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RNA干扰技术在生物医药发展的意义与前景


RNA 干扰技术在生物医药发展的意义与前景 摘要:RNAi 干扰技术是今年来发现的一种新的生物技术,其基本原理是 siRNA 可以特异性地降解与其同源的 mRNA,使靶基因的表达沉默。这种技术在功能基因组 学、基因治疗以及神经性疾病的治疗发面,有着巨大的潜力。但是,RNAi 技术还存在 着 siRNA 有效导入、如何最大程度的发挥其降解作用等问题。 关键词:RNAi 1、 概述 RNA 干扰(RNA interference,RNAi)是指通过内源性或外源性双链 RNA(double strand RNA,dsRNA)的介导,特异性降解相应序列的 mRNA,导致靶基因的表达沉 默,产生相应的功能型缺失的现象,属于转录后水平的基因沉默(post transcript gene silencing,PTGS)。这种机制广泛存在于微生物、植物、动物基因序列特异性转录后的 基因沉默,在生物体进化过程中,是一种抵御病毒感染及由于重复序列和突变引起的 基因组不稳定性的保护机制。 2、 RNAi 的发现 1990 年,Napoli 等人将由强启动子控制的色素基因导入矮牵牛,以加深花的紫 色,结果许多花瓣颜色并未加深,反而呈现杂色甚至白色。进一步分析发现,这个色 素基因和矮牵牛自身与其同源的色素合成基因均没有表达。当时,将这个现象称为共 抑制[1]。 1994 年,Cogori 等把类胡萝卜素合成基因导入粗糙红色链孢霉菌后,发现 30%的 转化体霉菌自身的基因失活,他们将真菌上得这种现象称为压抑作用(Quelling)。 1995 年 Su Guo 等在利用反义 RNA 技术研究秀丽新小杆线虫(C.elegans)的 part-1 基因功能时发现,正义 RNA 和反义 RNA 都可以抑制基因的功能。这一现象直到 1998 年才被阐述,Andrew Fire 和 Craig C.Mello 研究证明,在正义 RNA 阻断基因表达的试 验中,真正起作用的是双链 RNA,而这些双链 RNA 是体外转录正义 RNA 时生成的, 将这一现象称为 RNA 干扰。由于发现了 RNA 干扰的机制,2006 年,这二人一起获得 了诺贝尔生理奖[2]。 siRNA Dicer 酶 功能基因组学

最初普遍认为共抑制、基因压制以及 RNAi 是机制完全不同的基因抑制现象。但 经过科研人员的不断研究,发现在共抑制、真菌中的基因压制以及 RNAi 现象之间存 在着密切的联系。都是由 RNA 引起的转录后的基因沉默,可能有共同的生物学意义和 相似的作用机制。但是共抑制与 RNAi 并不是完全相同,在植物的共抑制中,dsRNA 不仅能引起转录后的基因沉默,而且还能引起转录水平的沉默,其可能机制是 dsRNA 能引起染色质的重组或甲基化而改变其内源基因的序列。因此,在植物共抑制中还存 在 RNAi 以外的由 RNA 指导的 DNA 甲基化,而引起转录水平抑制的机制。dsRNA 能 特异地抑制目的基因的表达,其广泛存在各种有机体中,包括线虫、果蝇、涡虫、水 螅、锥虫、真菌、植物以及哺乳动物。 3、 RNAi 的作用机制 RNAi 存在两种分子机制:siRNA(small Interference RNA)途径和 miRNA (micro RNA)途径。 3.1 siRNA 途径 siRNA 途径是由外源导入、转基因或者病毒感染等方式引入的 dsRNA 引发的。当 dsRNA 导入细胞后,被一种 dsRNA 特异的 RNAseⅢ型酶 Dicer 识别,切割成 21~23 nt 的小干扰 RNA(siRNA),这些片段可与该核酸酶的 dsRNA 结合结构域结合,并且作为 模板识别目的 mRNA。识别之后,原先 dsRNA 中的有义链被 mRNA 代替,从酶 dsRNA 复合物中释放出来,而 mRNA 则处于原先的有义链的位置。核酸酶在同样位置 对 mRNA 进行切割,这样又产生了 21~23nt 的 siRNA,与 Dicer 形成复合物即 RNA 诱 导的沉默复合物,继而该复合物特异性地对目的 mRNA 进行切割,从而使目的基因沉 默,产生 RNAi 现象[3]。这种不断放大的作用形成大量新的 siRNA 使 RNAi 作用在短时 间内达到迅速并有效地抑制 mRNA 翻译形成蛋白质或多肤,从而有效地沉默了靶向基 因。 3.2 miRNA 途径 miRNA 广泛存在于真核生物中,是长度为 22 nt 左右的非蛋白编码的调控小 RNA 家族,由 Dicer 酶切割内源性表达的短发夹结构 RNA(hairpin RNA,hpRNA)形成。 miRNA 来源于 70 bp 具有发夹结构的 RNA 前体(pre-miRNA)。其可能的形成及作用机 制为:先由长的内源性转录本(pri-miRNA)生成 70 nt 左右的 miRNA 前体,然后在 Dicer 酶的作用下使其加工成为一个不稳定的 dsRNA 分子,接着迅速被降解剪切为

