-fos 的反义核酸,可降低急性可卡因刺激引起的的自主活动(locomotion)的 增强(Heilig et al, 1993).;应用 D1 多巴胺受体基因敲除小鼠,我们发现在急性可卡因作用下, c-Fos, FosB, Fra-2 和 JunB 在 D1 多巴胺受体基因敲除小鼠中的诱导表达丧失,并且 D1 和 D3 多巴胺受体对 c-fos 起到相反的调节作用。 类似地, 吗啡也可以诱导 NAc 和 Cpu 区 c-fos 和 junB 的表达,并且 D1 多巴胺受体拮抗剂可以抑制这种作用,提示多巴胺受体参与介导阿片类毒品诱 导的早期反应基因的诱导表达(Liu J et al.,1994; Bontempi B et al 1997)。②晚期反应基因 的诱导表达:毒品的长期作用下,并在早期反应基因变化的基础上,机体的基因发生相对长期的 变化。我们应用 D1 多巴胺受体基因敲除小鼠发现慢性可卡因作用下?FosB 的诱导表达丧失,同 时 Gαolf、β-catenin 和 BDNF 的表达也发生了变化,这提示 D1 多巴胺受体在可卡因诱导的基因 表达调控中起关键作用(zhang D et al, 2002)。有趣的是,我们发现 D1 和 D3 多巴胺受体对下

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游的长期诱导靶基因 Neogenin 和 SynaptotagminVII 起到相反的调节作用(Zhang L et al, 2004)。 这些基因的长期变化,参与神经元可塑性的形成,并进一步参与毒品药物后的行为学变化。 MAPK 信号通路在毒品成瘾性中的作用 丝裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinases, MAPKs)是真核细胞介导细胞外信 号到细胞内反应的主要信号传导系统, 由于其对生物系统功能调节具有普遍意义,近年来已成为 细胞内信号传导研究的热点(Pelech,1996; Kyriakis,1996)。哺乳动物细胞至少存在四条 MAPK 信 号 传 导 通 路 , 即 ERK (extracellular-regulated protein kinase) 、 JNK(SAPK)(c-Jun N-terminal kinase or stress-activated protein kinase)、ERK5(BMK1)和 p38 MAPK 通路 (Pelech,1996; Kyriakis,1996; Downey,1998)。近年来,ERK 通路在神经系统中的功能研究引 人注目,该通路参与介导神经元分化、凋亡、神经元突触可塑性及长时程增强(long-term potentiation)等重要的生理、病理反应。并且越来越多的实验提示,ERK 通路在毒品成瘾性的 发生、发展过程中起重要作用。急性可卡因刺激可以激活小鼠 Cpu 区 ERK 激酶,ERK 抑制剂可阻 断可卡因对小鼠的奖赏效应(Valjent et al., 2000);而慢性可卡因刺激导致 VTA 区 ERK 激酶活 性持续增强(Berhow et al., 1996)。应用 D1 与 D3 基因敲除小鼠模型,我们发现可卡因作用下 ERK 激酶在野生型小鼠中呈现时间依赖性的激活,ERK 的活化在 D3 基因敲除小鼠中增强,而在 D1 基因敲除小鼠中丧失, D1 和 D3 多巴胺受体对 ERK 起反向调控作用(Zhang L, et al., 2004)。 即 上述现象提示毒品对 ERK 通路的激活作用可能参与毒品成瘾后机体神经可塑性的长期变化。 毒品成瘾的转录调控机制 基因表达的转录调控在毒品成瘾性的发生发展中起重要的作用。慢性、长期的使用毒品,导致细 胞核功能变化,进而通过影响细胞内信号传导通路而导致某些特定基因转录速率改变。进一步, 这些基因诱发神经元功能活动发生变化, 并使得神经通路功能活动变化,最终导致行为学上复杂 的改变。众多的转录因子参与神经元基因表达的调控,但迄今,有两类转录因子在毒品成瘾性中 的作用研究的较为透彻,即 cAMP 反应元件结合蛋白(cyclic-AMP response element binding protein, CREB)和?FosB。CREB: CREB 的结合序列是 cAMP 反应元件(cAMP response element, CREB: CRE)。CRE 存在于许多基因的调控序列之中,其核心序列为 TGACGTCA。CREB 多种细胞内信号传 导通路的交会点,CREB 可以被 PKA、CaMKIV 及生长因子 Ras 蛋白激酶通路激活,使得其 133 位 丝氨酸磷酸化活化,进而活化的 CREB 与 CRE 结合形成二聚体,激活基因的转录反应( Mayr B et al,2001; Lonze BE et al,2002)。?FosB:?FosB 属于 Fos 家族成员,由 fosB 基因编码,经过 ?FosB 化学修饰,为 FosB 的异构体,分子量在 35-37kDa。在毒品的作用下,在 1-4 小时之内 Fos 家族 成员被迅速激活,主要发生在伏核和尾壳核(caudoputamen),4-12 小时后蛋白恢复基础水平。 相反地,急性毒品刺激仅轻微地升高 ?FosB 的表达量。随着长期、反复地施用毒品,由于 ?FosB 在体内的高度稳定性,?FosB 的含量逐步聚集,并成为主导成分。