22nt 左右的单链 RNA,进而形成成熟的 miRNA,之后被 PPD 蛋白家族识别,形成 RNA—蛋白质复合体,即 miRNA 核蛋白体(miRNP)。miRNA 识别并与靶标基因 3 UTR 区部分配对,从而抑制靶标基因的翻译 。miRNA 同样可以与蛋白因子形成 RISC 蛋白 复合物,结合并切割特异的 mRNA 而引发 RNA 沉默。尽管引发沉默的来源不同,但 siRNA 和 miRNA 都参与构成结构相似的 RISC,在作用方式上二者有很大相似性[4]。 4、 RNAi 在生物医药方面的研究现状

4.1 在基因功能组学中的研究 在功能基因组研究中,需要对特定基因进行处理,使其功能丧失或降低突变,以 确定其功能。由于 RNAi 具有高度的序列专一性,可以特异性使特定基因沉默,获得 功能丧失或降低突变,因此 RNAi 可以作为一种强有力的研究工具,用于功能基因组 的研究。将功能位置的基因的编码区(外显子)或启动子区,以反向重复的方式由同 一启动子控制表达。这样的转基因个体内转录出的 RNA 可形成 dsRNA,产生 RNA 干 涉,使目的基因沉默,从而进一步研究目的基因的功能[5]。 4.2 在基因治疗中的应用 RNAi 作用的高度特异性有可能特异地抑制致病的突变等位基因,但又不影响正常 的等位基因,因此被应用到某些疾病的基因治疗。 4.2.1 治疗人类免疫缺陷性病毒 人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV),顾名思义它会造成 人类免疫系统的缺陷。1981 年,人类免疫缺陷病毒在美国首次发现。它是一种感染人 类免疫系统细胞的慢病毒,属反转录病毒的一种。至今无有效疗法的致命性传染病。 该病毒破坏人体的免疫能力,导致免疫系统的失去抵抗力,而导致各种疾病及癌症得 以在人体内生存,发展到最后,导致获得性免疫缺陷综合症,即艾滋病。因而,将 RNAi 技术应用到 HIV 治疗是顺理成章的事[6]。 HIV 作为引起人类免疫缺陷的病毒,其侵入机体的过程是极其复杂的,HIV 侵入 机体细胞后,便可和体细胞结合在一起,终生无法去除。所以,治疗艾滋病的出发 点,就是直接阻断 HIV 侵入人体的途径。CCR-5 是 HIV 侵入机体时的一种重要的辅助 受体,科学家设计合成的一种 lenti 病毒载体,引入与 CCR-5 同源的 siRNA,激发

RNAi 抑制了受体 CCR-5 进入人体外周T淋巴细胞,进而阻断了 HIV 的侵入。由此使 治疗 HIV 病毒感染性疾病的可行性大大增加[7]。 4.2.2 治疗肝炎病毒感染 2003 年,美国科学加 Lieberman J 成功的利用 RNAi 技术治愈了实验鼠的肝炎。他 们的干扰目标是“凋亡相关蛋白质 Fas 基因”。Fas 基因存在于肝细胞表面,它能够启 动细胞的自杀程序。迄今认为,许多肝病是由于病毒、免疫系统失常或慢性酒精中毒 激活了 Fas 基因所导致的。Lieberman J 等给实验鼠尾部静脉注入 siRNA 以“沉默”Fas 基因,发现有 90%肝细胞接受到了这种 RNA 分子,而 Fas 蛋白质的含量变为原来的 10%。与此相反,未接受 RNAi 治疗的小鼠有 40%在 3d 内死亡。而 40 只接受过治疗的 小鼠有 33 只存活,存活率为 82.5%。10d 后检查这些小鼠的肝部,发现都完全正常。 因而,运用 RNAi 技术可以为治疗肝炎开创新的道路[8]。 但是,研究者指出,这种运送 siRNA 方法不能用于人,因为人的身体比小鼠大的 多,复杂的多,血液循环系统也很庞大。此外,这种简单的注射方法是不能使用于人 类。科学家正在研究用更温和的途径将 siRNA 运送到细胞中。如果解决了将 siRNA 有 效又充足的运送到细胞内的问题,将为许多感染性疾病提供新的方法。 4.2.3 治疗肿瘤 肿瘤是由多个基因相互作用的网络调控异常的结果,传统技术诱发的单个癌基因 阻断不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长,而 RNAi 可以利用同一基因家族的多个基因 具有一段很高的保守序列这一特性,设计针对这一序列的 dsRNA 分子,只导入一种 dsRNA 就可以使多个基因同时沉默。多种癌基因可以作为靶点设计相对应的 siRNA。 Kras 基因在肿瘤细胞生长以及血管生成等过程的信号传导通路中起着重要调控作 用,这种基因就像体内一个“开关”,正常的 Kras 基因可抑制肿瘤细胞生长,而一旦 发生突变,它就会持续刺激细胞生长,打乱生长规律,从而导致肿瘤的发生。利用 RNAi 技术,设计使 Kras 突变的基因相对应的 siRNA,可以阻止 Kras 基因的突变,从 而从根本上解决了肿瘤的发生[9]。 4.3 在神经性疾病中的应用 4.3.1 慢性疼痛中的应用