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D1 和 D3 多巴胺受体在毒品成瘾性中的作用 D1 受体是体内分布最广泛的受体,而 D3 受体的分布较为局限。D1 与 D3 受体在 NAc 与 Cpu 区共 定位于同一神经元。有趣的是,D1 与 D3 多巴胺受体在毒品成瘾性的发生、发展过程中既有相互 对立的又有相互协调的作用。应用基因敲除动物模型发现, D1 多巴胺受体的敲除可导致小鼠对 急性可卡因的自主活动丧失,而 D3 受体的敲除使小鼠自主活动增强。而基因表达检测发现,D1 与 D3 受体对 NAc 区 P 物质(substance P)的表达起协同调控作用,而对 Calleji 岛 c-fos 基因表 达起反向调控作用。进一步,我们应用 D1 与 D3 基因敲除小鼠模型,对 D1 和 D3 受体在可卡因诱 导的 ERK 信号通路、早期反应基因、晚期反应基因表达中的作用进行了系统研究,发现 D1 与 D3 多巴胺受体对 ERK 通路起反向调控作用,即 D1 受体促进 ERK 的激活而 D3 受体抑制 ERK 的激活, 并且 D1 和 D3 多巴胺受体对早期反应基因 c-fos 的诱导表达也起反向调控作用; 与此相应地,在 可卡因长期作用下晚期反应基因 Neogenin 和 SynaptotagminVII 的表达也在 D1 与 D3 受体基因敲 除模型中呈现出相反的变化。 而这种基因表达的相反性变化模式有可能是其自主活动反向变化的 基础 (Zhang L et al., 2004)。 本实验的整体构思

在上述研究基础上,我们设想阿片类毒品可能通过多巴胺受体信号通路而调控 MAPK 通路, 进而调控早期与晚期靶基因的诱导表达,并进一步参与阿片类毒品成瘾的发生与发展。本研
究拟应用 D1 与 D3 多巴胺受体基因敲除动物模型,总体构思如下:
1、 确定阿片类毒品对 MAPK 信号通路的激活作用及 D1 与 D3 多巴胺受体在阿片诱导的 MAPK 激活中的作用。 2、探讨 D1 与 D3 多巴胺受体对阿片类作用下的早期靶反应基因和晚期靶反应基因的调控

整体构思见下图: 整体构思见下图:
Opiate

多巴胺受体: 多巴胺受体:

receptor D1 receptor / D2 receptor
(—) D3 receptor

MAPK: MAPK:

ERK, JNK, p38

早期反应基因: 早期反应基因:

cCREB, or c-fos

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晚期反应基因: 晚期反应基因:

Target genes

Neuroadaptation
3.本项目的特色和创新之处 (1)在我国,毒品问题主要是海洛因等阿片类(opiate)毒品,因此开展对阿片类毒品成瘾机理的研究,
寻找有效的治疗阿片成瘾的药物, 无疑具有深远的社会意义和巨大的市场前景。 阿片类药物成瘾的核心问 题是长期使用阿片类药物后, 中枢神经系统产生可塑性变化, 而这种可塑性变化的基础是基因和分子水平 的变化。本研究以阿片成瘾为研究模型,可进一步在分子水平上阐明阿片成瘾的发生机制,为该

领域的基础研究和临床治疗提供新的理论和方法,具有重要的理论与实践意义。 (2)吗啡是阿片的主要活性成分,有着强大的药理学活性和极强的成瘾性。其药理活性极其诱 人,而其成瘾性又限制了其临床应用。半个多世纪来,人们一直试图合成新的阿片类化合物,希 望能保留吗啡强大的镇痛作用,同时没有成瘾性。然而时至今日,这一设想尚未成功。因此人们 从成瘾的生物学角度出发, 探讨吗啡成瘾的神经生物学机制,为最终解决阿片类毒品成瘾提供新 的思路。 (3)激活多巴胺系统是包括鸦片类、可卡因在内的多种毒品成瘾性的共同神经生物学特点。但 以往关于多巴胺受体在毒品成瘾性的分子机制多集中在可卡因类的研究上, 而对于多巴胺受体 在阿片类药物中分子调控机制,尚不明了。故本研究针对多巴胺受体,研究其对阿片类诱导的细 胞内信号传导通路和基因表达的调控作用,为该领域补充材料 (4)D1 受体是体内分布最广泛的受体,而 D3 受体的分布较为局限。D1 与 D3 多巴胺受体在毒品 成瘾性的发生、发展过程中既有相互对立的又有相互协调的作用。但关于 D1 和 D3 多巴胺受体 在阿片成瘾中起何作用,如何发挥作用,尚不明了。本研究系统地探讨 D1 和 D3 多巴胺受体对 阿片类药物诱导的基因表达变化,可以填补这一空白。 (5) 传统地研究受体的功能是应用受体的拮抗剂与激活剂,但由于拮抗剂与激活剂缺乏特异性, 对于研究受体功能是一缺陷。本研究应用 D1 和 D3 基因敲除小鼠模型,特异地针对某一特定的 受体,特异性强,克服了传统方法的局限,可以提供更切实可靠的结果。 (6)MAPK 传导通路是当今世界上的研究热点。探讨 MAPK 通路在药物依赖中作用的研究才刚刚 起步。本研究系统地探讨阿片类对 MAPK 通路的影响,对于揭示 MAPK 和阿片依赖具有指导意 义。

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9

gene expression. J Neurochem, 2002; 82:1453-1464. Zhang L, Lou DW, Jiao HY, Zhang D, Wang X, Xia Y, Zhang J, Xu M. Cocaine-induced intracellular signaling and gene expression are oppositely regulated by the dopamine D1 and D3 receptors. 2004. J Neuroscience;24(13):3344-3354 Zhang D, Zhang L, Tang Y, Lou D, Sharp FR, Zhang J and Xu M.Gene expression changes induced by repeated cocaine administration through the dopamine D1 receptors. Neuropsycopharmacology. (in press)