慢性疼痛是指持续一个月以上的疼痛,它的发作给患者带来的痛楚,会使人出现 睡眠紊乱、食欲缺乏、精神崩溃甚至人格扭曲和家居不宁等后果,致使不少病人因无 法忍受长期的疼痛折磨而选择自杀。对老年人的生活和生命质量产生严重影响。因而 有人把慢性疼痛比喻为一种不死的癌症。目前,中国至少有一亿以上的慢性疼痛患者
[10]

。 对于慢性疼痛的治疗,可以从抑制引发疼痛的因素出发。RNAi 是一种有潜力的新

方法 ,可以通过导入可选择性降解疼痛相关蛋白的 siRNA,从而解除疼痛,而且作为 新的基因敲除手段,可用于发现疼痛通路中的新基因。 疼痛通路中某些异常增高的微 点常常成为 siRNA 的干扰靶点。 2003 年,有人向鞘内注射靶向 P2X3 受体 siRNA,有效降低了机械性痛觉过敏和 触觉超敏。这个结果表明 RNAi 可作为慢性疼痛研究与治疗一条新的途径。RNAi 技术 在疼痛的不同传到水平上都具有用于治疗的潜在有效性和可行性,其高效、高特异性 的特点,将会是疼痛基因治疗的良好办法[11]。 4.3.2 阿尔兹海默病中的应用 阿尔兹海默病,即我们常说的老年痴呆症,是一种原发性神经退行性疾病,目前 已发现它与 4 个基因有关,这些基因突变或多态性会使这种疾病的危险性增加。这 4 个基因分别位于 21、14、1、19 号染色体上,它们是淀粉样前体蛋白基因、早老素基 因、早老素 2 基因和载脂蛋白 E4 基因。研究表明,相关的基因的突变在阿尔兹海默病 的发病机制中占有重要的地位[12]。 RNAi 技术可以通过阻断某些突变基因的表达,达到疾病治疗的目的。用合成的仅 21 个核苷酸组成的 siRNA 分别作用于四种相关蛋白的突变基因,阻断疾病的发生。因 此,通过 RNAi 技术阻断与阿尔兹海默病发病有关的基因的表达,可达到预防和治疗 阿尔兹海默病的目的。这为阿尔兹海默病的治疗找到了一条可能的途径。 5、 RNAi 目前存在的问题 RNAi 干扰虽然已经已有部分进入临床研究,但是 siRNA 的脱靶效应、siRNA 的 导入及 siRNA 的稳定等实际问题一直是 RNAi 临床治疗的最大障碍。 5.1 作用靶点的选择

siRNA 可能会非特异性地作用于非靶向 mRNA 并导致非靶基因的沉默,即脱靶效 应。为了金额能地消除潜在的脱靶效应,在设计 siRNA 序列时,应尽可能的提高对把 基因的特异性。而且有些序列会藏于二级结构或目的 RNA 的折叠区区域,是 siRNA 无 法识别,因此需要反复试验选择合适的靶序列。 5.2 siRNA 的有效导入 目前,siRNA 导入细胞内的效率很低,如何提高细胞社区 siRNA 的能力也是需要 解决的一个大问题。使用 DNA 质粒、逆转录病毒载体、腺病毒载体和脂质体等方法, 可使 siRNA 特异性地与靶细胞结合,提高其在体内的利用率,但是通过病毒载体接到 的 RNAi 对人体具有潜在威胁。 5.3 siRNA 在细胞中稳定性 化学合成 siRNA 在体内不稳定,因其相对分子质量小,容易被肾透析并很快清 楚,也容易被内源性的血浆 RNA 酶讲解,在血浆内半衰期为 50~60min。为使 RNAi 分 子具有稳定性且有效地被细胞吸收,一般需要对 RNAi 分子进行一些化学修饰或是将 其包裹于保护微粒中。能提高稳定性并有利于吸收,并且能降低 RNAi 的毒副作用。 6、 展望 RNAi 干扰是近年来发现的一种古老的、保守的生物途径,是生物体适应外界环 境、调控基因表达、防止外来遗传因子入侵的重要机制,具有重要的剩下武学意义。 RNAi 作为一种细胞水平的基因敲除手段,自 20 实际末被发现以后,其基础研究和应 用迅速成为生命科学中的最热门的研究领域之一。2001 年和 2002 年连续被《Science》 评为自然科学十大突破之一。随着对 RNAi 几只研究的深入和 TNAi 技术的不断完善, RNAi 有望成为功能基因组学、基因治疗及神经性疾病治疗的新方法。但是,RNAi 还 存在着一些问题。目前 siRNA 导入细胞内的效率地下,如何有效的将 siRNA 转移至人 体内成为 RNAi 应用的最大障碍之一。如何有效地发挥其降解相应序列 mRNA 的作 用,也是 RNAi 技术面临的一大障碍。 参考文献:
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