三、研究方案

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1. 研究目标、研究内容和拟解决的关键问题 研究目标

通过本研究,查明阿片类药物作用下,不同亚型多巴胺受体 (D1 和 D3 多巴胺受体)对细胞内 MAPK 信号传导通路及早期反应基因、晚期反应基因表达的调控作用,从而从分子水平上阐明 阿片成瘾的发生机制,为该领域的基础研究和临床治疗提供新的理论和方法。 研究内容 为完成上述研究目标,即查明阿片类药物作用下不同亚型多巴胺受体(D1 和 D3 多巴胺受体)对细 胞内 MAPK 信号传导通路及早期反应基因、晚期反应基因表达的调控作用,本研究拟应用 D1 和 D3 多巴胺受体基因敲除小鼠,运用分子生物学、细胞生物学、免疫组织化学等多种方法研究以 下内容: 1.建立急性吗啡刺激模型,探讨急性吗啡刺激对 MAPK 信号通路的激活作用研究。 2. 应用 D1 与 D3 多巴胺受体基因敲除小鼠, 探讨多巴胺受体在吗啡诱导的 MAPK 激活中的作用 (反 向调控或协同调控) 3.应用 D1 与 D3 多巴胺受体基因敲除小鼠,探讨 D1 与 D3 多巴胺受体对吗啡作用下的早期反应 基因的调控作用; 4.应用 D1 与 D3 多巴胺受体基因敲除小鼠,探讨 D1 与 D3 多巴胺受体对长期吗啡作用下的晚期 反应基因的调控。 拟解决的关键问题 1.急性、慢性吗啡动物模型的建立 目前,我们已经掌握多种成瘾药物动物模型的建立方法。 2.D1 和 D3 多巴胺基因敲除小鼠的构建与鉴定 D1 和 D3 多巴胺基因敲除小鼠的构建与鉴定见 Xu M et al., 1994,1997。D1 和 D3 多巴胺受体基因 敲除小鼠由 University of Cincinnati Dr. Xu M 提供。 3.MAPK 激酶活性测定及早期反应基因的检测。 各种有关的方法我们已经掌握,见 Zhang L et al., 2004; Zhang D et al., 2002。 4.晚期反应基因的筛选鉴定: Microarray 分析、Real-time PCR、免疫组织化学检测
相关的实验方法我们已经掌握,参见 Zhang L et al., 2004(a); Zhang L et al., 2004(b); Zhang D et al., 2002。

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2. 拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析 (一)D1 与 D3 多巴胺受体基因敲除小鼠

D1 与 D3 多巴胺受体基因敲除小鼠模型的构建与鉴定参见 Xu M et al., 1994; 1997。D1 基因敲 除小鼠在可卡因作用下自主活动明显降低,而 D3 受体的基因敲除使小鼠自主活动增强,呈现相 反的趋势。D1、 D3 基因敲除小鼠构建策略图分别见 A 和 B。

B

D1 与 D3 动物模型由 University of Cincinnati, Dr. Ming Xu (二)吗啡对 MAPK 通路激活作用的研究 1.急性吗啡刺激动物模型的建立

提供。

取 8 周龄的成年小鼠,体重 18-22g。动物房恒温恒湿,12 小时昼夜节律控制(8:00-20:00)。腹腔 注射盐酸吗啡,于注射后不同时间采用断颈法处死小鼠,并分离提取相应的脑组织。 2.急性吗啡刺激对 MAPK 不同亚型激活的时间曲线 本研究拟首先观察吗啡对 MAPK 通路的激活状况,即何种亚型被激活,激活特性如何,观察以下 指标:

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(1). ERK 的磷酸化活性曲线: a. Phos-ERK1/2 活性测定: b. Western blot 对 ERK1/ERK2 蛋白进行定量:

(2). JNK 的磷酸化活性曲线:测定方法类似上述 ERK, 一抗分别为 phos-JNK 和 JNK。 (3). P38 的磷酸化活性曲线:测定方法类似上述 ERK, 一抗分别为 phos-p38 和 p38。 (三)D1 与 D3 多巴胺受体在吗啡诱导的 MAPK 激活中的作用研究 1.D1 类受体和 D2 类受体激动剂对 MAPK 的激活作用 我们先前的研究表明,在 D1 类和 D2 类多巴胺受体激动剂的联合作用下, D3 多巴胺受体的基 因敲除可以导致小鼠自主活动增强,而单纯的 D1 类或 D2 类多巴胺受体激动剂作用下,D3 多巴 胺受体基因敲除小鼠无自主活动增强现象,这提示 D3 多巴胺受体通过抑制 D1 多巴胺受体功能 而影响动物的行为学。为了从分子水平上探讨 D3 多巴胺受体对 ERK 的调控作用,我们应用 D1 类和 D2 类受体激动剂研究其对 ERK 的活化作用。 取野生型、 基因敲除和 D3 基因敲除小鼠(每 D1 组 4 只),分别进行以下实验: (1)D1 类多巴胺受体激动剂 SKF81297 腹腔注射,分离 Cpu 检测 ERK 活性 (2)D2 类多巴胺受体激动剂 PD128907,腹腔注射,分离 Cpu 检测 ERK 活性 (3)D1+D2 类多巴胺受体激动剂 SKF81297+PD128907,联合腹腔注射,分离 Cpu 检测 ERK 磷酸 化活性 2.进一步,我们拟应用 D1 和 D3 多巴胺受体基因突变模型研究急性吗啡在 D1 和 D3 基因突变模 型中对 MAPK 不同亚型激活的时间曲线 (1). ERK 的磷酸化活性曲线: (2). JNK 的磷酸化活性曲线: (3). P38 的磷酸化活性曲线:

多巴胺受体对阿片类作用下的早期反应基因的调控作用; (四)D1 与 D3 多巴胺受体对阿片类作用下的早期反应基因的调控作用; 1.急性吗啡在野生型(wild-type, WT),D1 和 D3 基因突变(D1, D3 knock-out, ko)模型中对早 期反应基因 c-fos 和 creb 诱导表达的检测(每组 5 只小鼠) (1). c-Fos 基因诱导表达:、 a. Western blot: b. 免疫组织化学(Immunohistochemistry):

(2). CREB 的磷酸化活性 a. CREB 的磷酸化活性时间曲线: b. 比较 CREB 在不同基因型中的激活:

2.MAPK 通路对早期反应基因作用的特异性研究 应用 MAPK 通路的特异性抑制剂,观察其对早期反应基因的诱导表达的调控作用,即多巴胺受体 介导的早期反应基因的变化,是否通过 MAPK 通路传导。 a. ERK 通路抑制剂 SL327: b. JNK 通路抑制剂 PD600125:参见 Zhang L, EMBO J,2003 c. p38 通路抑制剂:参见 Zhang L, Chinese Medical Journal.2000, 113(4):354-357

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(五)D1 与 D3 多巴胺受体对阿片类作用下的晚期反应基因的调控 (1). Microarray 筛选下游靶基因 吗啡长期作用下,机体基因表达发生变化,这些基因表达的变化参与神经元可塑性(neuron plasticity)的形成,并最终导致成瘾后行为学上的改变。Microarray 的出现和迅速发展为研究 基因表达模式提供了一个有力的工具。本研究拟应用 Microarray 筛选吗啡作用下机体长期变化 基因,具体实验包括: a. 吗啡慢性刺激实验:野生型、D1 和 D3 基因敲除小鼠野生型于第一天和第三天皮下移植吗啡 片剂,然后于第六天断颈处死动物,提取相应组织。该慢性刺激模型可以导致小鼠出现明显的依 赖、耐受和截断症状。 b.RNA 分离及 Microarray 分析:参照 Zhang L et al, 2004 方法, (2). 下游靶基因的鉴定 a. Real-time PCR:参照 Zhang L et al, 2004 方法, b. Western blot:对靶基因进行 Western blot 检测,具体方法参考 Zhang L et al., 2004 c. 免疫组织化学:对靶基因进行免疫组织化学 检测,具体方法参考 Zhang L et al., 2004 整体实验流程如下: 整体实验流程如下:
急性吗啡动物模型的建立 Opiate

慢性吗啡动物模型的建立 慢性吗啡动物模型的建立 D1 多巴胺受体基因敲除模型
D3 多巴胺受体基因敲除模型

? D1 receptor / D2 receptor
(—)

激酶活性测定: MAPK 激酶活性测定: ERK 激酶活性测定 JNK 激酶活性测定 P38 激酶活性测定 D1 类和 D2 类多巴胺受体激动剂对 MAPK 的激活 早期反应基因: 早期反应基因: c-fos 诱导表达检测 CREB 磷酸化活性检测 MAPK 抑制剂对 c-fos 和 CREB 表达的影响 晚期反应基因: 晚期反应基因: Microarray 筛选 Real-time PCR 鉴定

?? ERK, JNK, p38

?

D3 receptor

?

cCREB, or c-fos

? ? ?
Target genes

? Neuroadaptation

Western blot 鉴定 免疫组织化学鉴定

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3. 年 度 研 究 计 划 及 预 期 进 展

全部实验分两年完成:2006 年 1 月-2007 年 12 月 2006.1-2006.12 吗啡对 MAPK 信号通路的激活作用研究及 D1 与 D3 多巴胺受体对吗啡作用下的早 期反应基因的调控作用(反向调控或协同调控)
1.MAPK 激酶活性测定(野生型、D1 与 D3 多巴胺受体基因敲除小鼠)

ERK 激酶活性测定

JNK 激酶活性测定 P38 激酶活性测定
2.D1 类和 D2 类多巴胺受体激动剂对 MAPK 的激活 3.c-fos 诱导表达检测 4.CREB 磷酸化活性检测 5.MAPK 抑制剂对 c-fos 和 CREB 表达的影响 2007.1-2007.12 D1 与 D3 多巴胺受体对鸦片类作用下的晚期反应基因的调控。
1.Microarray 筛选 2.Real-time PCR 鉴定

3.Western blot 鉴定 4.免疫组织化学鉴定
5.MAPK 抑制剂对晚期反应基因表达的影响 6.撰写论文,总结整理,申报成果 预期成果 1、确定急性吗啡刺激对 MAPK 信号通路的激活作用。 2、查明多巴胺受体在吗啡诱导的 MAPK 激活中的作用(反向调控或协同调控)。 3、查明 D1 与 D3 多巴胺受体对吗啡作用下的早期反应基因的调控作用。 4、查明 D1 与 D3 多巴胺受体对长期吗啡作用下的晚期反应基因的调控。 5、在国外相关杂志发表论文 1-2 篇,国内权威杂志发表论文 4-5 篇。 6、本 项 研 究 的 开 展 和 完 成 ,将 进一步在分子水平上阐明阿片类毒品成瘾的发生机制,为该领 域的基础研究和临床治疗提供新的理论和方法,为 临 床 开 发 戒 毒 新 药 提 供 新 的 思 路 。

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四、研究条件与基础
1. 已取得的研究工作成绩及与本项目有关的研究工作积累(对于自由申请项目,请着重 填写申请人近期的主要工作业绩;对于重点项目,请着重填写本课题组与本项目相关的研 究工作积累和近五年的主要研究业绩)

研究工作基础之一 申请者在美国 University of Cincinnati 三年从事药物成瘾的分子调控机制研究,构建了 c-fos 细胞特 异性的基因敲除小鼠,并运用基因敲除小鼠模型系统地研究了可卡因作用下,MAPK 信号通路和基因 表达调控的变化,对于药物成瘾研究,申请者具有扎实的理论与实践功底。主要研究工作包括: (1)世界上首次构建并鉴定了 c-fos 基因细胞特异性(D1 多巴胺受体神经元)的基因敲除小鼠 (2)运用 c-fos 基因细胞特异性的基因敲除小鼠,系统地研究了可卡因作用下 c-fos 基因对 AP-1 家 族网络,小鼠行为学、电生理学、晚期反应基因、神经元形态学等功能的影响。该工作总结已送投 Nature Neuroscience。 (3) 运用 D1 和 D3 多巴胺受体基因敲除小鼠模型系统地探讨了可卡因作用下细胞信号传导通路、 基 因表达的变化。该工作已发表在 J Neuroscience, 2004,24(13) (4)运用 Microarray 系统地研究了可卡因长期作用下,机体长期基因表达的改变。相关工作总结已 发表在 Neuropsycopharmacology.2005,Mar 16:1-12 (5) 运用 D1 多巴胺受体基因敲除小鼠, 系统地研究了 D1 多巴胺受体对可卡因诱导的基因表达的变 化。该工作已发表在 J Neurochemistry,2002, 82:1453-1464 研究工作基础之二: 研究工作基础之二: 申请者曾对 MAPK 信号通路在热损伤诱导单核细胞株 Raw264.7 中的调控作用和细胞内定位进行过 比较系统的研究。发表研究论文十余篇,主要工作包括: (1)探讨了 p38 蛋白激酶在热损伤诱导单核细胞株 Raw264.7 中的调控作用,应用 Western blot、 激酶活性测定、流式细胞检测术、透射电镜技术、DNA 凝胶电泳检测 p38 蛋白激酶在热损伤诱导细胞 凋亡中的作用。发现 p38 蛋白激酶激活是热损伤诱导细胞凋亡所必需的,即 p38 参与介导热损伤诱 导的 Raw264.7 细胞凋亡。 (2)应用细胞基因转染技术将 p38 及其上游激酶不同的诱变体转染细胞,结果显示 p38 无活性诱变 体可抑制细胞凋亡;而 MKK6b(E)活性诱变体可导致细胞凋亡,进一步证明了 p38 参与介导热损伤诱 导的 Raw264.7 细胞凋亡。 (3) 应用 Western blot、 激酶活性测定等检测 LPS 诱导下心肌细胞 p38 激酶激活的量效与时相变化。 (4)应用免疫光镜、电镜及激光扫描共聚焦显微镜检测在外界因素作用下(LPS),p38 激酶在不同细 胞系,即心肌细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、Raw264.7 细胞中的定位。 (5)应用免疫光镜、电镜及激光扫描共聚焦显微镜检测 p38 激酶不同亚型(α、β、γ、δ)在细胞中的 定位。

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2 .已 具 备 的 实 验 条 件 ,尚 缺 少 的 实 验 条 件 和 拟 解 决 的 途 径 (包 括 利 用 国 家 重 点 实 验 室 和 部 门开放实验室的计划与落实情况)

1、 申请者所在的实验室为广东省功能蛋白质组学重点实验室,包括细胞培养室、分子生物学实 验室、免疫学实验室等,具备良好硬件装备,主要包括:
? PCR 仪 (PE9600 和 Minicycler) ? 电泳仪 ? 多功能电泳系统(Phamacia) ? 凝胶图象分析系统(UBI) ? 倒置显微镜(Olympus) ? CO2 孵箱 2(Heraeus) ? 高速离心机(Beckman) ? 高速低温离心机(Hettich) ? J25 立式高速低温离心机(Beckman) ? 台式离心机(Beckman) ? ACTA FPLC 蛋白纯化系统(Phamacia) ? 紫外分光光度计(SHIMADZU) ? 酶标仪(Dynatech) ? 全自动液氮存储系统(Col-parmer) ? -70 低温冰箱(NUAIRE) ? 制冰机(Sanyo) ? 细胞内显微注射系统(Narishige) ? 电穿孔仪(Gibco/BRL) ? 高温高压自动灭菌器(Sanyo) ? 水浴摇床 ? 真空泵 ? 583 真空干胶系统(BioRad) ? 荧光显微镜(Olympus) ? 显微荧光摄象/照相系统(Nikon) ? 红细胞跟踪相关仪 1 台(IPM,USA) ? 显微测量仪 ? 显微摄象系统 ? 微量移液器(p20、p200、p1000) ? DNA 序列分析系统(DNA Star) ? ABI310 全自动 DNA 测序仪(美国 Perkin-Elmer) ? 超声粉碎系统(Col-parmer) ? 核酸杂交箱(Col-parmer)

2、申请者与美国学术和医疗机构保持着良好的交流协作和信息互换,在美国工作过的 Dr. Ming Xu 实验室拥有多种基因敲除动物模型及相关载体,并愿意无偿提供,上述资源的利用将加速本 研究的进展。 3、 申请者目前所在的广东省功能蛋白质组学重点实验室关于 MAPK 信号传导通路的研究工作有较 好的工作基础。有关激酶活性测定、Northern 杂交、Western 杂交及细胞基因转染等各种实验方 法已经建立,动物模型的复制亦已经建立。 4、南方医科大学动物所为华南地区实验动物中心,提供有关的实验动物保障。 5、南方医科大学图书馆拥有一系列与本专业密切相关的国内外核心医学期刊和完善的网络医学 资料库。因此,本项目所需的图书资料有充足的保证。

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五、经费预算
项 合计: 1、科研业务费合计 (1)实验用动植物的购置、种植和养殖费 (2)计算、测试、分析费 (3)国内调研和学术会议费 (4)业务资料、报告、论文印刷费 (5)临时用工劳务费 (6)其他 2、实验材料费合计 (1)原材料、试剂、药品等消耗性物品购置费 (2)标本、样品采集加工费 (3)运杂包装费 (4)其他 3、仪器设备购置费合计 (1)专用仪器设备的购置费 (2)运杂包装费 (3)安装费 (4)自制专用仪器设备的材料、配件和外协 加工费 (5)其他 4、实验室改装费 5、协作费 6、管理费 7、生活补贴费 0.5 0.5 0.5 0.5 1.0 2.0 1.0 0.5 0.5 目 金 万元) 额(万元 万元 6.0 . 2.0 1.0 0.5 0.3 0.1 0.1 备 注

注:开支范围详见《广东省自然科学基金资助项目财务管理办法》.

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六、以往基金课题完成情况
对 申 请 者 负 责 的 前 一 个 已 结 题 广 东 省 自 然 科 学 基 金 资 助 项 目 (项 目 名 称 及 顺 序 号 )完 成 情 况 、 后 续研究进展及与本申请项目的关系加以详细说明。 附该已结题项目已发表主要相关论文首页复印 另 件 (限 三 篇 )。

2001.1~2002.12 负责广东省自然科学基金“p38 在 TNF 诱导微血管内皮细胞骨架重构的作用及
其分子机制”。总资助金额为 5 万元,已完成 主要成果: (1) 确定 TNF 对微血管内皮细胞骨架的重构作用。 (2) 阐明 TNF 对微血管内皮细胞不同 p38 MAPK 亚型的激活作用; (3) 建立 TNF 通过激活 p38 MAPK 引起细胞骨架重构的信号调控路线; (4) 发表研究论文 2 篇。

达到目标: 通过本项研究,确立 TNF 对内皮细胞骨架的影响,查明 p38 MPAK 在 TNF 诱导的细胞骨架重 构的作用。建立内皮细胞对 TNF 反应引起内皮细胞通透性增加的信号转导路线,从而为从分子 水平上阐明 MAPK 信号传导通路参与调控血管内皮细胞骨架重构的作用及其分子机制提供理论基 础,并为炎症、烧伤、休克等病理过程中血浆外渗和细胞迁移的防治提供理论基础和新的途径。

与本申请项目关系: 本研究针对我国尤其是广东地区日益严重的社会问题——吸毒,进行机理的揭示性研究,并 为该领域的临床治疗提供新的理论和方法。 本研究继续侧重于 MAPK 信号传导通路功能的研究, 尽管疾病模型不同,但有相通之处。前一个广东省基金项目的完成为本研究在实验技术、理论和 基金管理上提供了良好的基础。

七、申请者承诺
我保证上述填报内容的真实性。如果获得资助,我与本项目组成员将严格遵守广东省自然科学 基金委员会的有关规定,切实保证研究工作时间,按计划认真开展研究工作,按时报送有关材 料。 申请者(签章) 年 月 日

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八、申请者所在单位及合作单位的审查与保证
1. 合 作 单 位 的 审 查 意 见 与 保 证 本 单 位 同 意 参 加 合 作 研 究 ,保 证 对 参 加 合 作 研 究 人 员 给 予 时 间 及 工 作 条 件 的 支 持 、督 促 其 按 计 划完成所承担的任务。以下为需要说明的其它问题:

合 作 单 位 1 (公 章 )

合 作 单 位 2 (公 章 )

合 作 单 位 3 (公 章 )

2. 申 请 者 所 在 单 位 领 导 的 审 查 意 见 与 保 证 已 对 申 请 书 内 容 进 行 了 审 核 ,申 请 书 填 报 内 容 属 实 并 保 证 在 项 目 获 得 资 助 后 做 到 以 下 几 点 : (1 )保 证 对 研 究 计 划 实 施 所 需 的 人 力 、 物 力 和 工 作 时 间 等 条 件 给 予 支 持 ; (2 )严 格 遵 守 广 东 省 自 然 科 学 基 金 管 理 委 员 会 有 关 资 助 项 目 管 理 和 财 务 管 理 的 各 项 规 定 ; (3 )督 促 项 目 负 责 人 和 本 单 位 科 研 管 理 部 门 按 广 东 省 自 然 科 学 基 金 管 理 委 员 会 的 规 定 及 时 报 送 有关报表和材料。 需要说明的其它问题:

单 位 负 责 人 (签 章 )

单 位 (公 章 )







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